OBJETIVO: Se ha estudiado el comportamiento cinético de atorvastatina en pollos tras la administración por las vías intravenosa y oral de una dosis de 3 mg/kg de este fármaco hipolipemiante, con el fin de validar la dosis a utilizar en el biomodelo animal utilizado. MÉTODOS: La determinación de atorvastatina en plasma se realizó mediante HPLC con detección ultravioleta, siguiendo el método descrito por Siefert (1999), modificado para atorvastatina. El ajuste a métodos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales se realizó mediante el programa WinNonlin Professional®. El criterio utilizado para determinar cuál era la ecuación que mejor describía la evolución de los datos experimentales en cada caso, fue el Criterio de Información de Akaike (AIC) (Yamaoka et al., 1978). RESULTADOS: Tras la administración intravenosa, atorvastatina se distribuye según un modelo bicompartimental abierto, a diferencia del modelo monocompartimental descrito para la vía oral. Tras la administración intravenosa, la vida media obtenida para el atorvastatina (t1/2λz) fue de 4,85 h con un tiempo medio de residencia (MRT) de 10,69 h. Los volúmenes aparentes de distribución calculados en función del área bajo la curva (Vz) y en estado estacionario (Vss) resultaron ser de 0,60 L/kg y 0,32 L/kg respectivamente, indicando una amplia distribución orgánica. En cuanto al aclaramiento plasmático (Cl), éste alcanzó un valor de 30.99 mL/kg•h. Por vía extravascular, cuando se administró atorvastatina por vía oral, se registraron los siguientes tiempos de vida media: 17,54 h con un valor de MRT de 26,03 horas. CONCLUSIONES: La biodisponibilidad de atorvastatina cuando se administró por vía oral alcanzó un valor de 93.38 %. En el estudio del descenso de los perfiles lipídicos en pollos tratados con atorvastatina, los resultados analíticos de los parámetros lipídicos del plasma en los grupos experimentales dieron como resultado una disminución del 33 % de los niveles de colesterol total en el grupo tratado con atorvastatina respecto al grupo control aterogénico. / OBJETIVE: Pharmacokinetics of atorvastatin was studied following intravenous and oral administration of single doses of 3 mg/kg to chickens. METHODS: Plasma concentrations were determined by HPLC assay with ultraviolet detection following the method described by Siefert et al(1999) modified for atorvastatin. The fitting to compartmental and non compartmental pharmacokinetic methods was carried out by using WinNonlin Professional® computer programmes. The Akaike´s information criterion (AIC) (Yamaoka et al., 1978) was used to select the best equation that defines plasma concentration-time data for each animal. RESULTS: The atorvastatin plasma concentration is distributed by a two compartment open model for intravenous dosing, unlike one-compartment model that could best be described for oral administration. The atorvastatin terminal half-life (t½z) was 4.85 h after intravenous administration, with a mean residence time (MRT) of 10.69 h. The apparent volumes of distribution calculated by the area method (Vz) and at steady-state (Vss) were 0.60 and 0,32 L/kg, respectively, indicating a wide body distribution. Total body clearance was 30.99 mL/kg•h. After extravascular administrations, terminal half-lives was 17.54 h. MRT value obtained was 26.03 h. CONCLUSION: Absolute bioavailability was 93.38 % after atorvastatin oral administration. Pharmacokinetic values obtained in this work confirm the validity of the animal model (chickens fed hypercholesterolemic diets to induce atherosclerosis) and make it suitable for atorvastatin intervention studies. The biodisponibility value near to 100% makes it possible to use its own dosage regimen, avoiding extrapolation from human dosage. We can see as well that the values of serum total cholesterol decrease in 33% in the group treated with atorvastatin versus those fed hypercholesterolemic diets.

"Se ha estudiado el comportamiento cinético de danofloxacino en cabras tras su administración por vía intravenosa(IV) y subcutánea(SC) a dosis de 6 mg/kg, y tras la administración de danofloxacino en solución del polímero P407 al 25%(P407) y en solución del polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2%(P407-CMC) por vía SC a dosis de 18 mg/kg. Las concentraciones plasmáticas se determinaron mediante HPLC con detección fluorimétrica. Los datos concentración-tiempo se analizaron mediante modelos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales. El tiempo de vida media(t1/2λz) de danofloxacino IV fue 2.97±1.78h, con un tiempo medio de residencia(MRT) de 2.18±0.29h. El aclaramiento plasmático(Cl) alcanzó un valor de 0.75±0.10L/kg·h. Por vía extravascular, se registraron los siguientes tiempos de vida media para las formulaciones sin polímero, P407 y P407-CMC: 1.50±0.19, 8.26±1.66 y 4.29±1.59h, con valores de MRT: 4.39±0.29, 4.42±0.48 y 5.44±0.72h, respectivamente. La biodisponibilidad de danofloxacino tras su administración por vía SC alcanzó un valor de 99.55±10.62%, 89.20±26.78% en P407 y 73.04±15.31% en P407-CMC. Se realizó la integración PK-PD utilizando las CMIs publicadas por nuestro grupo de investigación sobre 32 cepas de Staphylococcus aureus. Una dosis de 18mg/kg de danofloxacino podría ser efectiva cuando se administra en la formulación P407 o P407-CMC vía SC, en cabras contra aislados bacterianos con CMI≤0.12µg/mL e incluso para CMI≤0.25µg/mL." / "Pharmacokinetics of danofloxacin was studied following intravenous(IV) and subcutaneous(SC) administration of single dose of 6 mg/kg, and after SC administration with poloxamer 407 gel formulation(P407) and poloxamer 407 + carboxymethylcellulose(P407-CMC) at a dose of 18 mg/kg to healthy lactating goats. Plasma concentrations were determined by HPLC assay with fluorescence detection. The concentration-time data were analyzed by compartmental and noncompartmental pharmacokinetic methods. The danofloxacin terminal half-life(t½λz) was 2.97±1.78h after IV administration, with a mean residence time(MRT) of 2.18±0.29h. Total body clearance(Cl) was 0.75±0.10L/kg·h. After extravascular administrations, the terminal half-lives for danofloxacin SC administration without poloxamer, with P407 and P407-CMC were: 1.50±0.19, 8.26±1.66 and 4.29±1.59h. MRT values obtained were 4.39±0.29, 4.42±0.48 and 5.44±0.72h, respectively. Absolute bioavailability was 99.55±10.62% after danofloxacin SC administration, 89.20±26.78% and 73.04±15.31% with P407 and P407-CMC, respectively. MICs of danofloxacin against different strains of Staphylococcus aureus, previously reported by our researched group, were used in order to compute pharmacodynamic surrogate markers. It is concluded that a 18 mg/kg dose of danofloxacin would be effective in solution of P407 and P407-CMC subcutaneously administration to goats against bacterial isolates with MIC≤0,12µg/mL and even for MIC≤0,25µg/mL. "

El uso de muestras seminales criopreservadas es muy habitual en la reproducción asistida humana y de animales con interés en ganadería, así como en la conservación de razas y especies en peligro de extinción. Sin embargo, la congelación y descongelación de muestras seminales implica alteraciones en la membrana y en el ADN del espermatozoide, procesos de apoptosis y modificaciones asociadas al estrés oxidativo (Polge y Jakobsen, 1959; Pursel y Johnson, 1975; Holt, 2000; Thomson et al. 2009). Los espermatozoides y las células del sistema reproductor masculino presentan sistemas de defensa frente a los radicales libres (Sies, 1993). En este contexto, el glutatión es uno de los antioxidantes más ubicuos e importantes en los sistemas biológicos (Gadea et al., 2005). Sin embargo, en ocasiones tiene lugar una producción excesiva de radicales libres, un detrimento en la capacidad total antioxidante o ambas situaciones a la vez. Esta circunstancia implica un desbalance denominado “estrés oxidativo” (Sies y Cadenas, 1985). La adición de antioxidantes a los medios de congelación y descongelación seminal es una alternativa frente al estrés oxidativo (Agarwal et al, 2013). El objetivo principal de esta Tesis fue evaluar el efecto antioxidante del GSH aplicado al medio de descongelación, sobre muestras seminales procedentes de tres especies de mamíferos con importancia en ganadería (porcina, bovina y caprina). En el primer trabajo (Experiencia 1) se evaluó el efecto de la adición de diferentes concentraciones de GSH (1 mM y 5 mM) al medio de descongelación de semen porcino. Las técnicas aplicadas incluyeron el análisis computarizado de imagen (CASA), citometría de flujo y ensayos de fecundación in vitro. En los resultados se observó una reducción en el número de espermatozoides viables capacitados, el número de espermatozoides con cambios en los grupos sulfhidrilo de sus proteínas de membrana, la producción de ERO y la condensación de la cromatina. Se obtuvo un incremento en el número de ovocitos penetrados y en la proporción de cabezas espermáticas descondensadas. Sin embargo, no se evidenció cambio alguno en los parámetros de movilidad evaluados con CASA. En el segundo trabajo (Experiencia 2), desarrollado en