La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement caractérisée par une neurodégénérescence de la substance noire et la présence d’inclusions d’α- synucléine (α-syn), les corps de Lewy, dans les neurones survivants. Elle se manifeste aussi par des symptômes non moteurs, dont certains, comme la constipation, surviennent précocement. La découverte que le système nerveux entérique (SNE) est fréquemment touché par la pathologie de Lewy a conduit à envisager que le tissu digestif puisse être source d'un biomarqueur précoce de la MP et que le processus pathologique de la maladie puisse s’initier dans le tube digestif pour gagner ensuite le système nerveux central par un mécanisme de type prion. L’objectif de mon travail de thèse a donc été d’optimiser la détection de l’α-syn dans le tube digestif et de comparer les propriétés de l’α-syn entérique et cérébrale. Nous avons montré que les méthodes immunohistochimiques (IHC) visant à détecter l’α-syn dans le tissu gastro-intestinal inclus en paraffine étaient limitées par des aspects techniques, mais qu’elles permettaient sur des coupes coliques avec paroi entière de détecter l’α-syn pathologique de façon performante. Puis, en utilisant une approche biochimique, nous avons montré que l’α-syn entérique native n’avait probablement pas la même tendance à s’assembler que dans le cerveau et que son niveau d’expression n’était pas modifié dans la MP. Nos travaux sont prometteurs pour la mise au point de marqueurs histologiques entériques de la MP et suggèrent une propension différente entre l’α-syn entérique et celle du cerveau à devenir pathogène. / Parkinson's disease (PD) is a movement disorder characterized by neurodegeneration in the substantia nigra and the presence of inclusions of α-synuclein (α- syn) aggregates, termed Lewy bodies, in surviving neurons. Patients may also exhibit various non-motor symptoms, such as constipation, which occur several years before the onset of motor symptoms. The discovery that the enteric nervous system (ENS) is frequently affected by Lewy pathology has led to consider the digestive tissue as a potential source for a specific PD biomarker and even to suggest that the pathological process (pathogenic α-syn) could be initiated in the gut and be propagated to central nervous system by a prion-like mechanism. The aim of my thesis was therefore (i) to optimize the detection of α-syn in the digestive tract in both physiological and pathological conditions and (ii) to compare the properties of α-syn enteric and nervous system central. In the first part, we showed that immunohistochemical methods (IHC) to detect α-syn in paraffin embedded gastrointestinal tissue were limited by some technical challenges, but when using full thickness colonic sample they allow to detect with high accuracy pathological α-syn. In the second part, using biochemical approach, we have shown that α-syn native enteric may not have the same tendency to assemble itself as in brain and its expression level was not changed in Parkinson's disease. Our results are promising for the development of enteric histological biomarkers of PD and suggest a different propensity between the enteric and brain α-syn to become pathological. Key

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par une vulnérabilité sélective des cellules nerveuses, associée à la présence dans le cerveau d'agrégats de protéines mal repliées. Ces inclusions appelées corps de Lewy (CL) ont comme composant majoritaire une protéine appelée alpha-synucléine (α-syn). Pendant la dernière décennie, plusieurs études ont démontré que l'α-syn joue un rôle central dans l'initiation de la MP. Cependant, l'impact de ces agrégats sur l'homéostasie neuronale menant à la neurodégénérescence reste encore méconnu, en partie causé par l'absence d'outils appropriés. Dans ce but, notre équipe a créé une technologie novatrice qui nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à la formation de ces souches pathologiques. Cet outil basé sur l'optobiologie permet de contrôler l'agrégation de l'α-syn sous le contrôle de la lumière (le système LIPA : Light-Inducible Protein Aggregation). Notre système a permis d'induire la formation d'inclusions stables d'α-syn avec un contrôle spatial et temporel dans des cellules vivantes. Conduisant pour la première fois, à la formation in vivo d'inclusions mimant plusieurs des caractéristiques biochimiques et neuropathologiques des corps de Lewy. In vivo, les agrégats LIPA-α-syn ont compromis la transmission nigrostriatale, induit une perte neuronale dopaminergique et une altération du comportement