Le sujet de thèse porte sur l’étude de l’accumulation de vésicules de TriAcylGlycérol (TAG) chez Streptomyces, une bactérie du sol filamenteuse utilisée dans l’industrie pour sa production d’antibiotiques. Le TAG est un précurseur direct du bio-diesel puisqu’il permet, suite à une transestérification, l’obtention de glycérol et de bio-diesel.L’objectif principal de la thèse est de regarder l’effet de la source de carbone présente dans le milieu nutritif sur la production de TAG par la bactérie lors d’études cinétiques afin de trouver des souches sur-productrices. Deux sources de carbone sont utilisés : Le glucose, source de carbone classique généralement utilisé en microbiologie, et le glycérol qui est un « déchet » de l’industrie. Afin de suivre le contenu lipidique, une première étude globale utilisant un spectrophotomètre infra-rouge (IR), nous a permis de suivre l’évolution de la production de TAG par la bactérie au sein de notre milieu de culture lors d’études cinétiques de 96h. Il a été montré, par exemple, que pour la souche sauvage S. lividans, la source de carbone introduite (glucose ou glycérol) n’a pas d’influence observable sur la production de TAG par la bactérie au cours de la cinétique. Cependant, la technique FTIR nous donne uniquement une information globale sur la production de TAG mais ne nous donne aucune indication sur l’évolution des vésicules à l’intérieur de la bactérie au cours du temps. C’est pourquoi une deuxième étude, plus locale, à l’aide d’un nanoIR, couplage entre un Microscope à Force Atomique (AFM) et un laser IR pulsé permet de localiser au sein de la bactérie les vésicules lipidiques. Cela permet d'observer la dynamique de production du TAG et d'obtenir des pistes sur le métabolisme de production par la bactérie. / Streptomyces is a genus of Gram+ filamentous soil bacteria well known for their ability to produce antibiotics and other molecules useful as therapeutic or phytosanitary agents in medicine or agriculture. Under specific growth conditions some strains can store an excess of carbon into TriAcylGlycerols (TAGs), a direct Bio-diesel precursor. Streptomyces is thus an interesting canditate to generate bio-oils by fermentation. In this study, our goal is to evaluate, at the subcellular scale, the size/shape and localization of storage lipid inclusions in different Streptomyces strains (such as Streptomyces lividans (TK24), Streptomyces coelicolor (M145)…).In a previous study, the global TAGs content of those strains was easily and precisely quantified using infrared (IR) spectroscopy and thin layer chromatography revealing among other things that S. coelicolor has a very low TAGs content whereas S. lividans has an high TAG content. This was possible since TAG molecules show a specific response in the mid-infrared (IR) region, quite distinct from that of the other cellular constituants.Triacylglycerols posses several absorption bands in IR. In particular we can easily distinguish the band of the C=O stretching of the esters at 1741 cm-1 from the amide I band (protein signature) of the bacterium.For the study of the local repartition of TAG inside the cells, a combination of atomic force microscopy and infrared spectroscopy was employed in order to create sub-cellular chemical maps that allow label-free identification of TAG inclusions in Streptomyces cytoplasm using their specific absorption properties at 1741 cm-1. AFM-IR is a user-friendly benchtop technique that enables infrared spectroscopy with a spatial resolution well below conventional optical diffraction limits. It acquires IR absorption imaging with lateral resolution down to 100 nm.This technique coupled with classical FTIR measurements constitutes a powerful tool to study TAG metabolism in Streptomyces and can be easily used to control the rate of lipid accumulation during the fermentation process. Hence, the AFM-IR technique is likely to provide new insights into the constitution of the fatty inclusions and the role of TAGs in the morphological and metabolic differentiation processes that characterize Streptomyces developmental cell cycle.

Hfq est une protéine bactérienne qui a un rôle pleiotropique. La principale fonction de la protéine Hfq bactérienne consiste à répondre aux stress que peut rencontrer la bactérie lors d’un changement environnemental, en utilisant essentiellement un contrôle post-transcriptionnel. La protéine, par sa capacité à interagir avec les ARN et notamment les petits ARN non codant, permet ainsi une régulation rapide de l’expression génétique. En outre la protéine interagit aussi avec l’ADN qu’elle aide à se structurer. Les mutations dans le gène qui code pour Hfq ont des effets pleïotropes (déterminant plusieurs caractères phénotypiques).D’un point de vue structural, la protéine adopte un repliement de type Sm, caractérisé par un oligomère toroïdal reposant sur la formation d’un feuillet β continu à 30 brins. Cependant, outre cette région Sm N-terminale, Hfq possède également une région C-terminale (CTR) de taille et de séquence variables selon les bactéries. Mon travail de thèse a porté sur l’analyse de cette région CTR chez la bactérie Escherichia coli. Cette région a en effet la capacité de former une structure de type amyloïde : structures auto-assemblées in vivo, à proximité de la membrane interne et dans le nucléoïde.Par l’utilisation de diverses techniques physico-chimiques (microscopie moléculaire, spectroscopie et microscopie infrarouge, dichroïsme circulaire et diffusion aux petits angles), mon travail a consisté à caractériser l’assemblage de cette région de Hfq ainsi que les facteurs l’influençant en particulier la présence d’acide nucléique. Une partie de mon travail de thèse a aussi consisté à mettre en place une méthode d’imagerie corrélative innovante permettant d’analyser la signature chimique et morphologique d’une fibre amyloïde unique. Mon travail a enfin porté sur l’analyse de l’effet de composés inhibant l’agrégation de la structure amyloïde, ce qui pourrait constituer une piste pour développer une nouvelle classe d’antibiotiques. / Hfq is a pleiotropic bacterial protein that determines several phenotypic characteristics. Its main function is to facilitate responses to stresses that bacteria may encounter during environmental changes, mainly by using post-transcriptional genetic control. The protein, by its capacity to interact with RNA, in particular small non-coding RNA, enables a rapid regulation of gene expression. In addition, the protein also interacts with DNA and compacts it. From a structural point of view, the protein adopts an Sm-like fold, characterized by a toroidal oligomer formed by a continuous 30-stranded β-sheet. Besides its conserved N-terminal Sm domain, Hfq also possesses a C-terminal region (CTR) that can vary in size and sequence between bacteria. My PhD work focused on the analysis of this CTR region in Escherichia coli bacteria. Indeed, this region has the capacity to form an amyloid structure. This structural dynamic is related to the formation of self-assembled structures in vivo, in the proximity of the inner membrane and in the nucleoid.Using various physicochemical techniques (molecular microscopy, spectroscopy and infrared microscopy, circular dichroism and small angle X-ray scattering), my work consisted in characterizing the assembly of this region of Hfq, as well as the factors influencing its assembly (in particular, the presence of nucleic acids). A part of my work consisted in setting up an innovative correlative–imaging method to analyze the chemical and morphological signature of a single amyloid fibre. Finally, my work focused on the analysis of the effect of compounds that inhibit the aggregation of the amyloid structure, which could constitute a new way to develop a novel class of antibiotics.