bovino, se realizaron ensayos similares a los de la experiencia 1 y se incluyeron nuevos análisis centrados en el estudio del ADN espermático, mediante las técnicas de TUNEL y SCSA. Además, se evaluaron los resultados de las técnicas de fecundación in vitro y desarrollo embrionario.. La adición de GSH supuso un incremento en el número de espermatozoides viables no capacitados, en el porcentaje de penetración y desarrollo embrionario in vitro. Se obtuvo un descenso en la producción de ERO y la fragmentación del ADN. No se observó mejoría en los parámetros de movilidad (CASA) y de reacción acrosómica. El último trabajo (Experiencia 3) tuvo lugar en caprino y fue diseñado con el objetivo de saber si la presencia de la forma reducida (GSH) y/o oxidadada del glutatión (GSSG) en el medio de descongelación tenía algún efecto sobre la funcionalidad espermática. Los ensayos incluyeron la valoración por CASA y citometría de flujo. La adición de GSH supuso un incremento en la movilidad y viabilidad espermática, el número de espermatozoides viables no capacitados y con membrana acrosomal intacta. Se observó una reducción en la producción de ERO y la condensación de la cromatina. A diferencia de lo ocurrido con GSH, la adición de GSSG no reveló efecto alguno sobre los parámetros seminales evaluados Estos trabajos demuestran que la adición de GSH al medio de descongelación seminal mejora los parámetros seminales y la fertilidad de las muestras. / SUMMARY Sperm cryopreservation is widely used in assisted reproduction procedures in humans and in animals, such us domestic livestock and endangered species. Although being the most effective method for the maintenance of seminal samples on a long term, cryopreservation has negative effect on semen quality and fertility (Aitken et al., 2004), because of the temperature drops and osmotic changes (Polge & Jakobsen, 1959). In addition to changes in the plasma membrane and in DNA of spermatozoa. (Pursel & Johnson, 1975; Holt, 2000). The spermatozoa and other masculine reproductive cells have different defense systems against free radicals, including antioxidant enzymatic and non-enzymatic defenses (Sies, 1993). In some conditions, an excess on the production of free radicals, a diminished antioxidant capacity or both situations can lead to an imbalanced condition called “oxidative stress” (Sies & Cadenas, 1985). Supplementation of antioxidants in the freezing and thawing media is an alternative against oxidative stress (Agarwal et al, 2013) In this sense, glutathione is one of the most ubiquitous and important antioxidants in the biological systems. (Gadea et al., 2005). The main aid of this thesis was to evaluate the antioxidant effect of GSH when added to the thawing solution in seminal samples from three species with importance in livestock. In the first study (Experiment 1) it was evaluated the addition of 3 different concentrations of GSH (1 mM and 5 mM) to the thawing solution of board semen, with an incubation time of 0 and 30 minutes. The techniques used were computer assisted sperm analysis CASA, flow cytometry and in vitro assays. The results obtained support the hypothesis, the presence of GSH had a protective effect in some of the seminal parameters studied. It was observed a reduction in the number of capacitated viable spermatozoa, in the number of sperm with changes in sulfhydryl group content in membrane proteins, in the ERO production as well as the chromatin condensation. An increase on the number of penetrated oocytes and decondensed sperm heads was also noted. Nevertheless, there was no evidence of any change in the motility scores recorded by CASA. The second study (Experiment 2), conducted on bovine, incudes apart from the studies developed on experiment 1 new analysis on sperm DNA, by TUNEL and SCSA techniques. Furthermore, it was evaluated the results of the in vitro techniques and the embryo development in presence of GSH in the thawing solution. The collected data from Experiment 2 showed concordance with the results from Experiment 1. With the addition GSH in the thawing solution, it was observed an increase in non-capacitated viable spermatozoa, in the percentage of penetration and in vitro development. ERO production and DNA fragmentation values were reduced. No changes were observed on sperm motility (CASA) o presence of spontaneous acrosome reaction. The third study (Experiment 3) on caprine, was designed with the propose of knowing if the presence of GSH 1 mM and 5 mM or GSSG 2.5 mM in the thawing media has any effect on sperm motility and sperm functionality. This assay included CASA evaluation and flow cytometry. In this case, the samples were incubated 30 and 60 minutes. The collected results demonstrated and increase on motility and sperm viability, in the number of non- capacitated viable spermatozoa and spermatozoa with acrosome membrane untouched. A reduction on the ERO production and on the condensation of chromatin was also observed. Opposite to GSH, the addition of GSSG did not show any effect on the evaluated seminal parameters independent to the exposure time. These studies demonstrate that the addition of GSH to the thawing media improves seminal parameters and fertility on the samples studied.

Objetivos El objetivo de la presente tesis ha sido estudiar la farmacocinética y la farmacodinamia de la Alfaxalona sola o en asociación con Dexmedetomidina en conejos, conjuntamente con la evaluación de la calidad de la sedación, los efectos cardiorrespiratorios y la recuperación. Así mismo, se ha estudiado la vía de administración intramuscular de Alfaxalona sola o en combinación con Dexmedetomidina, como alternativa a la vía intravenosa, para la consecución de una sedación o anestesia estable en esta especie. Metodología Se utilizaron 5 conejos hembras de raza Nueva Zelanda, y se diseñaron 2 experiencias. La primera con el objetivo de determinar la farmacocinética y la farmacodinamia de la Alfaxalona en conejos, tras su administración sola o en combinación con Dexmedetomidina. La segunda con un enfoque clínico para evaluar la calidad de sedación/anestesia de la combinación, con mayor profundización en la monitorización anestésica. La dosis usada de Alfaxalona fue de 5 mg/kg y de Dexmedetomidina 0,1 mg/kg, en las 2 experiencias. Se analizó la postura espontánea, el tono muscular, la respuesta al ruido y la analgesia. En la experiencia clínica se realizó la monitorización a través de electrocardiografía, pulsioximetría, capnografía, presión arterial directa y gases arteriales. Resultados y Conclusiones La biodisponibilidad de la Alfaxalona por vía IM es similar a la obtenida por vía IV, con procesos de absorción rápidos y vidas medias cortas. La administración IM de Alfaxalona con Dexmedetomidina, posee tiempos medios de residencia más prolongados. La Alfaxalona IM o IV sin combinación en conejos, constituye una alternativa para la consecución de sedaciones moderadas en procedimientos exentos de dolor, con escasos efectos sobre el sistema cardiovascular, aunque con moderada depresión respiratoria. La administración IM de Alfaxalona con dexmedetomidina provee sedaciones profundas, útiles para procedimientos con dolor suave o moderado, con una duración más prolongada debido a un mayor tiempo de residencia de la Alfaxalona, dada su interferencia con la Dexmedetomidina a nivel de metabolismo y/o eliminación de los dos fármacos; los efectos de esta combinación deprimen la frecuencia cardiaca y respiratoria, sin llegar a mostrarse peligrosa. La premedicación con Dexmedetomidina IM es segura si se acompaña de la posterior administración IM de Alfaxalona, aunque por vía IV, la dosis de Alfaxalona podría reducirse, siendo recomendable que la inducción se realice de forma lenta y a efecto, debido a los efectos depresores sobre la oxigenación y la ventilación. La reversión de la Dexmedetomidina con Atipamezol es recomendable para acelerar la recuperación en esta especie. / SUMMARY Objectives The aim of this thesis was to study the pharmacokinetics and pharmacodynamics of Alfaxalone alone or in association with Dexmedetomidine in rabbits, together with the quality assessment of sedation, cardiorespiratory effects, and recovery. Also, was studied the intramuscular (IM) route of administration of Alfaxalone alone or in combination with Dexmedetomidine, as an alternative to the intravenous route, to achieve stable sedation or anesthesia in this species. Material and Methods Five New Zealand female rabbits were used, and two experiments were designed. The first one was performed to determine the pharmacokinetics and pharmacodynamics of Alfaxalone in rabbits after single administration or in combination with Dexmedetomidine. The second one comprised a clinical approach to assessing the quality of sedation/anesthesia of the two drugs association, with further deepening of anesthesia monitoring. The dose used in the two experiences was 5 mg/kg and 0.1 mg/kg for Alfaxalone and Dexmedetomidine, respectively. Spontaneous position, jaw and tongue relaxation, and response to noise and pain were analyzed. The clinical experience involved