Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T22:53:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Glêzia Renata da Silva Lacerda.pdf: 4644374 bytes, checksum: 02485394848694860d6eb63dbaec6f39 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T17:22:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Glêzia Renata da Silva Lacerda.pdf: 4644374 bytes, checksum: 02485394848694860d6eb63dbaec6f39 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Glêzia Renata da Silva Lacerda.pdf: 4644374 bytes, checksum: 02485394848694860d6eb63dbaec6f39 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES / Streptomyces é produtor de diversos metabólitos secundários, incluindo L-asparaginase, uma enzima que hidrolisa a asparagina em ácido aspártico e amônia. Logo, tem sido utilizada como agente quimioterápico no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, pois estas células não produzem asparagina e dependem do aminoácido livre para a síntese proteica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade citotóxica, genotóxica e imunomodulatória da L-asparaginase produzida por Streptomyces ansochromogenes UFPEDA-3420. A enzima foi produzida a partir da determinação dos parâmetros ideais de cultivo do micro-organismo. Sua atividade foi determinada pela dosagem de amônia liberada por Nesslerização. O extrato bruto foi purificado por métodos cromatográficos. O peso molecular foi determinado por eletroforese SDS-PAGE. O efeito citotóxico da L-asparaginase foi observado frente às linhagens de células tumorais: HEp-2 (carcinoma de laringe), NCIH-292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão), MOLT-4 (Leucemia linfoblástica humana), K562 (leucemia mielóide), HL-60 (leucemia aguda promielocítica) e MCF-7 (adenocarcinoma de mama), utilizando o ensaio do MTT. Os efeitos genotóxicos foram determinados pelos Testes Cometa Alcalino e de Micronúcleo nas linhagens tumorais NCIH-292, MCF-7 e MOLT-4 e em células normais PBMC (Células Mononucleadas de Sangue Periférico), utilizando as concentrações 12,5, 25 e 50 μg/mL de L-asparaginase, como controle positivo a Doxorrubicina na concentração da sua IC₅₀ para cada célula tumoral: 0,5 μg/mL (NICH-292), 0,04 μg/mL (MOLT-4) e 0,2 μg/mL (MCF-7) e como controle negativo as células sem tratamento. Os parâmetros ideais de cultivo foram fermentação em meio M9, 48 horas, pH=6, 37ºC e rendimento máximo de 743.29 UI/mL. A enzima foi purificada até homogeneidade com fator de purificação 6,06, rendimento 27,68% da atividade inicial e atividade específica final 35.205,76 UI/mg. A enzima purificada apresentou peso molecular de 63,99 kDa, com atividade catalítica ótima em pH=7 e 40ºC. L-asparaginase apresentou valores de Km de 3,224 mM e Vmax de 161,29 UI/min. Quanto aos efeitos citotóxicos, apresentou IC₅₀ de 25 μg/mL frente à linhagem MOLT-4. Foi observado que esta substância possui efeitos genotóxicos sobre as linhagens estudadas. No parâmetro Índice de Danos, as três linhagens tumorais apresentaram resultados significativos para todas as concentrações testadas quando comparadas com células não tratadas, exceto na concentração de 12,5 μg/mL na linhagem MOLT-4. No Teste do micronúcleo, foi observado que em todas as células houve indução à formação de micronúcleos, coferindo efeito genotóxico a enzima. Isso demonstra que nas linhagens MOLT-4 e PBMC, tanto o parâmetro células micronucleadas quanto a frequência de micronúcleos aumentaram de acordo com o aumento da concentração de L-asparaginase, demonstrando um efeito dose/resposta positivo. L-asparaginase induziu a ativação e proliferação de linfócitos TCD8+ e produziu níveis elevados de TNF-α, IFN-γ, IL-2 e IL-10 em 24 horas. O presente estudo possui grande relevância científica, pois consiste no primeiro relato de produção de L-asparaginase por Streptomyces ansochomogenes UFPEDA-3420, sua ação genotóxica em células tumorais e normais e atividade imunomodulatória, de forma inédita. Esse fato é importante, pois L-asparaginase tem sido empregada nas terapias convencionais de controle e tratamento do câncer. Dessa forma, esta enzima configura-se como molécula promissora para utilização em modelos in vivo e para aprofundar testes pré-clínicos. / Streptomyces is a producer of several secondary metabolites, including L-asparaginase, an enzyme that hydrolyzes asparagine