The photosensitive unit triggering the negative phototaxis in the haloarchaeum Natronomonas pharaonis consists of the receptor sensory rhodopsin II (NpSRII) and its cognate transducer (NpHtrII) in a 2:2 stoichiometry. Upon light excitation, a structural rearrangement in the receptor initiates a displacement/rotation of the transducer helix TM2, which can be considered as starting event for the signal transduction. This signal is further transmitted to the cytoplasmic signaling domain through the signal transduction unit comprising two HAMP domains.Structural information already exists for the transmembrane region of this complex (crystal structure) as well as for the rod shaped cytoplasmic part of NpHtrII due to its high homologies with chemoreceptors. Moreover, the solution NMR structure of the isolated HAMP domain from A. fulgidus recently obtained shows a homodimeric, four-helical, parallel coiled-coil with an unusual interhelical packing, that is thought to propagate a signal by virtue of concerted helix rotations. Here, an electron paramagnetic resonance (EPR) investigation of site-directed spin labeled transducers in the NpSRII/NpHtrII complex has been carried out for structural and functional elucidation of the N. pharaonis HAMP. For this purpose, cw as well as pulse EPR techniques have been used in terms of mobility, accessibility and intra-transducer dimer distance analyses. Conformational changes induced by environmental inputs, namely salt, temperature and pH, give insight into the two-state equilibrium existing between a highly dynamic (dHAMP) and a more compact (cHAMP) conformation of this linker region.

Das haloalkaphile Archaeon Natronomas pharaonis nutzt den Lichtrezeptor, das Sensorische Rhodopsin II (NpSRII), im Komplex mit dem halobakteriellen Transducer (NpHtrII) zur photophoben Antwort auf schädliches grün-blaues Licht und entsprechender Steuerung des Flagellenmotors um optimale Umgebungen zum Überleben aufzusuchen. In einer Membran rekonstituiert bildet der Rezeptor/Transducer Komplex eine 2:2 Stöchiometrie aus, wobei ein Transducer-Dimer von zwei Rezeptor-Molekülen flankiert wird. Durch die Lichtanregung wird ein Photozyklus initiiert, dessen Intermediate sich aufgrund ihrer optischen und/oder strukturellen Eigenschaften unterscheiden. In dieser Studie sind die strukturellen Änderungen des Rezeptors und des Transducers während des Photozyklus mit Hilfe der Elektronenspinresonanz (ESR)-Spektroskopie in Kombination mit der ortsspezifischen Spinmarkierung aufgeklärt worden. Als Methoden wurden dabei die zeitaufgelöste ESR-Spektroskopie und Abstandsmessungen in unterschiedlichen Intermediaten mit Hilfe von cw- und Puls-ESR-Techniken genutzt. Der Signaltransfer nach Initiierung des Photozyklus im Rezeptor, die Weiterleitung des Signals zum Transducer durch die Auswärtsbewegung der Helix F und die damit verbundene Verschiebung des thermodynamischen Gleichgewichts in der HAMP-Domäne des Transducers konnten beobachtet und analysiert werden. Die Methode der ESR-Spektroskopie erweist sich als mächtige biophysikalische Technik, die eine direkte und zeitaufgelöste Analyse von strukturellen Konformationsänderungen in Membranproteinen und die strukturelle Aufklärung unterschiedlicher Intermediate erlaubt.