monitoring through electrocardiography, pulse oximetry, capnography, direct blood pressure measurement and arterial gas analysis. Results and Conclusions The bioavailability of Alfaxalone intramuscularly administered is similar to that obtained by the intravenous (IV) administration, with rapid absorption processes and short half-lives. The IM administration of Alfaxalone with Dexmedetomidine has longer mean residence times. Alfaxalone IM or IV without combination in rabbits provides an alternative to achieve moderate sedation in pain-free procedures, with little effect on the cardiovascular system, although with moderate respiratory depression. IM administration of Alfaxalone with Dexmedetomidine provides deep sedation, useful for procedures with mild or moderate pain, with a longer duration due to a higher mean residence time of Alfaxalone, due its interference with Dexmedetomidine metabolism and/or elimination of the two drugs. The effects of this combination depress heart and breathing rate, without becoming dangerous. Dexmedetomidine IM as premedication is safe if it is accompanied by subsequent IM administration of Alfaxalone, although if intravenously administered, the dose of Alfaxalone could be reduced and it is recommended that anesthetic induction being performed slowly and by effect, due to the depressant effects on oxygenation and ventilation. The reversal of Dexmedetomidine with Atipamezole is advisable to accelerate the recovery of this species.

Objetivos. Primero: determinación de la susceptibilidad de macrófagos derivados de monocitos activados por citocinas a ser infectados por diferentes cepas del genotipo 1 y 2 de PRRSV. Segundo: evaluación de la modulación de la respuesta inmune por la cepa 2982 de PRRSV-1 en pulmón, tonsila y nódulos linfáticos de credos infectados. Tercero: caracterización de la respuesta inmune inducida por diferentes cepas de PRRSV-1 que varían en virulencia en distintos compartimentos de nódulo linfático mediastínico (Med-LN) de cerdos infectados. Metodología. En el experimento in vitro se seleccionaron monocitos de PBMC de cerdos SPF y se incubaron durante 72 h para permitir la diferenciación en macrófagos. Entonces esas células se estimularon con citocinas durante 24 h: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β o no estimulados. Después mediante citometría de flujo se evaluó el fenotipo de los diferentes macrófagos (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). La infección de macrófagos por PRRSV se cuantificó por medición de la nucleocápside mediante citometría de flujo. En el sobrenadante se midió por ELISA IFN-α, TNF-α, and IL-10. Para el primer estudio in vivo 28 cerdos SPF se infectaron intramuscularmente con la cepa 2982 de PRRSV-1 y se eutanasiaron humanitariamente a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 dpi. Se dejaron 4 animales como grupo control negativo, que se eutanasiaron a los 24 dpi. Los niveles de transcripción de citocinas proinflamatorias (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 y TNF-α) e inmunododuladoras (IL-10 y TGF-β) se midieron mediante RT-qPCR. Para el segundo experimento in vivo 76 lechones SPF fueron aleatoriamente agrupados en 3 grupos de 20 animales para la infección, y los restantes 16 se dejaron como control. Se utilizaron tres cepas de PRRSV-1 con distinta virulencia: LV como prototipo, 215-06 del subtipo 3, y la SU1-bel del subtipo 3. Los animales se eutanasiaron humanitariamente a los 3, 7 y 35 dpi. El folículo y área inter-folicular de Med-LN se tomaron separadamente mediante captura por microdisección láser. Los niveles de transcripción de citocinas (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) y de SOCS1 se evaluaron por RT-qPCR. Las poblaciones celulares de Med-LN se evaluaron por inmunohistoquímica. Resultados. Los macrófagos estimulados por citocinas desarrollan diferente fenotipo comparado con macrófagos no polarizados. Los cultivos celulares de macrófagos polarizados por citocinas pueden muestran diferencias importantes entre cepas de PRRSV. Mientras que los macrófagos no polarizados y M2 son sensibles a todas las cepas de PRRSV, el tratamiento de macrófagos con IFNs induce un claro estado antivírico en dichas células con una menor infección y replicación de PRRSV. Sólo los M1 infectados con LVP23 produjeron cierta cantidad de IFN-α. Este tipo de macrófagos representan un flexible modelo in vitro alternativo al empleo de líneas celulares derivadas de mono o a macrófagos alveolares porcinos. El primer estudio in vivo mostró que la cepa 2982 del PRRSV-1 es capaz de evadir el establecimiento de respuesta inmune innata efectiva, permitiendo una expresión génica de IFN- α 1 y TNF-α disminuida, y una respuesta inmune adquirida débil y retardada, por una expresión ineficiente de IL-12 e IFN-γ. El segundo experimento in vivo demostró que PRRSV permanece alojado en Med-LN al menos hasta 35 dpi, y la cepa SU1-bel es la que posee una mayor capacidad de replicación. Las cepas de PRRSV-1 evitaron el establecimiento correcto de la respuesta inmune en cerdos infectados mediante la depleción de células linfáticas y disminución de la expresión de IFN- α y TNF-α en los compartimentos de Med-LN. Finalmente, los resultados sugieren que la inducción de IL-10 por PRRSV con el propósito de retrasar la respuesta inmune del hospedador no es una estrategia común a todos los aislados de PRRSV- / 1. Objectives. First: determination of the cytokine primed monocyte-derived macrophages susceptibility to be infected by different PRRSV-1 and 2 strains. Second: evaluation of the swine immune response modulation by PRRSV-1 2982 strain in lung, tonsil, tracheobronchial and retropharyngeal lymph nodes of infected pigs. Third: characterization of the immune response induced by several PRRSV-1 strains varying in virulence in distinct compartments of mediastinal lymph node (Med-LN) (follicle and inter-follicular areas) of infected pigs. Methodology. For the in vitro experiment, monocytes were isolated from PBMC of SPF pigs and incubated during 72 h to lead the macrophage differentiation. Then, these cells were stimulated during 24 h with cytokines: IFN-γ (M1), IL-4 (M2), IFN-β or no stimulated. After that the phenotype of the different macrophages were evaluated by flow cytometry (CD16, MHC I, MHC II, CD86, CD16 and CD14). Several PRRSV-1 and PRRSV-2 strains were used to infect macrophages. PRRSV infection of macrophages was evaluated by nucleocapsid protein acquisition by flow cytometry. In the supernatant IFN-α, TNF-α, and IL-10 were determined by ELISA. For the first in vivo experiment 28 SPF pigs were infected intramuscularly with PRRSV-1 2982 isolate and were humanely euthanized at 3, 7, 10, 14, 17, 21 and 24 dpi. Four pigs were kept as non-infected control group, being humanely euthanized at 24 dpi. The proinflammatory (IFN-α, IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40 and TNF-α) and immunomodulatory (IL-10 and TGF-β) cytokines transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. For the second in vivo experiment, 76 SPF piglets were ramdonly allocated in groups of 20 animals for the viral infection and the 16 remaining animals as control group. Three PRRSV-1 isolates varying in virulence were selected in this study: LV as prototype, 215-06 from subtype 1, and SU1-bel from subtype 3. Animals were humanely euthanized at 3, 7 and 35 dpi. Med-LN follicle and inter-follicular areas were separately selected by Laser Microdissection Capture. Cytokines (IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-23p19, IL-10 and TGF-β) and SOCS1 transcript levels were evaluated by means of RT-qPCR. The lymph node cell populations were evaluated by immunohistochemistry. Results. The in vitro experiment showed that stimulated macrophages developed different phenotype compared with non polarized macrophages. Cytokine-primed macrophages cultures can reveal important PRRSV strain differences. Whereas undifferentiated macrophages and M2 are sensitive to all PRRSV strains, IFN-γ and IFN-β treatment of macrophages induced a clear antiviral state in macrophages with reductions in virus infection and replication. Only IFN-α production was detected in the supernatant of M1 infected with LVP23 PRRSV-1 strain. These macrophages represent a flexible in vitro model alternative against monkey cell lines and porcine alveolar macrophages. The first in vivo experiment showed that PRRSV-1 strain 2982 is able to evade the onset of an effective innate immune response, leading to an impaired expression of IFN-α 1 and TNF-α gene expression, and a weak and delayed acquired immune response through an inefficient IL-12 and IFN-γ expression. This experiment showed that PRRSV remains allocated in follicle of lymph node during at least 35 dpi, and SU1-bel showed the higher ability of replication. PRRSV-1 stains showed to avoid the correct innate immune response in infected pigs through lymphatic cell depletion, IFN-α and TNF-α down-regulation in Med-LN compartments. Finally, the IL-10 induction by PRRSV was not a common strategy among the PRRSV-1 to delay of the host immune response.