in aspartic acid and ammonia. Therefore, it has been used as chemotherapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, since these cells doesn’t produce asparagine and depend on free amino acid for protein synthesis. The objective of this study was to evaluate the cytotoxic, genotoxic and immunomodulatory activity of L-asparaginase produced by Streptomyces ansochromogenes UFPEDA-3420. The enzyme was produced from the determination of the ideal microorganism culture parameters. Its activity was determined by the dosage of ammonia released by Nesslerization. The crude extract was purified by chromatographic methods. The molecular weight was determined by SDS-PAGE electrophoresis. The cytotoxic effect of L-asparaginase was observed against tumor cell lines: HEp-2 (laryngeal carcinoma), NCIH-292 (mucoepidermoid carcinoma of the lung), MOLT-4 (human lymphoblastic leukemia), K562(myeloid leukemia), HL-60 (promyelocytic acute leukemia) and MCF-7 (breast adenocarcinoma) using the MTT assay. The genotoxic effects were determined by Alkaline Comet and Micronucleus Tests in NCIH-292, MCF-7 and MOLT-4 tumor cell lines and in PBMC (Mononuclear Peripheral Blood Cells), using the concentrations 12.5, 25 and 50 μg/mL of L-asparaginase, as a positive control to Doxorubicin at the concentration of its IC50 for each tumor cell: 0.5 μg/mL (NICH-292), 0.04 μg/mL (MOLT-4) and 0.2 μg/mL (MCF-7) and as a negative control the cells without treatment. The ideal culture parameters were fermentation in M9 medium, 48 hours, pH=6.37 and maximum yield of 743.29 IU/mL. The enzyme was purified to homogeneity with purification factor 6.06, yield 27.68% of the initial activity and final specific activity 35,205.76 IU/mg. The purified enzyme had a molecular weight of 63.99 kDa, with optimum catalytic activity at pH=7 and 40ºC. L-asparaginase had values of Km of 3.224 mM and Vmax of 161.29 IU/min. Regarding the cytotoxic effects, IC50 of 25 μg/mL was presented in relation to the MOLT-4 lineage. It was observed that this substance has genotoxic effects on the studied strains. In the parameter Damage Index, the three tumor lines presented significant results for all the concentrations tested when compared to untreated cells, except in the concentration of 12.5 μg/mL in the MOLT-4 lineage. In the Micronucleus test, was observed that in all the cells there was induction to the formation of micronuclei, cofering genotoxic effect to the enzyme. This demonstrates that in the MOLT-4 and PBMC lines, both the micronucleate parameters and micronucleus frequency increased as the L-asparaginase concentration increased, demonstrating a positive dose/response effect. L-asparaginase induced the activation and proliferation of TCD8+ lymphocytes and produced elevated levels of TNF-α, IFN-γ, IL-2 and IL-10, in 24 hours. The present study has great scientific relevance, since it consists of the first report of production of L-asparaginase by Streptomyces ansochomogenes UFPEDA-3420, its genotoxic action in normal and tumor cells and immunomodulatory activity, in an unprecedented way. This fact is important because L-asparaginase has been used in conventional cancer treatment and control therapies. Thus, this enzyme is configured as a promising molecule for use in vivo models and to deepen preclinical tests.

As actinobactérias são uma reconhecida fonte de metabólitos secundários bioativos com grande diversidade estrutural e funcional. Dentre elas, o gênero Streptomyces é sem dúvida o mais explorado, correspondendo a cerca de 75% dos metabólitos secundários estudados, e por dois terços dos antibióticos conhecidos. Dessa forma, ainda é crescente a necessidade de novos herbicidas com perfil de baixa toxicidade ambiental e novos mecanismos de ação, para a substituição de produtos que são utilizados extensivamente há anos. Grandes avanços tecnológicos têm sido alcançados em termos de instrumentação analítica nas últimas décadas, tornando a espectrometria de massas a técnica mais eficiente e robusta na identificação de metabólitos secundários, principalmente quando acoplada a técnicas cromatográficas de ultra eficiência (UHPLC-MS). Nessa dissertação foi explorada a diversidade metabólica de actinobactérias isoladas do bioma Caatinga para a identificação de metabólitos secundários com atividade fitotóxica. Foram