de type parkinsonien. Ce système constitue un outil novateur permettant de générer, visualiser et disséquer le rôle de ces agrégats protéiques dans la MP et éventuellement d'autres troubles neurodégénératifs. Ce projet de thèse consiste en la création de nouveaux modèles cellulaires et animaux de la formation des CL afin obtenir de précieuses informations sur le processus d'agrégation et de propagation de l'α-syn et leur rôle dans la pathogenèse de la MP : cette compréhension permettra de développer de nouveaux traitements curatifs efficaces dans cette maladie. / Parkinson's disease (PD) is characterized by a selective vulnerability of nerve cells associated with the presence of aggregates of misfolded proteins in the brain. These inclusions called Lewy bodies (LBs) have as a major component a protein called alpha-synuclein (α-syn). During the last decade, several studies have demonstrated that α-syn plays a central role in the pathogenesis of PD. However, the impact of these aggregates on neuronal homeostasis leading to neurodegeneration remains poorly understood, partly caused by the lack of appropriate tools. To this end, our team has created a novel technology that will allow us to gain a better understanding of the mechanisms leading to the formation of these pathological strains. This tool based on optobiology allows to control the aggregation of α-syn under the control of light (the LIPA system: Light-Inducible Protein Aggregation). Our system allowed to induce the formation of stable α-syn inclusions with spatial and temporal control in living cells. Leading for the first time, to the in vivo formation of inclusions mimicking many of the biochemical and neuropathological features of Lewy bodies. In vivo, LIPA-α-syn aggregates compromised nigrostriatal transmission, induced dopaminergic neuronal loss and altered PD-like behavior. This system provides a novel tool to generate, visualize and dissect the role of these protein aggregates in PD and possibly other neurodegenerative disorders. This thesis project consists in the creation of new cellular and animal models of LBs formation in order to obtain valuable information on the aggregation and propagation process of α-syn and their role in the pathogenesis of PD: This understanding will allow the development of new effective curative treatments in this disease.

Face au vieillissement accru de la population, les maladies neurodégénératives sont désormais un problème de santé publique majeur. Dans plusieurs cas, les dépôts amyloïdes sont constitués de fibres d’IDP (« intrinsically disordered protein »), comme par exemple le peptide Aβ dans les plaques séniles et TAU dans les PHF retrouvés dans la maladie d’Alzheimer, ou encore l’Alpha synucléine dans les corps de Lewy retrouvés dans la maladie de Parkinson. Dans ces maladies, l’accumulation de fibres amyloïdes est au cœur des mécanismes de neurodégénérescence. Ainsi, comprendre les mécanismes biologiques qui mènent à la formation des fibres peut permettre d’envisager de nouveaux traitements et/ou des molécules capables de ralentir ou arrêter la progression de ces pathologies. Ces travaux de thèse vont, dans une première partie, développer les nouvelles méthodologies appliquées à l’étude des IDPs par RMN. Dans une deuxième partie, ils s’attacheront à mieux comprendre les mécanismes d’agrégation de deux IDPs très impliquées dans des maladies neurodégénératives. Le premier cas étudié sera celui de la protéine TAU, impliquée dans la maladie d’Alzheimer, et le deuxième cas sera celui d’Alpha synucléine, impliquée dans la maladie de Parkinson. / Due to population aging, neurodegenerative diseases have become a major public health problem. In many cases, the amyloid deposits are composed of IDP (Intrinsically disordered protein) fibers, as Aß peptide in senile plaques and TAU in the PHF found in Alzheimer's disease, or Alpha synuclein in Lewy bodies found in Parkinson's disease. The accumulation of amyloid fibers is at the heart of the mechanisms of neurodegeneration. The understanding of the biological mechanisms that lead to the formation of the fibers may allow novel treatments and / or molecules that slow or stop the progression of these diseases. Firstly, in this thesis, we will develop new methodologies to study IDPs by NMR. In the second part, we will seek to better understand the mechanisms of aggregation of two IDPs involved in neurodegenerative diseases. The first case will be the aggregation of TAU protein in Alzheimer's disease and the second case will be the aggregation of Alpha synuclein in Parkinson's disease.