Tesis por compendio de publicaciones / La inseminación artificial (IA) es una biotecnología ampliamente utilizada en la industria porcina, jugando un papel fundamental en la mejora de la productividad. Idealmente, los programas de IA en porcino, deberían utilizar espermatozoides congelados-descongelados dadas las ventajas adicionales que poseen en comparación con el semen refrigerado, en particular las relacionadas a la bioseguridad y comercio internacional. Sin embargo, los espermatozoides congelados-descongelados se utilizan con poca frecuencia en los programas de IA porcina comerciales debido a su menor eficiencia con respecto al semen refrigerado, ya que se requieren más espermatozoides por dosis de IA alcanzando por lo general peores resultados de fertilidad. La razón biológica de este hecho está relacionada con la gran sensibilidad de los espermatozoides porcinos a la criopreservación. Además, los espermatozoides que sobreviven a dicho proceso, poseen una vida funcional más corta. El principal objetivo de esta Tesis es el de optimizar el protocolo de criopreservación de espermatozoides de porcino con el fin de mejorar la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó el impacto de los espermatozoides no funcionales presentes en los eyaculados de porcino sobre la capacidad de los espermatozoides funcionales para soportar el proceso de criopreservación. Para ello, se congelaron 15 fracciones ricas (FR) de 5 machos fértiles con diferentes proporciones de espermatozoides no funcionales (0- muestra de semen nativa, 25, 50 y 75 %). Tras la descongelación, se evaluaron los espermatozoides mótiles y viables que se recuperaron, así como la funcionalidad espermática en términos de fluidez de membrana de plasmática y producción intracelular de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) en condiciones de capacitación in vitro. Además, se evaluó la peroxidación lipídica de la membrana plasmática mediante la medición indirecta de la producción de malondialdehído (MDA). Tanto la motilidad (evaluada mediante sistema CASA) como la viabilidad espermática normalizadas (evaluada mediante citometría de flujo y triple tinción de los espermatozoides con Hoechst 33342, H-42; yoduro de propidio, PI, y aglutinina de cacahuete conjugado con fluoresceína, PNA-FITC) fueron menores (p<0’01) cuanta mayor proporción de espermatozoides no funcionales había en las muestras seminales antes de la congelación, independientemente del verraco. Sin embargo, la magnitud del efecto fue diferente (p<0’01) entre los verracos. Las muestras de semen con la mayor subpoblación de espermatozoides no funcionales antes de la congelación mostraron los mayores (p<0’01) niveles de MDA tras la descongelación. En cuanto a la funcionalidad de los espermatozoides supervivientes a la descongelación, la muestra con 75 % de espermatozoides no funcionales antes de la congelación tuvo una generación intracelular de ROS (evaluada con 5-(y-6) clorometil-20,70-dichlorodihydrofluorescein éster acetil diacetato; CM-H2DCFDA) más alta (p<0’01) y un aumento (p<0’01) de la fluidez de la membrana espermática (Merocianina 540, M540) con respecto a la muestra control. El objetivo del segundo estudio fue determinar si los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen antes y durante la congelación influyen en la capacidad de fertilización in vitro (FIV) de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. Usando el mismo diseño experimental que en el estudio anterior, se prepararon y criopreservaron 4 muestras de semen procedentes de 15 FR con las mismas proporciones de espermatozoides no funcionales. Tras la descongelación, las muestras seminales fueron centrifugadas con PorciPureTM. La concentración (evaluada usando un Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) y viabilidad espermática (evaluada del mismo modo que en el estudio anterior) de cada pellet de espermatozoides fueron evaluadas para calcular la cantidad de espermatozoides viables totales en cada muestra de semen tras la centrifugación. La funcionalidad de los espermatozoides, en términos de generación intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear (Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), se evaluó antes y después de la centrifugación con el gradiente de PorciPureTM en condiciones de capacitación in vitro. La capacidad de FIV espermatozoides supervivientes al proceso de criopreservación se evaluó se evaluó de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma) y del desarrollo embrionario. Un total de 1.041 ovocitos madurados in vitro fueron inseminados utilizando un número fijo de espermatozoides viables purificados con PorciPureTM (ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1), independientemente de los diferentes porcentajes de espermatozoides no funcionales de las muestras. El desarrollo embrionario se evaluó a los 2 y 7 días después de la inseminación mediante la tasa de división (porcentaje de ovocitos divididos a 2-4 células/total cigotos putativos cultivados) y la formación de blastocistos (porcentaje de blastocistos/total cigotos putativos cultivados), respectivamente. El número total de células de los blastocistos resultantes se evaluó por tinción de los blastocistos con H-42. Los resultados revelaron que una alta proporción de espermatozoides no funcionales en muestras de semen antes y durante la congelación inducen un aumento (p <0’001) de la generación de intracelular de ROS y la fragmentación del ADN nuclear en espermatozoides congelados-descongelados. Estos cambios funcionales resultaron en bajas proporciones (p <0’01) de ovocitos penetrados y embriones desarrollados in vitro. En el tercer estudio, se evaluó la eficacia de la selección de espermatozoides usando un gradiente de centrifugación de una sola capa (Single Layer Centrifugation; SLC) antes de la congelación sobre la supervivencia espermática. Para ello, 24 FR recogidas de 24 verracos, se dividieron en 2 grupos en función de sus características seminales iniciales (concentración, morfología, motilidad y viabilidad espermática): estándar (n = 15) y sub-estándar (n = 9). Las muestras seminales de cada FR se dividieron en 2 alícuotas, una permaneció sin tratar (muestras control) y la otra se centrifugó con el gradiente de una sola capa (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 mL de Androcoll-P-Large® (muestras SLC). El rendimiento de espermatozoides totales, motiles (evaluados mediante CASA) y viables (evaluados mediante citometría como se mencionó anteriormente) después de SLC fue mayor (p<0’05) en las muestras estándar que en las sub-estándar. Las muestras de semen fueron criopreservadas. Tras la descongelación, la motilidad y viabilidad espermáticas fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control, independientemente de las características iniciales eyaculado. Además, los espermatozoides descongelados de las muestras SLC fueron más resistentes (p<0’05) a la peroxidación lipídica (Bioxytech MDA - 586 Kit de ensayo) que los de las muestras de control. El tratamiento con SLC también influyó en la funcionalidad de los espermatozoides descongelados bajo condiciones de capacitación in vitro. El porcentaje de espermatozoides viables que mostraron alta fluidez de membrana fue menor (p<0’05) en las muestras SLC que en las muestras control. Los espermatozoides descongelados de las muestras SLC generaron menor (p<0’05) cantidad de ROS que los de las muestras control en los eyaculados sub-estándar. El objetivo del cuarto estudio experimental fue el de evaluar la idoneidad y eficacia de SLC, empleando el coloide Androcoll-P-XL®, como un procedimiento de rutina para la selección de los espermatozoides funcionales de los eyaculados de porcino para la criopreservación. Trece FR (una por verraco) se dividieron en tres alícuotas. Dos alícuotas de 15 y 150 mL se centrifugaron (500 g durante 20 minutos), utilizando 15 y 150 mL (v/v) de Androcoll-P-Large® y Androcoll-P-XL®, respectivamente. La tercera alícuota se mantuvo sin procesa (control). Tras la centrifugación, los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales y con motilidad rápida y progresiva (CASA) fueron mayores (p<0’01) tras en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll -P® utilizado. Sin embargo, el porcentaje de espermatozoides con ADN nuclear fragmentado fue menor (p<0’01) en las muestras SLC que en el control, independientemente del Androcoll-P® utilizado. Las tasas de recuperación de espermatozoides totales, mótiles, viables y morfológicamente normales oscilaron entre el 20 y 100 %, mientras que los porcentajes de espermatozoides con ADN nuclear intacto oscilaron entre el 60 y 100 %, con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la SLC, las muestras espermáticas fueron criopreservadas. Tras la descongelación, los porcentajes de espermatozoides mótiles, viables y con ADN nuclear intacto, fueron mayores (p<0’05) en las muestras SLC que en el control con independencia de la Androcoll-P® utilizado. Tras la descongelación, se