produzidos 166 extratos brutos de actinobactérias, das quais, 27 apresentaram algum nível de atividade fitotóxica contra Lemna minor. Devido pronunciada bioatividade (MIC = 6,25 ?g) o extrato bruto da actinobactéria, CAAT 7-52, foi selecionado para desreplicação, caracterização e fracionamento guiado por bioensaios, e, ao mesmo tempo, um estudo taxonômico foi realizado para determinar o posicionamento filogenético do novo isolado. A análise da sequência do gene 16S rRNA suportou a classificação da linhagem no gênero Streptomyces e mostrou que CAAT 7-52 formou uma linha filética distinta junto com a linhagem tipo de Streptomyces actinomycinicus, com um valor de identidade da sequência de 99,0%. No extrato bruto de CAAT 7-52 foi identificada a Albociclina como responsável pela atividade fitotóxica (MIC = 3,12 ?g), assim como alguns compostos análogos. O monitoramento da massa micelial seca e produção de Albociclina mostrou uma maior produção do composto ativo aos 21 dias de crescimento. Esse extrato foi submetido a ensaios de inibição de germinação, onde apresentou atividade contra sementes de buva (Conyza canadensis) (MIC = 12,5 ?g), alface (Lactuca sativa) e rúcula (Eruca sativa). Variações no meio de cultivo mostraram uma produção seletiva de Albociclina nos meios de cultivo PMB e Czapeck-GL. Ensaios de fitotoxicidade contra Lemna minor, utilizando o fermentado do meio PMB sem extração com solventes orgânicos, mostrou atividade em uma diluição de 20%. Portanto, foi possível demostrar através desse estudo o grande potencial das actinobactérias na produção de metabólitos secundários bioativos e da espectrometria de massas como técnica analítica na identificação dos compostos ativos. / Actinobacterias are a well know source of bioactive secondary metabolites with great structural and functional diversity. Among them, the Streptomyces genus is certainly the most explored, corresponding to about 75% of studied secondary metabolites, and for two thirds of known antibiotics. Thus, there is still a growing need for new herbicides with low environmental toxicity e new modes of action, for the replacement of products that have been broadly used for years. Great technological progress has been achieved in analytical instrumentation in the last few decades, making mass spectrometry the most efficient and robust technique to identify secondary metabolites, mainly when accoupled to ultra-performance chromatographic techniques (UHPLC-MS). In this essay, was explored the metabolic diversity of the actinobacterias isolated from the Caatinga biome to identification of secondary metabolites with phytotoxic activity. Were produced 166 crude extracts from actinobacterias, from this, 27 showed some phytotoxic activity against Lemna minor. Due to noticeable bioactivity (MIC = 6,25 ?g) the crude extract from actinobacteria CAAT 7-52, was selected to dereplication, characterization and bioassay guided fractionation, and, at the same time, a taxonomic study was carried out to determinate the phylogenetic location of the new isolated. The analysis of 16S rRNA gene sequence supported the lineage classification on the genus Streptomyces and established that CAAT 7-52 assembled a distinct phyletic line together with the lineage type of Streptomyces actinomycinicus, with an identity sequence value of 99,0%. In the crude extract CAAT 7-52, Albocycline was identified as the responsible for the phytotoxic activity (MIC = 3,12 ?g), so as some analogous compounds. The mycelial dry mass and Albocycline production monitoring revealed a major production of the active compound at 21 days of growth. This extract was subjected to germination inhibition assays, where revealed activity against horseweed (Conyza canadensis) (MIC = 12,5 ?g), lettuce (Lactuca sativa) and arugula (Eruca sativa) seeds. Variations in the culture media showed a selective production of Albocycline in the PMB and Czapeck-GL culture media. Phytotoxicity assays against Lemna minor, applying the fermented PMB media without organic solvents extractions, revealed activity with a 20% dilution. Therefore, through this study was able to demonstrate the great potential of the actinobacterias in the production of bioactive secondary metabolites and the mass spectrometry as analytical technique to identification of the active compounds.

