No description available.

No description available.

Η αναζήτηση και επινόηση νέων προσεγγίσεων για την προγεννητική διάγνωση χρωμοσωμικών συνδρόμων, που να συνδυάζουν ταχύτητα, αξιοπιστία και ασφάλεια για την μητέρα και το έμβρυο, είναι πάντοτε επίκαιρη και επιτακτική, ιδιαίτερα στην εποχή μας, όπου η πρόοδος της μοριακής βιολογίας και η αποκρυπτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος, προσφέρουν νέα γνώση και εργαλεία για την προσπάθεια αυτή. Στην παρούσα εργασία τυποποιήθηκε η μεθοδολογία της ποσοτικής φθορίζουσας αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction, QF-PCR) σε συνδυασμό με τη συμβατική PCR για την ανίχνευση ανευπλοειδιών και φύλου σε δείγματα αμνιακών κυττάρων, σε βλαστομερίδια προεμβρύου και κυρίως σε ελεύθερο εμβρυϊκό DNA από την μητρική κυκλοφορία καθώς και σε ούρα της εγκύου, για την καθιέρωση μη επεμβατικής μεθοδολογίας προγεννητικής διάγνωσης. Είναι σαφές από τα αποτελέσματα της παρούσας ερευνητικής εργασίας ότι οι συγκεκριμένες μεθοδολογίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν συμπληρωματικά στο συμβατικό χρωμοσωμικό έλεγχο και παράλληλα να αξιοποιηθούν όσον αφορά την ανάλυση του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα της μητέρας για την ασφαλή διάγνωση του φύλου του εμβρύου στα πρώτα στάδια της κύησης. Επιπλέον, επινοήθηκαν πειράματα προσομοίωσης μητρικού πλάσματος με σκοπό τον προσδιορισμό του ποσοστού του εμβρυϊκού DNA στη μητρική κυκλοφορία σε όλη τη διάρκεια της κύησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στα δείγματα μας το εμβρυϊκό DNA μπορεί να διαχωριστεί από το DNA της μητέρας, ανιχνεύοντας μοναδικά εμβρυϊκά αλληλόμορφα πολυμορφικών περιοχών STR (Short Tandem Repeats) πατρικής προέλευσης με QF-PCR. Αυτά τα αλληλόμορφα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του ποσοστού του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα. Έτσι βρέθηκε ότι σε φυσιολογικές κυήσεις, το εμβρυϊκό DNA είναι της τάξεως του 7% (διακύμανση 0-20%) του ολικού ελεύθερου DNA στη μητρική κυκλοφορία. Με βάση την ανάλυση των μοντέλων προσομοίωσης προσδιορίσθηκε με QF-PCR ο αριθμός των αντιγράφων των εμβρυϊκών χρωμοσωμάτων συγκρίνοντας τις αναλογίες των αλληλομόρφων δεικτών STR στα χρωμοσώματα 21, 18, 13, Χ και Υ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για φυσιολογικά έμβρυα και σε περιπτώσεις όπου το ποσοστό του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα είναι ≥15%, ο λόγος των αναλογιών των αλληλομόρφων δύο δεικτών STR σε διαφορετικά χρωμοσώματα προσεγγίζει τη μονάδα. Η ανάλυση δειγμάτων μητρικού πλάσματος από φυσιολογικές κυήσεις και μετά από εμπλουτισμό τους στο ελεύθερο εμβρυϊκό DNA επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα των μοντέλων προσομοίωσης. Αντίστοιχα μοντέλα προσομοίωσης δειγμάτων πλάσματος εγκύων με τρισωμικά έμβρυα για το χρωμόσωμα 21 έδειξαν ότι ο λόγος της αναλογίας των αλληλομόρφων ενός δείκτη STR σε ένα αυτοσωμικό χρωμόσωμα (π.χ. 18 ή 13) προς την αναλογία των αλληλομόρφων ενός δείκτη STR στο χρωμόσωμα 21, διαφέρει από τη μονάδα και εξαρτάται από την προέλευση, πατρική ή μητρική, του επιπλέον εμβρυϊκού χρωμοσώματος 21 στο δείγμα (0.5 έναντι 1.3 αντιστοίχως). Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν, εφόσον επαληθευθούν σε ικανό αριθμό δειγμάτων να αξιοποιηθούν ως επιπλέον δείκτες προγεννητικού ελέγχου και ενδεχομένως να συμβάλλουν στην τυποποίηση αποτελεσματικής μεθοδολογίας μη επεμβατικής χρωμοσωμικής διάγνωσης. / The quest and devise of new approaches for the prenatal diagnosis of chromosomal syndromes that combine rapid analysis robustness and safety for mother and embryo are always in demand especially in the post-genome era with new tools and methods in our disposition. In the present study, the methodology of quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) has been developed and standardized in conjunction with conventional PCR for the detection of aneuploidies and sex in amniotic cells, blastomeres and most importantly in free fetal DNA isolated from maternal peripheral blood and urine, for the establishment of non-invasive methods of prenatal diagnosis. It has become evident that the methodology we have followed can complement conventional prenatal chromosome analysis and in addition can be exploited for the analysis of fetal DNA in maternal plasma for fetal sex determination at the first stages of gestation. Moreover, simulation experiments have been devised in order to determine the percentage of fetal DNA in maternal circulation throughout pregnancy. Our results showed that free fetal DNA can be distinguished from the mother’s DNA in maternal plasma by identifying unique paternally inherited fetal polymorphisms, such as short tandem repeat (STR) alleles, with QF-PCR. These alleles were used to calculate the percentage of fetal DNA in maternal plasma. Fetal DNA was found to be present on an average of 7% (range 0-20%) of the total free DNA in maternal circulation, in normal pregnancies. QF-PCR analysis was also used to determine the copy number of fetal chromosomes by comparing the allelic ratios for chromosomes 21, 18, 13 X and Y. It appears that in informative cases where free fetal DNA is 15% or more and originates from normal embryos, the value of the allelic ratio of a STR marker on one chromosome divided by the value of the allelic ratio of another STR marker on a different chromosome is equal to 1. Analysis of DNA samples isolated from the plasma of pregnant women bearing normal embryos confirmed the results of the simulation models. Comparison of the above data with new analyses simulating DNA from the plasma of pregnant women carrying trisomic for chromosome 21 embryos have shown that the value of the allelic ratio of a STR marker on an autosomal chromosome (e.g. 18 or 13), divided by the allelic ratio of a STR marker on chromosome 21, is different from 1 and it depends on the origin, paternal or maternal, of the extra copy of chromosome 21 in the embryo, with values of 0.5 in paternal compared to 1.3 in maternal trisomies respectively. These results differentiate between normal and trisomic cases and after further evaluation may provide a new indication marker for prenatal diagnosis. In the long term, they may also provide the basis of a non-invasive procedure for early prenatal chromosomal analysis.