inseminaron 679 ovocitos madurados in vitro con un ratio de espermatozoides viables:ovocito de 300:1. La SLC también mejoró (p<0’01) la capacidad de FIV de los espermatozoides congelados-descongelados, evaluada de acuerdo con el porcentaje de ovocitos fecundados (dos pronúcleos y una cola espermática en el interior del ooplasma). Sin embargo, no hubo ningún efecto de SLC sobre capacidad in vitro de los cigotos putativos para desarrollar a blastocistos. Tras todo lo anteriormente expuesto, podemos concluir que: Los espermatozoides no funcionales presentes en las muestras de semen de porcino antes de la congelación influyen negativamente en la congelabilidad de los espermatozoides funcionales. Lo cual se evidencia por una reducción en la proporción de espermatozoides funcionales recuperados tras la descongelación y por una menor capacidad fecundante y habilidad para desarrollar embriones in vitro por los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. La selección espermática mediante el gradiente de centrifugación de una sola capa Androcoll-P® utilizado antes de la congelación, mejora la congelabilidad espermática y la capacidad fecundante de los espermatozoides que sobreviven al proceso de criopreservación. / Artificial insemination (AI) is extensively used by swine producers worldwide, playing a pivotal role in the improvement of herd productivity. Ideally, swine AI-programs should use frozen-thawed (FT) sperm, given its additional advantages compared to liquid-stored semen, particularly those concerning international trade and biosecurity. However, FT-sperm are infrequently used in commercial swine AI programs because of their lower efficiency with respect to liquid-stored semen; more FT-spermatozoa are required per AI dose to achieve typically lower fertility outcomes. The biological reason for the large number of spermatozoa required per AI dose is related to the high cryosensitivity of boar spermatozoa. In addition, the spermatozoa that survive the cryopreservation process exhibit an impaired and shortened functional lifespan. Therefore, this thesis was designed to optimize the boar sperm cryopreservation protocol in order to improve the sperm survival after thawing. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the impact of non-functional spermatozoa on the cryopreservation success of functional spermatozoa was assessed. Fifteen sperm-rich ejaculate fractions (SREF) collected from 5 fertile boars were frozen (following a standard 0.5-mL straw freezing protocol) with different proportions of induced non-functional sperm (0-native semen sample-, 25, 50 and 75% non-functional spermatozoa). After thawing, the recovery of motile and viable spermatozoa was assessed, and the functional of the spermatozoa was evaluated from plasma membrane fluidity and intracellular reactive oxygen species (ROS) generation upon exposure to capacitation conditions. In addition, the lipid peroxidation of the plasma membrane was assessed by the indirect measurement of malondialdehyde (MDA) generation. The normalized (with respect to a native semen sample) sperm motility (assessed by CASA) and viability (cytometrically assessed after staining with Hoechst 33342, H-42; propidium iodide, PI; and fluorescein-conjugated peanut agglutinin, PNA-FITC) decreased (p<0.01) as the proportion of functional spermatozoa in the semen samples before freezing decreased, irrespective of the semen donor. However, the magnitude of the effect differed (p<0.01) among boars. Moreover, semen samples with the largest non-functional sperm subpopulation before freezing showed the highest (p<0.01) levels of MDA after thawing. The thawed viable spermatozoa of semen samples with a high proportion of non-functional spermatozoa before freezing were also functionally different from those of samples with a low proportion of non-functional spermatozoa. These differences consisted of higher (p<0.01) levels of intracellular ROS generation (assessed with 5-(and-6) chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester; CM-H2DCFDA) and increased (p<0.01) membrane fluidity (assessed with Merocyanine 540, M540). The objective of the second study was to evaluate the impact of non-functional spermatozoa on the in vitro fertilization (IVF) ability of FT-spermatozoa. Using the same experimental approach as the previous study, 4 sperm semen samples from 15 SREF with the same different proportions of induced non-functional sperm were also prepared and cryopreserved following the protocol indicated above. After thawing, the semen samples were centrifuged with PorciPureTM Bottom Layer. The sperm concentration (measured using a Nucleocounter-SP100, ChemoMetec, A/S) and viability (as indicated in the previous study) of each sperm pellet were assessed to calculate the total viable sperm count in each semen sample. The functionality of the spermatozoa, in terms of intracellular ROS generation and nuclear DNA fragmentation (sperm chromatin dispersion test; Sperm-Sus-Halomax®, Halotech DNA SL), was assessed before and after the PorciPureTM centrifugation gradient in sperm samples incubated under capacitating conditions. The IVF ability of cryosurviving spermatozoa was assessed according to oocyte fertilisation (2 pronuclei and a sperm tail inside of the ooplasm) and embryo development. A total of 1,041 in vitro-matured oocytes were inseminated using a fixed number of PorciPureTM-purified viable spermatozoa (viable sperm: oocyte ratio of 300:1), regardless of the differing percentages among the 4 semen samples (native, 25 %, 50 %, and 75 % non-functional spermatozoa). Embryo development was evaluated at 2 and 7 days after insemination by the assessment of the cleavage rate (percentage of oocytes divided to 2–4 cells/total putative zygotes cultivated) and blastocyst formation (percentage of blastocyst/total putative zygotes cultivated), respectively. The total cell number of the resulting blastocysts was evaluated by staining the blastocysts with H-42. The results revealed that high proportions of dead spermatozoa in raw semen samples before and during freezing induce (p<0.001) increased ROS generation and nuclear DNA fragmentation in frozen-thawed spermatozoa. These dysfunctional changes resulted in low ratios (p<0.01) of in vitro penetrated oocytes and healthy developing embryos. The effectiveness of sperm selection using single-layer centrifugation (SLC) prior to freezing on the sperm cryosurvival of boar ejaculates was evaluated in the third study. Twenty-four SREF, collected from 24 boars, were divided into 2 groups according to their initial semen traits: standard (n=15) and substandard (n=9). Semen samples from each SREF were split in 2 aliquots, one remained untreated (control samples) and the other was single-layer centrifuged (500 g for 20 min) using 15 mL of Androcoll-P-Large® (SLC-samples). The yield of total, motile (assessed by CASA) and viable (cytometrically evaluated as mentioned above) sperm after SLC was higher (p<0.05) in standard than substandard semen samples. The semen samples were cryopreserved using a standard 0.5-mL straw freezing protocol. Post-thaw sperm motility and viability were higher (p<0.05) in SLC than in control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Additionally, thawed spermatozoa from SLC samples were more resistant (p<0.05) to lipid peroxidation (BIOXYTECH MDA-586 Assay Kit) than those from control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. The SLC-treatment also influenced the functionality of thawed spermatozoa undergoing an in vitro capacitation process. The percentage of viable sperm showing high membrane fluidity (assessed with M540) was lower (p<0.05) in the SLC than in the control samples, regardless of the initial semen traits of the ejaculates. Thawed viable spermatozoa of SLC samples generated less (p<0.05) reactive oxygen species (assessed with CM-H2DCFDA) than those of control samples in the substandard ejaculates. The objective of the fourth experimental study was to evaluate the suitability and effectiveness of SLC as a routine procedure for selecting boar spermatozoa for cryopreservation. Thirteen sperm rich ejaculate fractions (one per boar) were split into three aliquots. Two aliquots of 15 and 150 mL were SLC-processed (500 g for 20 min) using 15 and 150 mL (v/v) of Androcoll-P-Large® and Androcoll-P-XL®, respectively. The third aliquot remained un-processed as a control. The percentages of spermatozoa that were morphologically normal and showed rapid and progressive motility (assessed by CASA) spermatozoa were higher (p<0.01) and those with fragmented nuclear DNA were lower (p<0.01) after SLC than control semen samples, regardless of the Androcoll-P® used. The recovery rates of total, motile, viable (flow cytometric evaluated after staining with H-42, PI and FITC-PNA) and morphologically normal spermatozoa ranged between 20 and 100% and those with intact nuclear DNA ranged between 60 and 100%, irrespective of the Androcoll-P® used. Thereafter, the semen samples were cryopreserved as mentioned above. Post-thaw percentages of sperm motility, viability and intact nuclear DNA were higher (p<0.05) in SLC-processed than in control semen samples, irrespective of the Androcoll-P® used. SLC-processing also improved (p<0’01) the IVF ability of FT-sperm (679 in vitro matured oocytes inseminated with a viable sperm:oocyte ratio of 300:1 following the same procedure mentioned above), measured as the percentage of penetrated oocytes and the mean number of swollen sperm heads and/or male pronuclei in penetrated oocytes. However, there was no effect of SLC-processing on the in vitro ability of putative zygotes to develop to blastocysts. The results achieved in these four experimental studies have generated the following conclusions: Non-functional spermatozoa present in boar semen samples before freezing negatively influence the cryopreservation of functional spermatozoa by reducing the proportion of recovered surviving spermatozoa after thawing and also by altering the functional and fertilisation ability of the sperm that survive the cryopreservation process. Single Layer Centrifugation prior to freezing improves the boar sperm cryopreservation and post-thaw fertilisation ability of cryosurvival spermatozoa. However, further studies aimed at optimising the yield of SLC procedure are needed.