A crescente resistência dos micro-organismos patogênicos aos fármacos já existentes gera intensa demanda por novos agentes terapêuticos. Em contrapartida, a eficiência na descoberta de compostos com novas estruturas químicas diminuiu nos últimos anos. Tendo em vista a vasta biodiversidade existente de micro-organismos, a redução da eficiência na descoberta de novos produtos naturais não indica que todos compostos existentes já foram descritos, mas sim que as metodologias para isolamento dos mesmos devem ser aperfeiçoadas e diversificadas, e novos nichos devem ser explorados. Esta tese compreende três capítulos, que trazem abordagens que podem ser utilizadas na busca por produtos naturais. O capítulo 1 aborda a aplicação de conhecimentos de biologia molecular na pesquisa de produtos naturais, através da metagenômica. O capítulo 2 aborda o conceito de química ecológica para estimular o metabolismo secundário, através da utilização de interações microbianas. O capítulo 3 aborda o uso de genome mining para entender a capacidade metabólica de uma linhagem bacteriana, bem como o uso de variações nos parâmetros da cultura para alterar o metabolismo desta. Metagenômica: a triagem anti-parasitária das bibliotecas metagenômicas detectou clones bioativos contra Leishmania major. As análises químicas e biológicas das culturas destes clones não permitiram a identificação dos compostos responsáveis pelas atividades observadas. Esta abordagem apresenta grandes desafios técnicos e tem passado por ajustes envolvendo sequenciamento e bioinformática para aumentar a taxa de sucesso em seu uso. Interações microbianas: esta metodologia mostrou-se promissora para a busca por compostos bioativos, tendo em vista que diversos pares exibiram nova atividade antibiótica, corroborando a hipótese que interações microbianas podem levar à expressão diferenciada do metabolismo secundário. Foi escolhida para caracterização química e biológica a interação entre uma actinobactéria rara (Krasilnikovia sp. T082) e uma actinobactéria endossimbionte de besouro (Streptomyces sp. SPB78). Esta interação é robusta e estimula a biossíntese de um antibiótico polar capaz de inibir o crescimento de uma bactéria multirresistente. Diversas técnicas foram testadas para o isolamento do composto indutor e do antibiótico induzido. Este processo foi desafiador devido ao caráter polar de ambos compostos e pelo fato da atividade antibiótica ser instável. Foi demonstrado que o antibiótico induzido é capaz de inibir o crescimento do micro-organismo indutor, sugerindo importância ecológica deste composto. A utilização desta abordagem metodológica permitiu a identificação de uma linhagem pertencente a um gênero de actinobactéria rara que nunca teve seu metabolismo secundário estudado (Krasilnikovia). Isto foi realizado através da investigação de seu genoma e também através do isolamento de compostos produzidos por esta linhagem. Esta linhagem demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários, apresentando pelo menos 21 potenciais clusters gênicos biossintéticos detectados pelo antiSMASH em seu genoma. Esta linhagem foi cultivada em dois meios de cultura (ISP2 e TSB) e diferentes metodologias de extração foram empregadas. O metabolismo secundário desta linhagem é expresso de maneira diferente de acordo com a metodologia de cultivo, evidenciando a importância da variação da composição do meio de cultura para o acesso da real capacidade metabólica de microorganismos. Foram identificadas algumas dicetopiperazinas, que são conhecidas por seu amplo espectro de atividades biológicas, e três compostos pertencentes a uma classe de peptídeos nãoribossomais não usuais com atividade antibiótica, que possuem estrutura química complexa e incomum para produtos naturais / Increasing drug resistance among microbial pathogens is a public health threat; therefore, new antibiotics are needed. On the other hand, the rate of discovering new compounds has diminished. Considering the wide biodiversity of microorganisms, reduced efficiency on the discovery of new natural products does not indicate that all existing compounds have been described, but that methods for isolation should be improved and diversified and new niches should be explored. This thesis comprises three chapters that demonstrate approaches that can be used in the search for natural products. Chapter 1 demonstrates the application of molecular biology tools on the search for natural products through metagenomics. Chapter 2 discusses the concept of chemical ecology for the stimulation of secondary metabolism by the use of microbial interactions. Chapter 3 discusses the use of genome mining to understand the metabolic capacity of a bacterial strain as well as the use of different culture parameters to alter bacterial metabolism. The anti-parasitic metagenomic screening on metagenomic libraries detected bioactive clones against L. major. Chemical and biological analysis of cultures of these clones did not permit identifying the compounds responsible for the observed activities. This approach faces diverse technical challenges and is currently being improved by the use of sequencing and bioinformatics analysis in order to increase its hit rate. Microbial interactions: this approach has shown to be promising in the search for bioactive compounds, considering that several pairs exhibited new antibiotic activity, supporting the hypothesis that microbial interactions can stimulate differential expression of secondary metabolism. It was chosen for chemical and biological characterization the interaction between a rare actinobacteria (Krasilnikovia sp. T082), which belongs