Prenatal assessment of fetal health is routinely offered throughout pregnancy to ensure that the most effective management can be provided to maintain fetal and maternal well-being. Currently, invasive testing is used for definitive diagnosis of fetal aneuploidy, which is associated with a 1% risk of iatrogenic fetal loss. Developing non-invasive prenatal testing (NIPT) is a key area of research and methods to increase the level of cell-free fetal DNA (cffDNA) within the maternal circulation have been discussed to improve accuracy of such tests. In this study, three strategies; co-amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction (COLD-PCR), inverse-PCR and Pippin Prep™ gel electrophoresis, were analysed to identify a novel approach to selectively enrich shorter cffDNA fragments from larger maternal cell-free DNA (cfDNA). The sensitivity of droplet digital PCR (ddPCR) against real-time PCR (qPCR) was compared for fetal sex and RHD genotyping. In addition RHD zygosity testing was carried out for non-maternal samples. Consequently, Pippin Prep™ gel electrophoresis was combined with ddPCR analysis for the NIPD of Down Syndrome (DS) in pseudo-maternal samples. The results revealed that the Pippin Prep™ gel electrophoresis enrichment approach successfully demonstrated 2-fold to 5-fold increases in the cffDNA fraction. However, further optimisation assays of COLD-PCR and inverse-PCR using actual maternal samples were required. The spike experiments for DS detection revealed that with the present assay IV overrepresentation of the chromosome 21 target could be significantly detected for samples with ≥15% ‘cffDNA fraction’. In conjunction with the Pippin Prep™ enrichment method, this would have enabled assessment of all 10 maternal samples. Alternatively, fetal sex and RHD genotyping results determined that ddPCR provides a more sensitive platform compared to qPCR approaches, particularly for samples that express low cffDNA fractions (<2%). The ddPCR platform also proved to be a rapid and accurate system for the determination of RHD zygosity. This study highlights that ddPCR could be used as opposed to qPCR for accurate determination of fetal sex and RHD status. While sequencing approaches currently provide the most sensitive platforms for NIPT of fetal aneuploidy, high costs (>£400) prevent universal application. The combination of cffDNA enrichment with ddPCR analysis could provide a cheaper and more widely available platform for NIPD. However, further large scale validation studies using actual maternal samples are required.

This work presents the results ofour research of cell-free nucleic acids (cfNA). The first part shows changes in methylation patterns of immune response genes promoters that are detectable in plasma during the hemodialysis sessions and also differences in methylation between patients and healthy subjects. Alterations include genes that play their role in the regulation of hematopoiesis and these changes are in close relation with the need of anemia therapy. In the other plasma cfNA study we detected miRNA signatures in patients with acute myeloid leukemia at diagnosis (6 highly abundant miRNAs found) and in remission achieved after standard chemotherapy (trend to n01malization, lower levels ofthese miRNAs). Another part of work presents data from the study of potential non-invasive biomarker of bladder cancer. The amounts of cfDNA in urine are higher in patients than in healthy subjects and there were found 5 down-regulated miRNAs. Simultaneously it was established set of 30 miRNAs that are constantly present in urine supematants independently on sex, age and healthy status of subjects. The last part presents analysis ofcell-free fetal DNA. We analyzed differences between a new quantification method - droplet digital PCR and real-time PCR which is used routinely nowadays. Slightly more precise was...