Los objetivos de este estudio fueron: (1) establecer los perfiles concentración plasmática–tiempo y derivar los parámetros farmacocinéticos para marbofloxacino en cabras lactantes tras la administración de fomulaciones IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC de marbofloxacino; (2) determinar la velocidad y cantidad de penetración de marbofloxacino, así como su eliminación, en la leche de cabra tras la administración de fomulaciones IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC de marbofloxacino; (3) comparar los parámetros farmacocinéticos obtenidos entre la formulación convencional SC y las formulaciones con P407 (con y sin CMC como aditivo); (4) evaluar el grado de actividad in vitro de marbofloxacino frente a cepas de S.aureus aisladas de leche de cabra mamítica en España, y (5) calcular los marcadores surrogados de eficacia contra cepas de S.aureus aisladas de leche de cabra mamítica en España. Estos parámetros podrían proporcionar información y un entendimiento adicional sobre la farmacología de las fluoroquinolonas en pequeños rumiantes lactantes. METODOLOGÍA: Se utilizaron seis cabras hembras clínicamente sanas de la raza Murciano-Granadina, con pesos entre 49.6 - 68.4 kg en un rango de 2,5 – 3,5 años de edad. Los animales pertenecen a la granja caprina de la universidad de Murcia. A cada animal se le administró una dosis única IV o SC de marbofloxacino a la dosis de 2 mg/kg o de SC-P407 y SC-P407-CMC a la dosis de 6 mg/kg con al menos 15 días de periodo de descanso. Muestras de sangre fueron recogidas antes de inyectar el fármaco (tiempo 0 o pre-tratamiento), y a 0,083, 0,167, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas tras la administración. Muestras de leche fueron ordeñadas inmediatamente antes y después de la administración del fármaco a 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas. Este estudio fue aprobado por el comité bioético de la universidad de Murcia. Las concentraciones en plasma y leche de marbofloxacino fueron medidas mediante HPLC con detección fluorescente, y los perfiles de concentración (plasma o leche) obtenidos frente al tiempo para cada animal, en cada tratamiento, fueron analizados mediante métodos farmacocinéticos. La absorción in vivo de marbofloxacino fue evaluada mediante técnicas de deconvolución numérica. Doce cepas de Staphylococcus aureus, todas aisladas de leche de cabra con mamitis en granjas comerciales españolas fueron evaluadas. Los valores de MIC y MPC fueron obtenidos según los procedimientos recomendados por el CLSI y el método descrito por Blondeau y colaboradores, 2001. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: La semivida plasmática en la fase terminal para marbofloxacino tras la administración IV, SC, SC-P407 y SC-P407-CMC fue de 5.61, 6.89, 15.27 y 16.25 horas, respectivamente. La biodisponibilidad absoluta de marbofloxacino tras la administración de las formulaciones SC, SC-P407 y SC-P407-CMC fue de un 108.98  11.00%, 101.36  15.87% y 78.64  14.47%, respectivamente. La exposición sistémica alcanzada en cabras tras la administración de marbofloxacino en las formulaciones SC-P407 y SC-P407-CMC a la dosis de 6 mg/kg proprociona cinco puntos a considerar. Primero, la tasa de liberación del fármaco alcanzada podría ser adecuada para mantener concentraciones plasmáticas efectivas durante el intervalo de dosificación, en el caso de las formulaciones SC-P407 y SC-P407-CMC, niveles plasmáticos elevados se alcanzaron hasta las 48 horas post-administración. Segundo, estas formulaciones poseen buenos parámetros farmacocinéticos: elevadas semividas plasmáticas en la fase terminal (3 veces superiores a las formulaciones convencionales), buena biodisponibilidad, constantes de absorción bajas y elevados tiempos medios de absorción (que pueden reflejar una cinética del tipo flip-flop). Tercero, el antibacteriano utilizado en este studio posee un buen índice de penetración en leche, con perfiles plasmáticos paralelos a los obtenidos en leche. Cuarto, los resultados obtenidos con las formulaciones testadas con y sin carboxi-metilcelulosa, como aditivo, son consistentes con los marcadores surrogados predichos para obtener una ventana terapéutica efectiva contra cepas de S.aureus con valores de MIC ≤ 0.13 μg/mL. Quinto, la dosificación para alcanzar concentraciones equivalentes a la MPC podría ser efectiva para reducir la selección de subpoblaciones de bacterias mutantes de S.aureus con susceptibilidad reducida a las fluoroquinolonas. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales para evaluar, optimizar, y conocer, las dosis y ratios óptimos necesarios para alcanzar marcadores surrogados en cabras lactantes para valores más altos de MIC o MPC y para otros agentes infecciosos. / The objectives of the present study were: (1) to establish the plasma concentration–time profile and to derive pharmacokinetics data for marbofloxacin in lactating goats after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC formulations; (2) to determine the rate and extent of marbofloxacin penetration into and elimination from milk after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administrations; (3) to compare the pharmacokinetic parameters between conventional SC and P407 formulations (with or without CMC as an additive); (4) to evaluate the degree of in vitro activity marbofloxacin against S.aureus strains isolated from the milk of goats with clinical mastitis in Spain, and (5) to calculate the surrogate markers of efficacy against S. aureus strains isolated from mastitic goat´s milk in Spain. These parameters will provide additional understanding of fluoroquinolone pharmacokinetics in lactating small ruminants. METHODOLOGY: Six clinically healthy Murciano-Granadina female goats weighing between 49.6 - 68.4 kg and aged from 2.5 - 3.5 years from the Caprine Farm of the University of Murcia were used. Each animal received either a single IV or SC injection of marbofloxacin at a dose of 2 mg/kg or a SC-P407 and SC-P407-CMC administration at a dose of 6 mg/kg with at least a 15-day washout period. Blood samples were collected at 0 (pre-treatment), 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 and 96 h post-dosing. Milk samples were collected immediately before dosing on the day of treatment administration (time 0) and at 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 and 96 h after administration. The study was approved by the Bioethics Committee of the University of Murcia. Plasma and milk concentrations of marbofloxacin were measured by HPLC method with fluorescence detection, and the plasma and milk concentration-time data obtained in each individual animal were analyzed by pharmacokinetics methods. The in vivo marbofloxacin absorption was performed by numeric deconvolution. Twelve strains of Staphylococcus aureus, all isolated from mastitic goat´s milk in Spain, were tested. The MIC and MPC of marbofloxacin was determined using the recommended procedure by CLSI and the method described by Blondeau et al. 2001. RESULTS AND CONCLUSIONS: Plasma terminal half-lives of marbofloxacin after IV, SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration were 5.61, 6.89, 15.27 and 16.25 h respectively. Following SC, SC-P407 and SC-P407-CMC administration of marbofloxacin, the absolute bioavailability was 108.98  11.00%, 101.36  15.87% and 78.64  14.47%, respectively. The systemic exposure achieved in goats following the SC-P407 and SC-P407-CMC administration of marbofloxacin at a 6 mg/kg dose provides five important outcomes. First, the rate of drug release could be adequate to maintain effective plasma concentrations for the duration of the dosage interval, in the case of SC-P407 and SC-P407-CMC formulations, high plasma levels are achieved until 48 hours. Second, these formulations provide good pharmacokinetics parameters: high terminal half-lives (3-fold than the conventional formulation), good bioavailability, slow absortion rate constants and highs mean absortion times (that can reflect flip-flop kinetics). Third, the antibacterial drug used in this study allowed a good penetration in milk, with a concentration-time profile in milk closely paralleled the plasma profile, fourth, results for the formulations tested with or without carboxy-methylcellulose as additive are consistent with the predicted surrogate markers needed for a positive therapeutic outcome for the S.aureus strains tested with MIC ≤ 0.13 μg/mL. Fifth, dosing to achieve MPC concentrations could be effective to reduce the selection of bacterial subpopulations of S.aureus with reduced fluoroquinolone susceptibility. However, further studies are necessary to evaluate, optimize and to know the doses and optimal ratios of the surrogate markers in lactating goats for MIC or MPC values higher and for other infectious agents.