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La maladie de Parkinson est une maladie neurologique chronique caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta. Une deuxième caractéristique neuropathologique de cette maladie est l’accumulation des agrégats intracellulaires appelés les corps de Lewy (CLs). Ces agrégats sont majoritairement formés par une protéine pré-synaptique, α-synucléine (α-syn). Cette accumulation pathologique interfère avec les voies métaboliques vitales des neurones telles que la transmission synaptique et l’activité mitochondriale, ce qui engendre la mort cellulaire. Par conséquence, éliminer les formes toxiques, diminuer l’expression de la forme native et réduire ainsi la probabilité de la formation d’agrégats pourrait être une stratégie thérapeutique d’intérêt pour le traitement de la maladie de Parkinson et d’autres désordres qui y sont reliés. Dans ce contexte, notre équipe a récemment décrit une nouvelle voie d’élimination de l’α-syn qui est catalysée par l’activité enzymatique de la kinase Polo-like kinase 2 (PLK2). Cependant, les mécanismes cellulaires ainsi que l’identité des molécules impliquées sont encore méconnus. Donc, mes travaux se sont concentrés sur l’étude de cette voie et ses différentes étapes qui mènent à enlever l’effet toxique de l’α-syn. Dans ce mémoire nous montrons que, en plus de la PLK2, la PLK3, un autre membre de la famille des PLKs, est capable de phosphoryler l’α-syn au niveau du résidu S129 et induire son élimination. En plus, nous déclarons que cette action exige une interaction physique entre les 2 protéines (α-syn et PLK2) impliquant le domaine N-terminal et qu’une étape de poly-ubiquitination est essentielle pour que ce complexe protéique se dirige vers la voie de dégradation autophagique. Cette action de la PLK2 est observée également sur des formes mutées de l’α-syn tels que α-syn A30P, α-syn A53T et d’une manière plus accentuée sur la forme mutante α-syn E46K. La caractérisation de cette voie d’élimination offre de nouvelles opportunités pour le développement des traitements qui favorisent, d’une façon spécifique et sélective, la dégradation de l’α-syn et par conséquent la réduction des formes toxiques de cette dernière. / Parkinson's disease is a chronic neurological disease characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. A second neuropathological feature of this disease is the accumulation of intracellular aggregates called Lewy bodies. These aggregates are formed by a pre-synaptic protein, α-synuclein (α-syn). This pathological accumulation interferes with the vital metabolic pathways of neurons such as synaptic transmission and mitochondrial activity, leading to cell death. Consequently, promoting the elimination of the toxic forms, reducing the expression of the native form and decreasing the probability of aggregate formation could be a therapeutic strategy of interest for the treatment of Parkinson's disease and other related disorders. Recently, we have described a novel α-syn degradation pathway that is catalyzed by the enzymatic activity of Polo-like kinase 2 (PLK2). However, the cellular mechanism and the identity of the molecules involved are still unknown. So, my work has focused on studying this pathway and its various steps that lead to remove the toxic effect of α-syn. In this thesis we show that, in addition to PLK2, PLK3, another member of the PLK family, is able to phosphorylate α-syn at S129 and induce its elimination. In addition, we declare that this action requires a physical interaction between the 2 proteins (α-syn and PLK2) involving the N-terminal domain and that a poly-ubiquitination step is essential for the autophagic degradation of the α-syn and PLK2 complex. This effect of PLK2 is also observed on mutated forms of α-syn such as α-syn A30P, α-syn A53T and is more pronounced in the case of the α-syn E46K mutant. The characterization of this elimination pathway offers new opportunities for the development of treatments that allow, in a specific and selective manner, the degradation of α-syn and thus the reduction of its toxic forms.