to a genus that its secondary metabolism has not yet been studied in the literature, and an endosymbiont actinobacteria of beetle (Streptomyces sp. SPB78). This interaction is robust and stimulates the biosynthesis of a polar antibiotic capable of inhibiting the growth of multi-resistant bacteria. Several techniques have been tested for the isolation process of the inducer compound and the induced antibiotic. This process has been particularly challenging due to the polar character of both compounds, and because the antibiotic activity is unstable. It has been shown that the induced antibiotic is capable of inhibiting the growth of the inducer microorganism, suggesting an ecological importance of this compound. The use of this co-culture approach led to the identification of a strain belonging to a rare actinobacteria genus whose secondary metabolism has never been studied before (Krasilnikovia). This was accomplished through sequencing and analysis of its genome and also by isolating compounds produced by this strain (chapter 3). This strain has shown great potential for the production of secondary metabolites, exhibiting at least 21 biosynthetic gene clusters detected by antiSMASH in its genome, and only four of them showed high similarity to any known gene cluster. This strain was cultured in two different culture media (ISP2 and TSB), and different methods of extraction were used. The secondary metabolism of this strain is expressed differently according to the method of cultivation, showing the importance of variation in the composition of the culture medium to access the actual metabolic capacity of microorganisms. Some diketopiperazine were isolated, which are known for their wide spectrum of biological activities, and also three compounds belonging to a class of non-ribosomal peptides known for their high bioactivity, which have complex and unusual chemical structures for natural products

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000425499-Texto+Completo-0.pdf: 1339391 bytes, checksum: 53a9d3961a418fb135035cdccc7d9188 (MD5) Previous issue date: 2010 / Araucaria angusifolia (Bertol. ) Kuntze, known as Brazilian pine, is an endangered species with great ecological and economic importance. Although many efforts have been made to establish commercial plantations of this species, it grows slowly and unevenly, with high mortality. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR), including some Strepromyces (actinobacteria), represent a class of non-pathogenic soil microorganisms and have a beneficial effect on plant growth. This study evaluated the effect of three autochthonous Streptomyces spp. isolates (PM1, PM4, and PM9) on the early development and metabolism of 50-day-oid A. angustifolia seedlings. The enzymatic activity of phenylalanine ammonialyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), and peroxidase (POX), and the levels of phenolic compounds, flavonoids, and chlorophyll were determined in extracts of roots and leaves from seedlings. Assays were carried out 1, 3 and 9 days after the roots were inoculated with each isolated. Length and fresh mass of shoots and roots as well as the volume and density of roots were evaluated at 100 days after seedlings inoculation. All Streptomyces spp. evaluated showed rhizospheric competence and produce indole-3-acetic acid (IAA). The activities of PPO and POX exhibited a tissue-temporal regulation in the presence of the isolates; however the levels of phenolics, flavonoids and chlorophylls did not change in the period analyzed. PAL activity was reduced only 9 days after root inoculation with PM9. The volume, density and length of roots changed in seedlings that were in contact with isolates for 100 days. The isolate PM9 caused significant changes in plant metabolism, increasing the shoot increment. / Araucaria angustifolia, conhecida como Pinheiro Brasileiro, é uma espécie ameaçada de extinção de grande importância ecológica e econômica. Embora muitos esforços foram feitos para estabelecerem plantios comerciais desta espécie, ela apresenta crescimento lento e heterogêneo, com alta mortalidade. As plant-growth-promoting rhizobacteria (PGPR) representam uma classe de bactérias de solo não patogênicas que promovem efeito benéfico no crescimento do vegetal, destacando-se as actinobactérias do gênero Streptomyces. O trabalho avaliou o efeito de três isolados autóctones de Streptomyces spp. (PM1, PM4 e PM9) no desenvolvimento e no metabolismo inicial de plântulas de Araucaria angustifolia com 50 dias de idade. A atividade enzimática da fenilalanina amônio-liase (FAL), polifenol oxidase (PPO), peroxidase (POX) e os níveis de compostos fenólicos, flavonóides e clorofila foram determinados em extratos de raízes e folhas das plântulas. As análises foram realizadas em 1, 3 e 9 dias após a inoculação das raízes com as rizobactérias. O comprimento e a massa fresca da parte aérea e radicular assim como o volume e densidade das raízes foram avaliados após 100 dias da inoculação. Todos Streptomyces spp. apresentaram competência rizosférica e a capacidade de produzir ácido indol-3-acético (AIA). As atividades da PPO e POX exibiram regulação tecido-temporal na presença dos isolados; entretanto não foram alterados no período analisado os níveis de fenólicos, flavonóides e clorofila. A atividade da FAL foi reduzida somente 9 dias após a inoculação do isolado PM9. O volume, densidade e comprimento das raízes foram alterados nas plântulas inoculadas com as rizobactérias durante 100 dias. PM9 foi o isolado que promoveu as maiores alterações no metabolismo vegetal, aumentando o incremento da parte aérea.