Tesis por compendio de publicaciones / Over the last years, reproductive technologies as artificial insemination (AI) and semen conservation procedures are increasingly demanded in canine species and the optimization of these procedures are the main goal of numerous investigations. On the other hand, the study and development of new technologies applicable to the canine species in the area of reproductive biotechnology is also increasing. In this context, we have considered that the possible application of sex-sorting technology by flow cytometry in combination with other routine reproductive techniques mentioned above, could contribute relevantly to optimize the efficiency of canine breeding. The main objective of this Thesis was to optimize the protocols for chilling and cryopreservation of dog spermatozoa and to design an effective protocol for canine spermatozoa sex-sorting using flow cytometry. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the effects of various rapid cooling rates from room temperature (23 ºC) to 5ºC on sperm quality of chilled and cold-stored (96 h) canine spermatozoa, using a Tris fructose extender with 20% egg yolk was evaluated. For this purpose, sperm rich fraction samples were pooled (experiment 1) or processed individually (experiment 2) and split into different aliquots that were chilled to 5 °C using different cooling rates of 2.25, 0.9, 0.45, and 0.2 (control) °C/min. In the second study, the effects of rapid cooling prior to freezing on frozen-thawed canine sperm quality. For this purpose 2 experiment were carried out. In experiment 1, centrifuged ejaculates from 6 dogs were pooled, split into 4 aliquots and cryopreserved by the Uppsala procedure using different cooling rates (control, 0.2 C/min; rapid, 2.25 C/min) in combination with 2 glycerol addition protocols (fractionated or unfractionated). In experiment 2, centrifuged ejaculates from 4 dogs were processed individually using the same cooling rates described in experiment 1 in combination with an unfractionated glycerol addition protocol. In the third study, 3 the objective was to optimize Hoechst 33342 staining concentrations for the flow cytometric identification and separation of X- and Y-chromosome-bearing canine spermatozoa. Additionally, to determine whether variations between dogs exist that affect the sex-sorting of spermatozoa. Semen samples from six dogs were diluted to 100 × 106 sperm/mL, split into four aliquots, stained with increasing H-42 concentrations (5, 7.5, 10 and 12.5 μL, respectively) and sorted by flow cytometry. The rates of non-viable, percentages of oriented and selected spermatozoa, as well as the average sorting rates (sorted spermatozoa/s), were used to determine the sorting efficiency. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: the use of a rapid cooling rate of 2.25 ºC/min can be an efficient alternative to the use of a slow cooling rate in protocols for chilling canine semen using a TCF 20% egg yolk extender, maintaining optimal values of sperm quality during a long period of cold-storage (96 h). Dog spermatozoa can be cryopreserved using a rapid cooling rate of 2.25ºC/min prior to freezing with the Uppsala method, in combination with a fractionated or unfractionated glycerol addition procedure. Sperm sex-sorting by flow cytometry can be performed successfully in canine samples using between 7.5 and 12.5 μL of H-42. In addition, significant individual differences are evident in the sorting efficiency of canine spermatozoa. / Actualmente, biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA) y procedimientos para la conservación de espermatozoides como la refrigeración y criopreservación son técnicas muy demandadas en la especie canina. Así mismo, la optimización de estos protocolos ha sido y sigue siendo objetivo de la mayoría de investigaciones en el campo de la reproducción canina. Desde un punto de vista práctico, resultaría muy interesante la disminución del tiempo empleado en enfriar las muestras de semen hasta 5 ºC durante los procesos de conservación. Por otra parte, destacar la importancia que supondría en esta especie el desarrollo de nuevas biotecnologías reproductivas. En especial, sería muy interesante poder combinar técnicas utilizadas de forma rutinaria, como la IA y los protocolos de conservación seminal, con otras técnicas reproductivas como la preselección del sexo de la descendencia mediante separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo. Por todo lo mencionado anteriormente, la finalidad principal de esta Tesis fue optimizar los procedimientos de conservación de semen, así como diseñar un protocolo para la separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo en la especie canina. Para lograr este objetivo, los siguientes estudios fueron realizados. En el primer estudio, se evaluó el efecto de diferentes ratios de enfriamiento rápido, desde temperatura ambiente (23 ºC) hasta 5 ºC, sobre la calidad del semen canino refrigerado y conservado durante 96 horas, utilizando un medio de Tris fructosa con un 20% de yema de huevo. Para ello, las fracciones espermáticas procedente de 5 perros fueron agrupadas en un pool (experimento 1) o procesadas individualmente (experimento 2) y divididas en diferentes alícuotas las cuales fueron refrigeradas a 5 ºC utilizando diferentes ratios de enfriamiento de 2,25, 0,9, 0,45 y 0,2 (control) º C/min. En el segundo estudio, se evaluó el efecto de una ratio de enfriamiento rápido antes de la congelación sobre la calidad del semen canino criopreservado utilizando el método Uppsala, en combinación con la adición fraccionada o no de glicerol. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos. En el experimento 1, las fracciones espermáticas de 6 perros fueron agrupadas en un pool, divididas en cuatro alícuotas y criopreservadas mediante el método Uppsala usando diferentes ratios de enfriamiento (control, 0,2 ºC/min y rápido, 2,25 ºC/min) en combinación con 2 protocolos de adicción del glicerol (fraccionado y no fraccionado). En el experimento 2, las fracciones espermáticas de 4 perros fueron procesadas usando los mismos ratios de enfriamiento que en el experimento 1 en combinación con una adicción no fraccionada de glicerol. En el tercer estudio, el objetivo fue optimizar las concentraciones de Hoechst 33342 (H-42) para la identificación y separación de los espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo y determinar si existen variaciones entre individuos que afecten al proceso de separación espermática en la especie canina. Las fracciones espermáticas de seis perros fueron divididas en cuatro alícuotas y teñidas con concentraciones crecientes de H-42 (5, 7,5, 10 y 12,5 µL, respectivamente). La identificación y separación de espermatozoides X e Y fue realizada mediante citometría de flujo. Se analizaron los porcentajes de espermatozoides no viables, espermatozoides correctamente orientados, espermatozoides seleccionados o separados, así como finalmente la velocidad de separación (espermatozoides separados/s). Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min puede ser utilizada de forma eficiente en protocolos para la refrigeración de semen canino, utilizando un medio tris fructosa con un 20% de yema de huevo, consiguiendo valores óptimos de calidad espermática durante largos periodos de conservación a 5 º C (96 h). Los espermatozoides caninos pueden ser criopreservados mediante el método Uppsala con una adición fraccionada o no de glicerol, utilizando una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min antes de la congelación. La separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo puede realizarse con éxito en la especie canina utilizando entre 7,5 y 12,5 μL de Hoechst 33342. Además, diferencias entre individuos pueden afectar significativamente a la eficiencia del proceso de separación.

La raza bovina Murciano Levantina (ML) se utilizaba para labores agrícolas por su aptitud de trabajo. Hoy se encuentra en peligro de extinción por pérdida de utilidad ante la aparición de maquinaria agrícola. Los escasos criadores que la mantienen, no se dedican a la producción de ganado bovino, siendo los aspectos del folclore regional los que la hacen acorde con su aptitud de tracción. El Banco de Germoplasma de la raza se inició en el año 2000 y en la actualidad hay 7280 dosis seminales congeladas y almacenadas en N2L, pertenecientes a 13 toros ML, todos ellos muy emparentados. Con estas dosis se atiende tanto a la conservación in vivo, por cesión a los ganaderos y obtención de nuevos reproductores, como a la conservación ex situ in vitro para la futura reconstrucción de la raza en caso necesario; aunque el número de toros es insuficiente, puesto que se requiere semen de 25 toros conservados in vitro. El almacenamiento de dosis seminales es costoso por el aumento continuo de los precios del N2L y actualmente existen métodos para disminuir las necesidades de gametos masculinos; el sexado espermático disminuiría a la mitad estos gastos, aunque posteriormente sería necesaria la recongelación de los gametos. Los objetivos del presente trabajo son conseguir eficacia y eficiencia en el semen recongelado, disminuyendo el número de dosis seminales almacenadas, que serían descongeladas del Banco de Germoplasma, y a las que se les aplicaría un tratamiento similar al requerido por la tecnología de sexado espermático; siendo un objetivo derivado el estudio con técnicas convencionales del semen recongelado y relacionar los parámetros de calidad seminal del semen recongelado con aquellos toros que alcancen mejores valores de fertilidad con semen solamente congelado. Otro objetivo es poner a punto una técnica de recongelación que permita almacenar dosis seminales de forma más eficiente. En este trabajo se han utilizado los datos procesados de dosis seminales de 12 toros de esta raza y los espermatozoides congelados pertenecientes a 6 de esos toros. Los métodos de estudio del eyaculado y de las dosis seminales son los convencionales para la especie bovina. Las técnicas de congelación y recongelación utilizadas son las mismas que para el Banco de Germoplasma. En las experiencias de aplicación de frío, el semen descongelado fue sometido a una recongelación después de haber sufrido un tratamiento (CT), o bien recongelado sin tratamiento (ST). Para conocer el valor de los parámetros estudiados han sido utilizadas técnicas de microscopía óptica y fluorescencia, resistencia en baño de agua termostático, tinciones de E-N, IP, lectinas, azul de toluidina e IA con semen redescongelado a siete novillas de la raza Frisona. En el ganado Murciano Levantino existe variabilidad en los valores promedio de calidad seminal entre los sementales, aunque esto no es debido a la edad. Además, no existen diferencias reseñables en los valores promedio de los parámetros de semen procedente del primer y segundo eyaculado de cada toro. El análisis de los resultados permite conocer el daño en los espermatozoides durante la recongelación, siendo la calidad seminal en el semen descongelado superior a la del redescongelado; con gran variabilidad entre toros. Un semental presentó mejores valores para los parámetros tras la congelación y redescongelación, aunque en algún parámetro no hubo diferencias en ningún toro. Las anomalías espermáticas frecuentemente encontradas fueron las “colas en látigo”, pero ligeramente inferiores en el semen recongelado CT. La inseminación de 7 novillas Frisonas proporcionó un porcentaje de fertilidad del semen recongelado ST del 57’1%, lo que concluye que la recongelación espermática se puede utilizar como técnica de predicción de la fertilidad y ser utilizada para la conservación in vitro. / The Murciano Levantina (ML) bovine breed used to be employed for farming purposes because of their work aptitude. Nowadays, it is an endangered breed because it is no longer used for the mentioned purposes due to the arrival of technology and farming equipment. In addition, there are few ML bovine breeders and this is not their main occupation. This breed is mainly used during popular celebrations and festivals for transport. The Germplasm Bank breed has been carried out since 2000 and currently, there are 7280 seminal doses of 13 ML bulls with high consanguinity among them. With these doses it is possible to carry out both in vivo conservation, cession to the breeders and new breeding males; and ex situ in vitro conservation for the future reconstruction of the race -if necessary. Although the number of seminal doses may seem enough for the recovery of the breed in the future, the number of bulls is not sufficient, because the in vitro cryopreservation of spermatozoa belonging to, at least, 25 bulls is necessary. The storage of seminal doses implies more maintenance costs because of the continued increase in prices; currently there are some methods to reduce the male gametes necessities; the sexing sperm could reduce in the middle these expenses, although, afterwards could be necessary the gametes refreezing. The objectives of the present work are to obtain effectiveness and efficiency in refrozen semen, diminishing the number of frozen seminal doses stored at the Germplasm Bank, which would receive a treatment similar to that required by sexing technologies; being a derivative objective to study the usage of conventional technologies of refrozen semen, connecting the refrozen seminal quality parameters with the best fertility parameters in frozen semen. Another goal is the development of a refreezing technique that allows the storage of seminal doses more efficiently. In this work we have used the processed data of seminal doses belonging to 12 bulls of that breed and the frozen spermatozoa of 6 of those bulls. The methods to study the ejaculates and seminal doses are the conventional ones employed in bovine species. The freezing and refreezing techniques used are the same than those used for the Germplasm Bank. In the experiences with the application of cold, the thawed semen was refrozen after undergoing a certain treatment (CT), or it was refrozen without any treatment (ST). In order to know the value of the studied parameters the following methods have been used: the optical and fluorescent microscopy techniques, resistance in thermostatic water bath study, eosine-nigrosine, PI, lectins (PNA) and toluidine blue stainings and artificial insemination using refrozen semen in 7 Frisone breed heifers. In the ML livestock there is variability in the seminal quality average values among the studs, although this is not due to the bulls’ age. Additionally, there are not important differences regarding the average values between the first and the second ejaculation in each bull. Statistical results permit to know the damage in spermatozoa during recryopreservation, and it was observed that the seminal quality is higher in frozen semen than in refrozen semen, with a high variability among bulls. Among the bulls, one of them presented the best results in each parameter studied after cryopreservation and recryopreservation, although there were no differences among the bulls regarding some parameters. The most frequent sperm abnormalities were the “tails in whip”, but they were slightly lower in CT refrozen semen. The artificial insemination of 7 Frisone heifers showed a percentage of fertility with ST refrozen semen of 57’1%. These results conclude that the re-frozen semen can be used as a predictive technique of fertility, and thus, it can be used for the in vitro conservation of the studied bovine breed.