L'agrégation de l'α-synucléine (α-syn) est au coeur du processus pathologique observé dans la maladie de Parkinson ou l'atrophie multi systèmatisée. La β-synucléine (β-syn) ressemble à l'α-syn mais pourrait avoir un rôle neuroprotecteur en inhibant l'agrégation de l'α- syn. Le but de cette thèse était de mettre en place et de tester chez la souris une stratégie thérapeutique visant à inhiber l'agrégation de l'α-syn en faisant exprimer la β-syn humaine via des vecteurs viraux adéno-associés (AAV). Nous avons d'abord caractérisé un modèle de synucléinopathie, la souris transgénique M83. Ces souris expriment l'α-syn humaine mutée en A53T, et développent une pathologie sévère associée à l'agrégation de l'α-syn. Nos résultats confirment le fait que l'agrégation de l'α-syn peut se propager à partir de l'injection périphérique de forme agrégée de la protéine, vers le système nerveux central. De plus, ils montrent que l'accumulation de l'α-syn pathologique chez la souris M83 malade dépend de l'inoculum utilisé pour accélérer leur pathologie et du niveau d'expression de l'α-syn mutée en A53T chez ces souris. Les essais de thérapie génique réalisés dans ce modèle M83 suggèrent que, quelle que soit la stratégie d'injection du vecteur AAV utilisée, la β-syn n'a pas eu d'effet protecteur détecté contre l'agrégation de l'α-syn. Une expression durable de la protéine β-syn humaine chez les souris M83 malades inoculées avec le vecteur AAV véhiculant le gène de la β-syn a pourtant été confirmée. Cependant, la β-syn pourrait s'être agrégée dans nos conditions expérimentales, comme cela a été précédemment décrit, ce qui pourrait peut-être expliquer l'absence d'effet protecteur détecté / The aggregation of α-synuclein (α-syn) is central in the pathological process observed in Parkinson’s disease or multiple system atrophy. Β synuclein (β-syn) shares some similarities with α-syn but may have a neuroprotective effect by inhibiting the aggregation of α-syn. The goal of this thesis was to develop and to test a therapeutical strategy potentially able to inhibit the aggregation of α-syn by expressing human β-syn using adeno-associated vectors (AAV). First, we characterized a model of synucleinopathy, the M83 transgenic mouse. These mice express the human A53T mutated α-syn and develop a severe disease associated with the aggregation of α-syn. Our results confirm the ability of the aggregation of α-syn to spread through the central nervous system following a peripheral injection of aggregates of α-syn. Furthermore, they show that the accumulation of pathological α-syn in sick M83 mice depends on the inoculum used to accelerate their disease and the expression level of human A53T mutated α-syn in these mice. Gene therapy trials realized in the M83 model suggest that, regardless the strategy used to inject AAV vector, β syn did not have a protective effect against the aggregation of α-syn. A lasting expression of the human β-syn protein was however detected in sick M83 mice injected with AAV vector carrying human β-syn gene. Nevertheless, β-syn could have aggregated in our specific experimental conditions, as this has already been described, which might explain the absence of protective effect detected

La maladie de Parkinson est l’une des plus répandue dans le monde. Des analyses post mortem ont mis en évidences des inclusions dans les cerveaux des patients, composées d’α-synucléine. Plusieurs études ont visé à identifier des composés capables d’inhiber l’agrégation de cette protéine, étant donné que cette agrégation est liée à sa toxicité. Néanmoins, de nombreux composés restent encore à être identifiés afin de mettre en évidence des structures moléculaires actives partagées qui pourrait mener à la synthèse d’un principe actif. Les stilbènes sont des composés phénoliques démontrant régulièrement des activités biologiques intéressantes pour la santé. Dans cette étude, nous étudions le comportement anti-agrégatif des stilbènes monomériques (resvératrol, picéatannol) et oligomèriques (ampélopsine, viniférine, et isohopeaphénol). Les résultats présentés mettent en évidence la capacité des stilbènes à inhiber l’agrégation de l’α-synucléine et fournissent des éléments pour comprendre ce mécanisme. / Parkinson’s disease is one of the most spread neurodegenerative diseases in the world. Post mortem analyses have put in evidence small inclusion bodies in patient’s brain, composed of α-synuclein fibrils. Several studies attempted then to identify compounds that could inhibit α-synuclein aggregation, as its aggregation is linked to its toxicity. Still, numerous active compounds need to be identified in order to put on relief shared active structures that could lead to a potent drug design. Stilbenes are phenolic compounds that often display interesting health-related biological activities. In this study, the anti-aggregative behavior of stilbenes monomers (resveratrol, piceatannol) and oligomers such as ampelopsin and isohopeaphenol was assessed. The results put on evidence stilbene propensity to inhibit α-synuclein aggregation and provide an insight into their inhibition mechanisms.

La maladie de Parkinson (MP) appartient à la famille des a-synucléinopathies. Ces pathologies ont en commun d'être liées à l'a-synucléine (a-syn), protéine neuronale dont les rôles précis sont encore mal définis. Dans un contexte où des pesticides, comme le paraquat, ont été liés épidémiologiquement au déclenchement précoce de la MP chez des agriculteurs, certaines substances sont devenues des substances de référence dans les études portant sur les synucléinopathies. Le paraquat induit une pathologie parkinsonienne comprenant des agrégations de l'a-syn ou des pertes spécifiques de neurones dopaminergiques. Dans nos études nous avons premièrement mis en place un modèle d'exposition par voie orale au paraquat en utilisant l'administration. Par la suite nous avons étudié les effets de cette administration orale au paraquat sur le système nerveux entérique présent dans l'intestin de souris C57Bl/6 et transgénique TgM83. Cette lignée transgénique possède la particularité de développer spontanément une synucléinopathie, simultanément dans l'intestin et le cerveau, présentant des dépôts d'a-syn phosphorylée. L'ingestion du paraquat induit une accélération de l'apparition de la synucléinopathie entérique. Dans une seconde étude biochimique, nous montrons que l'exposition orale au paraquat induit une augmentation globale des niveaux d'a-syn totale dans le système nerveux central et entérique des souris.Nous montrons ici les effets délétères de l'exposition orale au paraquat sur l'intestin en lien avec l'a-syn, par l'accélération d'une synucléinopathie mais aussi par l'induction d'une réponse générale, cérébrale et entérique, traduite par une hausse des niveaux d'a-syn / Parkinson's disease (PD) belongs to the a-synucleinopathies family. These pathologies have in common that they are linked to a-synuclein (a-syn), a neuronal protein whose precise roles are poorly defined. Some pesticides, such as paraquat, have been epidemiologically linked to the early onset of PD in farmers; some substances have become essential in the studies of synucleinopathies. Paraquat induces parkinsonian pathologies including a-syn aggregations or specific dopaminergic neurons loss. In our studies, we first set up a model of oral exposure to paraquat by drinking water. Subsequently, we studied the effects of this oral administration to paraquat on the enteric nervous system of the intestine of C57Bl/6 and TgM83 transgenic mice. This transgenic line has the peculiarity of simultaneously and spontaneously developing a synucleinopathy in the intestine and in the brain, displaying deposits of phosphorylated a-syn. The oral ingestion of paraquat induces acceleration in the appearance of enteric synucleinopathy. In a second biochemical study, we show that oral exposure to paraquat induces an overall increase in total a-syn levels in the central and enteric nervous systems of mice.Our results show the deleterious effects of paraquat oral administration on the intestine in relation to a-syn, by the acceleration of synucleinopathy but also by the induction of a widespread cerebral and enteric response, shown by an increase in cellular levels of a-syn

Les membranes cellulaires sont constamment remodelées par le bourgeonnement et la fusion de vésicules assurant le transport entre les différentes organelles. De nombreuses protéines périmembranaires orchestrent ce trafic vésiculaire. Les hélices amphipathiques jouent un rôle important dans le mécanisme d'interaction de certaines de ces protéines avec les membranes. A la différence de domaines protéiques reconnaissant spécifiquement un lipide, les hélices amphipathiques reconnaissent plus globalement la physicochimie d'une membrane (forme, charge...). GMAP-210 est une très longue protéine golgienne qui agit comme corde moléculaire grâce à sa structure en coiled-coil. Le laboratoire avait montré que l'extrémité N-terminale de GMAP-210 possède un motif ALPS, une hélice amphipathique singulière sensible à la courbure membranaire. Les motifs ALPS sont caractérisés par l'absence de résidus basiques, l‘interaction avec les membranes ne repose donc que sur l'hydrophobicité. Pour compenser ce déficit, la liaison des motifs ALPS n'a lieu qu'au contact de membranes fortement courbées. Dans le cas de GMAP-210, le motif ALPS permettrait de capturer des vésicules de transport. J'ai démontré que l'autre extrémité de la corde interagit avec Arf1GTP sur des membranes. Cette interaction est conditionnée par le contact avec la surface membranaire d'une petite hélice amphipathique située en aval du domaine d'interaction avec Arf1. De façon remarquable, l'interaction entre Arf1GTP et le domaine C-terminal de GMAP-210 est régulée indirectement par la courbure membranaire. En effet, ArfGAP1, identifiée comme la première protéine possédant un motif ALPS, est capable de dissocier rapidement le complexe de membranes courbées. Par conséquent, GMAP-210 connecte des membranes courbées, par exemple des vésicules, à des membranes planes recouvertes d'Arf1, par exemple des citernes golgiennes. Le mécanisme vectoriel d'attachement de membranes par GMAP-210 repose donc sur de nombreuses hélices amphipathiques (deux dans GMAP-210, une dans Arf1 et une dans ArfGAP1) et permettrait d'expliquer le confinement des vésicules de transport autour de l'appareil de Golgi. Des mesures de vitesse spontanée de désorption membranaire des extrémités de GMAP-210 suggèrent que l'attachement des membranes est très dynamique et a lieu sur des échelles de temps de la seconde à la minute. Le motif ALPS n'est pas le seul motif amphipathique sensible à la courbure. L'alpha-synucléine, une protéine synaptique célèbre pour son implication dans la maladie de Parkinson, contient également une hélice amphipathique senseur de courbure. Curieusement, la physicochimie du motif ALPS et de l'alpha-synucléine est opposée tant pour la face polaire que pour la face hydrophobe. L'alpha-synucléine a une périodicité atypique (3/11), une face polaire zwittérionique et une face hydrophobe présentant de petits résidus et des thréonines. En utilisant des liposomes de composition et de rayon définis, j'ai montré que la charge négative des membranes est un paramètre discriminant dans la liaison aux membranes des deux protéines. En effet, à la différence de GMAP-210, l'alpha-synucléine est strictement dépendante d'un taux élevé de phospholipides anioniques. Par contre, ces protéines sont toutes les deux très sensibles à la nature des chaînes insaturées des phospholipides. Les premiers résultats montrent néanmoins des subtilités intéressantes : l'alpha-synucléine semble mieux adaptée que GMAP-210 à une membrane polyinsaturée comme l'est celle des vésicules synaptiques. En conclusion, de nombreuses hélices amphipathiques sont impliquées dans le trafic vésiculaire. Elles présentent de nettes différences dans leur physicochimie suggérant une adaptation à des membranes cellulaires (de composition lipidique et de rayon définis) par des mécanismes qui restent largement à explorer.

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire, une structure sous-corticale des ganglions de la base. Si la majorité des cas sont sporadiques, l'exposition à des facteurs environnementaux (composés organochlorés, pesticides) ou des mutations associées à une quinzaine de gènes (dardarine, -synucléine,...) sont connues pour être à l'origine de formes de cette maladie. L'-synucléine est également le composant majoritaire des corps de Lewy, inclusions cytoplasmiques présentes dans les neurones DA des patients. Pendant mon doctorat, je me suis attachée à comprendre les mécanismes de neurotoxicité induits par le paraquat (PQ), un générateur de stress oxydatif impliqué dans la MP. Ces recherches ont mis en évidence une implication de la signalisation DA dans la toxicité du PQ dans le système nerveux central par l'activation aberrante d'un récepteur DA de type D1, impliqué dans la mémoire chez la drosophile. L'inactivation de ce récepteur dans les neurones glutamatergiques protège significativement les drosophiles contre les effets délétères du PQ. Je me suis également intéressée aux mécanismes de neurotoxicité de l'-synucléine chez la drosophile et son rapport avec le stress oxydatif. Cette étude m'a mené au développement d'une technique de mise en culture du système nerveux central entier de drosophile permettant l'étude des effets progressifs de l'-synucléine sur la dynamique vésiculaire dans les axones DA par des expériences de FRAP. Ces travaux contribuent à mieux comprendre les rapports entre dopamine et stress oxydatif dans la pathogenèse de la MP