Submitted by MARCELO MARUCCI PEREIRA TANGERINA null (marcelomptang@hotmail.com) on 2016-07-09T22:03:34Z No. of bitstreams: 1 Tese ABNT Marcelo Tangerina Wagner Vilegas CD.pdf: 3984472 bytes, checksum: 993744f837a77327c951b1988896f63c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-12T17:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tangerina_mmp_dr_araiq.pdf: 3984472 bytes, checksum: 993744f837a77327c951b1988896f63c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T17:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tangerina_mmp_dr_araiq.pdf: 3984472 bytes, checksum: 993744f837a77327c951b1988896f63c (MD5) Previous issue date: 2016-06-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A fauna acompanhante da pesca do camarão inclui uma série de invertebrados marinhos que são descartados por não ter valor comercial. A fim de tentar acrescentar algum valor a este material, foi analisada a composição química da estrela-do-mar Luidia senegalensis coletada na costa brasileira como consequência da aplicação da pesca de arrasto. A fim de avaliar sua composição química, foi utilizada uma combinação de extração em fase sólida (SPE) seguida de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a espectrômetro de massas equipado com fonte de ionização por eletrosptray e analisador ion-trap linear (UPLCESI- IT-MSn). Luidia senegalensis contém asterosaponinas, que são esteroides glicosilados sulfatados contendo cinco e seis unidades de açúcar, além de poliidroxiesteroides. Este estudo mostrou a presença de compostos importantes e potencialmente bioativos em invertebrados associados à fauna acompanhante da pesca do camarão, usando um método rápido e eficiente. Normalmente descartada, a fauna acompanhante contém muitos invertebrados que podem hospedar uma grande variedade de gêneros de bactérias, algumas das quais com potencial de produzir produtos naturais bioativos com aplicações biotecnológicas. Assim, para utilizar um material normalmente descartado, foi explorado o potencial biotecnológico de bactérias cultiváveis de duas espécies de invertebrados abundantes na fauna acompanhante, o gastrópode Olivancillaria urceus e a estrela-do-mar Luidia senegalensis. Uma amostra de sedimento da mesma área de coleta também foi investigado. Utilizando múltiplas abordagens de isolamento 134 isolados foram obtidos a partir dos invertebrados e do sedimento. Sequenciamento parcial da subunidade de rRNA (16S) revelou que os isolados pertenciam aos filos Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria, distribuídos em 28 gêneros. Vários gêneros conhecidos pela sua capacidade de produzir produtos naturais bioativos (Micromonospora, Streptomyces, Serinicoccus e Verrucosispora) foram obtidos a partir das amostras estudadas. Para avaliar as bactérias isoladas quanto à sua capacidade para produzir metabólitos bioativos todas as cepas foram fermentadas e os extratos de fermentação analisados por LC-HRMS e testados em ensaio de atividade antimicrobiana. Quatro cepas apresentaram atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e Staphylococcus warneri. A produção de metabólitos secundários por bactérias isoladas da fauna acompanhante também foi avaliada por uma abordagem metabolômica utilizando LC-HRMS, onde foi avaliado como as diferenças na composição dos meios de cultura podem alterar a produção de substâncias. Utilizou-se a metabolômica como uma ferramenta para investigar a produção de abyssomicinas, um agente anticâncer, e outros metabólitos secundários em três cepas do actinomiceto raro Verrucosispora maris, isoladas a partir de uma amostra de sedimento e associadas à estrela-do-mar Luidia senegalensis de Ubatuba - SP, Brasil. Nove composições diferentes de meios de cultura foram avaliadas e verificou-se que, dentre todas as cepas, somente RKMT_111 foi capaz de produzir abyssomicinas. O estudo da composição do meio de cultura revelou que a produção de abyssomicinas só foi possível em BFM-11m. Embora as três cepas pertençam à mesma espécie e são provenientes da mesma localização, é notável que cada isolado apresentou diferente capacidade de produção de metabólitos secundários. Os produtos de fermentação de Erythrobacter vulgaris foram avaliados utilizando técnicas de HPLC preparativo, LC-HRMS e RMN. A cepa foi isolada pelo método dry-stamp de uma amostra de sedimento marinho da costa de Ubatuba-SP, Brasil. Depois de sequenciamento completo do rRNA (16S) e identificação, o isolado foi fermentado em larga escala, seu caldo de fermentação extraído por solvente e os compostos purificados por HPLCMS. Análise de LC-HRMS e RMN dos compostos isolados levou à identificação de dois novos derivados do ácido cólico, ácido 3-acetil-glicocólico e o ácido 3-acetilglicodesoxicólico. As substâncias obtidas podem ter sido produzidas por biotransformação do ácido glicocólico e ácido desoxicólico, respectivamente, já presentes no meio de cultivo. Este é o primeiro relato de tais compostos e também a primeira observação de uma acilação realizada por um isolado marinho de Erythrobacter vulgaris. / The by-catch fauna of the shrimp fishery includes a number of marine invertebrates that are discarded because they do not have commercial value. In order to try to add some value to these materials, we analyzed the chemical composition of the starfish Luidia senegalensis collected in the Brazilian coast as a consequence of the trawling fishery method. In order to access their chemical composition, we used a combination of solid phase extraction (SPE) followed by ultra performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-IT-MSn). Luidia senegalensis contains asterosaponins, which are sulphated glycosilated steroids, containing five and six sugar moieties, in addition to polyhydroxysteroids. This study helped us to support the presence of important and potentially bioactive compounds in invertebrates associated to the by-catch fauna of the shrimp fishery, using a fast and efficient method. Typically discarded, by-catch contains many invertebrates that may host a great variety of bacterial genera, some of which may produce bioactive natural products with biotechnological applications. Therefore, to utilize by-catch that is usually discarded we explored the biotechnological potential of culturable bacteria of two abundant by-catch invertebrate species, the snail Olivancillaria urceus and the sea star Luidia senegalensis. Sediment from the collection area was also investigated. Utilizing multiple isolation approaches 134 isolates were obtained from the invertebrates and sediment. Small subunit rRNA (16S) gene sequencing revealed that the isolates belonged to Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria phyla and were distributed among 28 genera. Several genera known for their capacity to produce bioactive natural products (Micromonospora, Streptomyces, Serinicoccus and Verrucosispora) were retrieved from the invertebrate samples. To query the bacterial isolates for their ability to produce bioactive metabolites all strains were fermented and fermentation extracts profiled by LC-HRMS and tested for antimicrobial activity. Four strains exhibited antimicrobial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus warneri. The production of secondary metabolites was assessed using a LC-HRMS-based metabolomics approach, where it was evaluated how differences in media composition can alter the production of chemical compounds. We used metabolomics as a tool to investigate the production of abyssomicins, an anticancer agent, and other secondary metabolites in three strains of the rare actinomycete Verrucosispora maris, all marine isolates from a sediment sample and associated to a starfish from the species Luidia senegalensis of Ubatuba – SP, Brazil. Nine different media compositions were evaluated and it was found that, among all strains, only RKMT_111 was capable of producing abyssomicins. The media composition study revealed that the production of abyssomicins was only achievable in BFM-11m. Although the three strains belong to the same species and the same location, it is worthwhile noticing that each isolate showed different capability for production of secondary metabolites. The products of fermentation of Erythrobacter vulgaris were evaluated using preparative HPLC, LC-HRMS and NMR techniques. Bacterial strain was isolated by drystamp method from a marine sediment sample from the coast of Ubatuba-SP, Brazil. After fully 16S rDNA sequence and identification, the marine isolate was fermented in large-scale, extracted and the compounds purified through HPLC-MS. Analysis of LC-HRMS and NMR of the isolated compounds led to the identification of two new cholic acid derivatives, 3- acetyl-glycocholic acid and 3-acetyl-glycodeoxycholic acid. Both new compounds may have been produced by the biotransformation of glycocholic acid and deoxycholic acid, respectively, already present in the cultivation medium. This is the first report of such compounds and also the first time an acylation has been observed for an Erythrobacter vulgaris marine isolate. / FAPESP: 2011/23159-0

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-17T14:07:41Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_GLÊZIA.pdf: 1693043 bytes, checksum: d0c6623f9a8267d15224a0f2f35c2d3e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:07:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_GLÊZIA.pdf: 1693043 bytes, checksum: d0c6623f9a8267d15224a0f2f35c2d3e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Este trabalho tem como objetivo estudar a diversidade microbiana da rizosfera de Caesalpinia pyramidalis Tul. Foram isoladas 68 linhagens, sendo 52,9% (36) na temperatura de 37°C e 47,05% (32) a 45°C. As linhagens identificadas pertencem ao gênero Streptomyces. O Teste de Difusão em Ágar das linhagens em estudo para bactérias Gram positivas, Gram negativas e fungos revelou que 11 (16%) apresentaram atividade antimicrobiana. As isoladas a 37°C, 25% (9/36), apresentaram atividade para Fusarium moniliforme, com halos de inibição entre 26 e 28 mm, e para Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus MRSA, com halos de inibição de 19 a 22 mm. Dos isolados a 45°C apenas 3 (9,4%) apresentaram halos de inibição entre 16 a 23 mm para F. moniliforme e Candida albicans. O ensaio secundário selecionou duas linhagens com atividade antimicrobiana para Gram positivas com halos de inibição de 28 mm. A linhagem mais promissora foi identificada por técnicas moleculares como Streptomyces gougerotiicom 95% de similaridade. A extração dos metabólitos bioativos da biomassa desta linhagem foi realizada com etanol e do líquido metabólico com acetato de etila. O extrato bruto etanólico apresentou CMI de 0,97 μg/mL para S. aureus MRSA e B. subtilis, enquanto o extrato bruto de acetato de etila apresentou CMI de 3,9 μg/mL para S. aureus e S. aureus MRSA. A prospecção química evidenciou presença de flavonóides, mono/sesquiterpenos, proantocianidina, triterpenos e esteróides nos extratos brutos. Deste modo, comprova-se que solos pouco férteis como o da Caatinga ocorrem micro-organismos importantes para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos.

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_ClaudiaBeatrizAfonsode_D.pdf: 13721671 bytes, checksum: f6de614ca80b5ec0d0c5e900e92b347b (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico / Abstract: O ambiente marinho representa uma importante fonte de diversidade biológica com grande potencial para descoberta de novos metabólitos secundários biologicamente ativos. Dentro desse ambiente, pode-se destacar os actinomicetos marinhos, cujos estudos podem contribuir para a melhor compreensão de suas funções ecológicas e para seu uso como uma fonte importante de novos metabólitos. A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa e a metodologia de MLSA, ferramenta alternativa em estudos de sistemática microbiana, pode ser uma técnica importante na caracterização de actinomicetos. Novos metabólitos secundários tem sido isolados de actinomicetos marinhos, sendo as atividades antibacteriana e anticâncer as principais descritas,porém pouco se conhece sobre a atividade antiviral deste grupo de micro-organimos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade de actinomicetos associados ao ambiente marinho, utilizando uma abordagem polifásica, associada à avaliação das atividades antimicrobiana e antiviral destas bactérias. No total, foram obtidos 579 isolados de bactérias oriundos de macro-organismos marinhos coletados no litoral norte do Estado de São Paulo, Brasil. Desses, 72 foram identificados por análise de sequência do gene RNA ribossomal 16S, como actinomicetos, e nove isolados foram descritos como novas espécies de actinobactérias pertencentes aos gêneros Gordonia (B204), Marmoricola (B374), Williamsia (B138, B375 e B452), Serinicoccus (B736), Kineococcus (B366), Knoellia (B175) e Janibacter (B742). A caracterização polifásica dessas novas espécies de actinobactérias foi realizada pela técnica de hibridação DNA-DNA, Multilocus Sequence Analysis (MLSA) utilizando genes conservados (rpoB, rpoA, gyrB, recA e trpB), análise de perfil de ácidos graxos e microscopia eletrônica. A caracterização dos isolados foi complementada por testes fisiológicos e quimiotaxonômicos, tais como a determinação do conteúdo de GC, lipídios polares, menaquinonas, testes de utilização de fontes de carbono, atividade enzimática, degradação de compostos e tolerância a antibióticos, pH e temperatura. Quanto ao potencial biotecnológico dos 72 isolados de actinobactérias avaliados, 16 isolados apresentaram potencial antimicrobiano e 13 potencial antiviral. Os extratos dos isolados B175 (CIM = 1 mg/mL), B375 (CIM = 2 mg/mL), B138 (CIM = 1 mg/mL) e B366 (CIM = 2 mg/mL) apresentaram atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus ATCC 6538. O extrato do isolado B374 apresentou atividade antiviral frente ao vírus Metapneumovírus aviário (aMPV), os isolados B366 e B742, frente ao herpes vírus simplex do tipo 1 (HSV-1), os isolados B138 e B452 frente ao vírus Calicivírus Felino (FCV) e o isolado B204 frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). A partir deste trabalho, pode-se concluir que existe grande diversidade de micro-organismos marinhos a ser descoberta e explorada, como fonte de novas espécies e compostos com potencial biotecnológico / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular