Recentemente, l’ocratossina A (OTA) è stata segnalata in formaggio grattugiato confezionato: si ritiene sia stata prodotta dallo sviluppo di alcuni funghi durante il periodo di maturazione. Gli studi presentati in questa tesi hanno avuto lo scopo di migliorare la conoscenza dei funghi, Aspergilli e Penicilli, associati al formaggio di tipo grana. Si è dunque provveduto alla loro identificazione tramite approccio multifasico, eseguendo anche prove ecologiche per definire i fabbisogni delle specie presumibilmente dominanti. Obiettivo finale sarà quello di predire il rischio di contaminazione da micotossine alle condizioni ambientali di stagionatura del prodotto. Aspergillus puulaauensis e alcune specie del genere Penicillium (P.crustosum and P. solitum) sono state rilevate con maggior frequenza, mentre non sono state rilevate nei campioni di crosta le specie P. nordicum e P. verrucosum. In ogni caso, le condizioni ambientali dei locali di maturazione (15-22°C; 72-88% UR) sono risultate favorevoli allo sviluppo di queste ultime, dando adito a preoccupazione circa una possibile contaminazione da OTA; tuttavia, il ruolo di altre specie micotossigene, ad esempio P. crustosum, non va sottovalutato. Le azioni di contrasto verso questi funghi micotossigeni dovrebbero, innanzitutto, ridurre l’inoculo presente nell’aria: l’ozono sembra efficace in tal senso; inoltre, l’utilizzo della luce blu potrebbe ridurre notevolmente la crescita fungina sulla superficie dei formaggi e delle scaffalature. Le informazioni fornite in questa tesi saranno utili ai produttori e agli altri operatori della filiera di questo prodotto, aiutandoli ad attuare una miglior gestione del rischio e a garantire un prodotto sicuro e di elevata qualità ai consumatori. / Ochratoxin A (OTA) was detected a few years ago in Italian packed grated cheese, and supposed to be produced by fungal growth during cheese ripening. The works managed and presented in this thesis aimed to improve knowledge about mycotoxigenic Aspergilli and Penicillia associated to Italian grana cheese. A multiphasic approach was applied for their identification and ecological trials were organised to define fungal needs of the expected dominant species. The objective was to predict the risk of mycotoxin contamination during the ripening condition of grana cheese. Aspergillus puulaauensis and some Penicillium spp (P.crustosum and P. solitum) were the prevalent species associated to grana cheese, while neither P. nordicum, nor P. verrucosum were detected in cheese rind. However, the environmental conditions of the ripening rooms (15-22°C; 72-88% RH) are favourable to P. nordicum and P. verrucosum, reinforcing concern about possible OTA contamination, but other mycotoxigenic species such as P. crustosum must not be neglected. Actions against those mycotoxigenic fungi should mainly reduce total inoculum in the environmental air: ozone is reported to be effective in this sense; moreover, blue light may significantly reduce fungal growth on cheese and shelves surfaces. Information provided therein will be useful for producers and stakeholders to perform a better risk management and guarantee a safe, high-quality product to consumers.

Erysiphe necator (Schwein.) è l’agente causale dell’oidio della vite. Esso è in grado di svernare come ascospore all’interno di corpi fruttiferi, i chasmoteci, oppure come micelio in gemme infette. Le ascospore sono rilasciate nella primavera successiva e causano infezioni primarie che danno origine all’epidemia. Di conseguenza la riduzione dell’inoculo primario svernante potenzialmente riduce le epidemie nella stagione successiva. I primi sei capitoli di questa tesi riguardano nuove conoscenze sulla biologia, epidemiologia e modellistica del patogeno. Due nuovi modelli meccanicistici che simulano, rispettivamente, la maturazione e dispersione dei chasmoteci e le infezioni ascosporiche sono stati sviluppati ed è stata studiata approfonditamente la dinamica di maturazione e dispersione delle ascospore stesse. Nei restanti quattro capitoli il controllo del patogeno è stato riconsiderato in accordo con le linee guida della gestione integrata del vigneto. In particolare è stata valutata l’efficacia di diversi fungicidi, dell’iperparassita Ampelomyces spp. e di un olio minerale nel ridurre il numero di chasmoteci prodotti in autunno, nel distruggere gli stessi durante l’inverno e nel controllare le infezione primarie ascosporiche in primavera. / Erysiphe necator (Schwein.) is the causal agent of grapevine powdery mildew. It survives the winter in two ways: as ascospores in overwintering fruiting bodies, the chasmothecia, and as mycelium in infected buds. Ascospores that are repeatedly released and cause primary infections in the following grapevine growing season and trigger powdery mildew epidemics. Consequently, the reduction of the overwintering inoculum may reduce powdery mildew epidemics in the next season. In order to verify this statement and develop sanitation as a relevant strategy to be used in integrated management of grape powdery mildew, different studies were performed during this Doctorate. The first six chapters of this dissertation pertain to new findings about the biology, epidemiology and modeling of the pathogen. A new mechanistic model predicting maturation and dispersal of chasmothecia was developed, dynamics of ascospore maturation and dispersal were studied and another mechanistic model simulating ascosporic infections was developed. In the last four chapters the control of the pathogen was redrawn according to the Integrated Pest Management concept: the efficacy of fungicides, the hyperparasite Ampelomyces spp., and mineral oil in reducing chasmothecia production in fall, in killing chasmothecia before bud break, and in controlling ascosporic infections in spring was investigated.

Il controllo in agricoltura delle malattie causate da patogeni fungini può essere effettuato attraverso l’uso di modelli di previsione che si basano comunemente sul monitoraggio in tempo reale di una serie di variabili di input. Queste informazioni generalmente combinano dati metereologici locali con modelli matematici costruiti allo scopo di predire il rischio di malattie. Il processo decisionale si attiva quando un avvertimento sul potenziale rischio viene riconosciuto da parte dei modelli. Diversi modelli epidemiologici sono stati sviluppati e validati nel mondo. Negli Stati Uniti d’America, ad esempio, l’università della California ha sviluppato un supporto decisionale on-line per gestire la coltura secondo i principi della lotta integrata (Integrated Pest Management - IPM). Ciascun agricoltore può consultare il proprio database informativo e prendere decisioni sui trattamenti da effettuare basandosi su dati sito-specifici. Le difficoltà sorgono quando non sono disponibili dati meteorologici da stazioni poste nelle vicinanze del sito in studio o per le zone montane caratterizzate da una forte variabilità altimetrica. Inoltre i dati meteorologici disponibili possono presentarsi in formato non adeguato rispetto alle esigenze del modello previsionale. Con l’intento di avere una visione regionale e una maggiore accuratezza nella gestione del controllo delle malattie, l’obiettivo della tesi è stato l’utilizzo contemporaneo di modelli epidemiologici (Lobesia botrana e Erysiphe necator, agente causale dell’oidio della vite) con modelli fenologici (cultivar di vite Chardonnay) utilizzando parametri meteorologici come la temperatura per creare mappe a livello regionale, a frequenza giornaliera e con una risoluzione spaziale di 200 metri. L’utilizzo contemporaneo di entrambi i modelli aiuta ad essere più precisi nel consigliare interventi colturali nel periodo di sensibilità dell’ospite nei confronti del patogeno o della malattia in modo da poterne stimare il reale rischio di diffusione o insorgenza. Dopo aver calibrato e validato i modelli in Trentino-Alto Adige (Nord Italia) con dati metereologici locali, basandoci sul modello del cambiamento climatico HadAM3 dell’Hadley Centre (Pope et al., 2000),l’andamento climatico previsto è stato proiettato e statisticamente portato. in scala, utilizzando lo scenario A2 e B2. L’algoritmo statistico utilizzato per ridurre la scala giornaliera di risoluzione è chiamato “transfer function” (Eccel et al., 2009). Per completare l’analisi, è stato inoltre utilizzato lo scenario ridimensionato di ENSEMBLES attraverso l’uso di set di dati provenienti da 49 stazioni meteorologiche della FEM e dal pacchetto “RMAWGEN” (Cordano et al., 2012) creato con il software statistico R. (Gentleman et al., 1997). Per mappare i modelli è stata sviluppata una semplice piattaforma modulare WEB-GIS chiamata ENVIRO. I moduli sono “Open Source” e seguono gli standard internazionali dell’“Open Geospatial Consortium” (OGC) e sono stati implementati come segue: i) enviDB è il database per i dati spazio-temporali, ii) enviGRID permette agli utenti di navigare attraverso i dati e i modelli nello spazio e nel tempo, iii) enviMapper è l’interfaccia web per prendere le decisioni, consiste in uno stato dell’arte per mappare la vulnerabilità del cambiamento climatico a diverse scale di aggregazione nello spazio e nel tempo, iv) enviModel è l’interfaccia web per i ricercatori a cui viene fornita una piattaforma per processare e condividere modelli di rischio ambientali utilizzando il “web processing Technologies” (WPS) seguendo gli standard OGC. Con l’obiettivo di diventare ancora più accurati nelle previsioni dei volumi per i trattamenti contro insetti e malattie, in accordo con la direttiva 2009/128/EC, il seguente lavoro dimostra che il sensore LIDAR può essere utilizzato per caratterizzare la geometria della pianta della vite e stimare l’area fogliare (LAI) ad ogni stadio di crescita. Inoltre permette di calcolare il volume da applicare (Tree Row Volume -TRV) visualizzato nelle mappe 3D in GRASS. (Neteler et al., 2008, Neteler et al., 2012). / Control of agricultural pests and diseases is often based on forecasting models commonly based on real time monitoring of inputs variables. This information generally combines meteorological local databases and mathematical models designed to forecast pest and disease risk. The decision process starts when an alert or a potential risk event from the outputs of the models is issued. Epidemiological models based on local datasets have been created and validated worldwide, for example in USA, the University of California developed the online Integrated Pest Management (IPM) program where each farmer can consult with his own database and make the pest management decision based on site-specific conditions. Difficulties arise when no data from a close weather station are available, in mountain areas where weather conditions highly depend on the altimetry, or if data are not in a standard format to feed the model. In a view of having a regional vision and an increased accuracy in the pest control management, the goal of this thesis was to run contemporaneously epidemiological (the pest Lobesia botrana and the pathogen causing Powdery mildew Erysiphe necator) and phenological models (grapevine cv. chardonnay) using environmental variables as temperature and to create maps at regional level, with 200 meters of resolution and daily scale or frequency. Running both models together helps to be more precise in the sensibility period of the host versus the pest or the disease and to understand the real final risk. After calibrating and validating the models in the Trentino-Alto Adige Region (Italy) with local weather data, the forecasted climate was projected and statistically downscaled, based on the output of the Hadley Centre climate model - HadAM3 (Pope et al., 2000) under scenarios A2 and B2. The statistical downscaling algorithm was “transfer function method” (Eccel et al., 2009) at daily resolution. In order to complete the analysis, the downscaled scenario from ENSEMBLES was also used with the datasets of 49 weather stations from FEM and the “RMAWGEN” packages (Cordano et al., 2012) created for this project in R statistical open source software (Gentleman et al., 1997). In order to map the models, a friendly modular WEB-GIS platform called ENVIRO was developed. Modules are Open Source, follow international Open Geospatial Consortium (OGC) standards and were implemented as follows: i) enviDB is the database for spatial temporal data, ii) enviGRID allows users to navigate through data and model in space and time, iii) enviMapper is the web interface for decision makers, a state of the art client to map vulnerability to climate change at different aggregation scales in time and space; finally, iv) enviModel is the web interface for researchers that provides a platform to process and share environmental risk models using web geo-processing technologies (WPS) following OGC standards. With the aim of being even more accurate in pests and diseases spraying volumes and according with the Directive 2009/128/EC, the current work shows that the LIDAR sensor can be used to characterize the geometry of the grapevine and the Leaf Area Index (LAI) at each growth stage and calculate the Tree Row Volume (TRV) visualized in 3D maps in GRASS (Neteler et al., 2008, Neteler et al., 2012).

La fusariosi della spiga è tra le malattie del grano più distruttive e diffuse al mondo. Alcune specie responsabili di questa malattia sono micotossigene. Ci sono state segnalazioni della presenza di nivalenolo (NIV) e tossine T-2 e HT-2 nel nord Italia, micotossine prodotte da Fusarium poae, F. sporotrichioides e F. langsethiae. I limiti massimi di T-2 e HT-2 ammessi nei cereali non trasformati e nei prodotti a base di cereali non sono ancora stati individuati (Regolamento CE 856/2005). Il programma di dottorato del candidato è inserito in questa linea di ricerca. Sono stati condotti studi in vitro sulla biologia ed ecologia dei funghi produttori di NIV, T-2 e HT-2, considerando quattro isolati di F. poae, due di F. sporotrichioides e due di F. langsethiae. Le prove hanno riguardato la crescita delle colonie, la produzione di spore, la loro germinazione e la produzione di micotossine. La gravità dell'infezione, l'invasione (quantità di DNA nelle spighe), la resa in granella e la produzione di tossine sono state misurate a diversi tempi, temperature (in planta) e stadi fenologici (in campo) dopo l'inoculazione artificiale. Al fine di verificare l'attendibilità dei dati, tutti gli esperimenti in planta e in campo sono stati ripetuti per due anni. / The Fusarium head blight is one of the most destructive diseases of wheat in different parts of the world. Some of the species responsible for Fusarium head blight are potentially mycotoxigenic. There are reports of nivalenol (NIV), T-2 toxin and HT-2 in northern Italy. These are metabolites produced by F. poae, F. sporotrichioides, and F. langsethiae. The maximum limits of T-2 and HT-2 permitted in unprocessed cereals and cereal-based products, included in EC Regulation 856/2005 has not been identified. The PhD program of the candidate is placed in this line of the research. In vitro studies conducted on the biological and ecological of pathogenic fungi producer NIV, T-2 and HT-2 including four isolates of F. poae, two of F. sporotrichioides and two isolate of F. langsethiae. Tests were carried out to investigate the conidia germination, colony growth, spore production and mycotoxins production. The infection severity, invasion (amount of DNA in spikes), grain yield and toxin production were measured at different temperatures, different time (in planta) and different growth stages (in field) after artificial inoculation.

Gli obbiettivi di questa tesi di dottorato erano: i) valutare l’effetto di differenti condizioni ambientali sulla biologia ed epidemiologia di isolati di B. cinerea appartenenti alle sub-popolazioni transposa e vacuma, e ii) sviluppare un nuovo modello previsionale per predire il rischio di muffa grigia nei vigneti tra le fasi fenologiche di sviluppo delle infiorescenze e maturazione dei grappoli. Gli effetti della temperatura, durata di bagnatura e umidità relativa sulle infezioni di infiorescenze e bacche di Vitis vinifera sono stati valutati con inoculazioni artificiali di isolati di B. cinerea. Gli effetti della temperatura, attività dell’acqua, umidità relativa e composizione delle bacche di uva sulla germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi sono stati valutati su substrati artificiali. I risultati evidenziano che la capacità di causare infezioni varia con gli isolati indipendentemente dall’appartenenza alle sub-popolazioni transposa o vacuma. Inoltre, le risposte dei differenti isolati al variare delle condizioni ambientali risultano essere simili. Basandosi sui risultati ottenuti sono state sviluppate equazioni matematiche per spiegare l’effetto dei fattori ambientali sull’incidenza delle infezioni di infiorescenze e bacche, germinazione dei conidi, crescita miceliale e produzione di conidi. Un nuovo modello previsionale è stato sviluppato per predire le infezioni di Botrytis cinerea nei vigneti utilizzando le equazioni sviluppate e seguendo un approccio meccanicistico. Il modello è stato validato per 6 anni (2009-2014) in 13 vigneti localizzati in Italia e Francia. Il nuovo modello risulta essere più completo di quelli proposti finora in letteratura e può essere utilizzato per migliorare le strategie di controllo della muffa grigia nei vigneti. / The aims of this Doctoral work were: i) to investigate the effect of different environmental conditions on biology and epidemiology of B. cinerea strains belonging the two transposon types vacuma and transposa, and ii) develop a new weather-driven mechanistic model in order to predict risk of grey mould in vineyards from early growth of inflorescences to berry ripening. The effect of temperature, wetness duration and relative humidity on infection of Vitis vinifera inflorescences and berries was investigated by artificial inoculation of B. cinerea strains. The effect of temperature, water activity, relative humidity and grape berry composition on conidia germination, colony growth and conidial production was investigated in agar-medium. The results showed that the ability to cause infection was a strain rather than a transposon genotype attribute. Moreover, the general response to different environmental conditions is similar among different B. cinerea strains. Based on these data, equations were developed to account the combined effects of environmental factors on infection incidence, conidia germination, colony growth and conidial production. A new previsional model for Botrytis cinerea infections on grapevine was elaborated using the equations developed and following a mechanistic approach. The model was validated over a 6-year period (2009 to 2014) in 13 vineyards located in different grape-growing areas of Italy and France. The model is more complete than the others proposed in literature and represents an improvement to control grey mould in vineyards.

Le cucurbitacee possono essere attaccate da più di 200 malattie, una corretta gestione è dunque fondamentale per ridurre il rischio di perdite di produzione, sia in termini di quantità sia in termini di qualità. Tra le malattie più importanti che attaccano le cucurbitacee ci sono l’oidio e la peronospora delle cucurbitacee. Podosphaera xanthii e Golovinomyces cichoracearum sono gli agenti causali dell’oidio. È stato studiato l’effetto della temperature sulla germinazione dei conidi in ambiente controllato a 6 temperature costanti (da 10 a 35°C, ad intervalli di 5C°) da 3 a 72 ore. La temperature ottimale per la germinazone, l’infezione e la sporulazione è risultata essere rispettivamente 24.4, 25.7 e 21.3°C per P. xanthii e 17.9, 17.3 e 16.2°C per G. cichoracearum. Un modello meccanicistico è stato sviluppato per il rischio che i due agenti patogeni causassero un attacco di oidio. Il modello simula la germinazione su foglie infettate sulla base delle condizioni ambientali di temperatura e umidità relativa. Le equazioni che calcolano la germinazione delle dei conidi di entrambi i funghi sono state sviluppate sulla base di dati presenti in bibliografia. Un secondo modello meccanicistico è stato sviluppato per Pseudoperonospora cubensis, agente causale della peronospora delle cucurbitacee. Il modello calcola la data di comparsa dei sintomi e la probabilità del superamento di determinate soglie di gravità della malattia, sulla base di sotto-processi dell’infezione. Il passaggio da uno stato dell’infezione al successivo è dipendente dalle condizioni ambientali. Entrambi i modelli sono stati validati confrontando i dati ottenuti dai modelli con dati indipendenti rilevati in coltivazioni del nord Italia. / Cucurbits are potentially affected by more than 200 diseases of diverse etiologies, so a good disease management is crucial to reduce the risk of high yield losses in terms of quantity and quality. Among the more important diseases there are powdery and downy mildew. Podosphaera xanthii and Golovinomyces cichoracearum are the causal agents of cucurbit powdery mildew. The effect of temperature on conidial germination was studied in controlled condition at 6 constant temperature (from 10 to 35°C, step 5°C) for 3 to 72 hours. Optima temperature for conidial germination, infection and sporulation were 24.4, 25.7 and 21.3°C respectively for P. xanthii and 17.9, 17.3 and 16.2°C for G. cichoracearum. A mechanistic model was developed for the risk posed by P. xanthii and G. cichoracearum to cause cucurbit powdery mildew. The model simulates germination on infected leaves on the base of environmental conditions of temperature and relative humidity. Equation regulating spore germination of both fungi were developed using published data. Another mechanistic model was develop also for Pseudoperonospora cubensis, causal agent of cucurbit downy mildew. The model calculates the symptoms appearance and the probability of overtaking severity threshold based on sub-processes of infection. Changes from one state of the infection to the following one depend on environmental conditions. Both models were validated by comparing model outputs with independent data sets collected in fields located in the north of Italy.

Qualità e sicurezza degli alimenti, inclusa la loro tracciabilità ed autenticità, è diventato ngli ultimi anni obiettivo primario per la salute e il benessere dei consumatori. Il progetto è diretto allo sviluppo e applicazione di metodiche DNA-based per la tracciabilità di specie vegetali, varietà di frumento duro e microorganismi a difesa della qualita’, salubrita’ ed autenticità della filiera grano e prodotti processati. Le attività progettuali dello studio sono finanziate da industria (Barilla S.P.A.) con il coinvolgimento di enti pubblici di ricerca (Università Cattolica Del Sacro Cuore Di Piacenza, CREA-GB di Fiorenzuola D’arda). Il progetto si articola in tre argomenti principali: WP1.Tracciabilità di specie vegetali nella filiera pasta. Tracciabilità di varietà di frumento duro nella filiera pasta A questo scopo sono state intraprese nel secondo anno di attività due azioni dirette allo sviluppo e validazione di due diverse metodiche di fingerprinting varietale. Partendo dalle direttive UPOV in materia di impiego di marcatori molecolari per la caratterizzazione varietale è stata applicata e validata su di un pool di 26 varietà di interesse per l’industria un’ analisi basata su di una combinazione di marcatori SSR (Simple Sequence Repeats) che ha consentito di identificare in maniera univoca ciascuna delle varietà in esame. Il saggio è stato trasferito ai laboratori dell’industria che lo applica attualmente nella routine per il controllo di partite di granella. A fronte della robustezza dell’analisi SSR si pongono però i lunghi tempi analitici. Per ottimizzare questo aspetto si è completata un’attività di sequenziamento parziale del genoma di 28 varietà presenti in due repliche biologiche (52 campioni) e 12 mix di DNA di due varietà (4 differenti percentuali per ogni coppia di varietà miscelate). I dati ottenuti hanno fornito circa 15.000 marcatori molecolari DArT-seq (Diversity Array Technology ) e SNP (Simple Nucleotide Polimorphisms). Dall’intero set di marcatori è stato quindi individuato, attraverso una procedura bioinformatica, un set ridotto di marcatori ad alta informatività in grado di identificare univocamente le singole varietà e di predire la presenza di altre varietà in miscela e la percentuale di contaminazione. WP2.Tracciabilità Di Microrganismi Fungini Nella Filiera Pasta Questo studio è volto al controllo e identificazione di specie microbiche patogene che possono svilupparsi lungo la filiera grano con conseguente impatto negativo sulla salubrità di granella, di semole e dei prodotti finiti. A questo scopo sono stati prodotti campioni di granella a contaminazione controllata. Si è costituita attraverso l’analisi delle sequenze Barcode una ceppoteca che comprende i maggiori patogeni fungini che possono contaminare la granella durante la crescita della pianta in campo o durante lo stoccaggio della granella. Dopo l’inoculo artificiale dei singoli ceppi in due varietà di frumento duro, sono stati raccolti, a tempi crescenti, campioni di spighe e granella. La metodica è risultata rapida e sensibile nell’identificazione di DNA fungino fin dalle prime fasi dell’infezione, quando i sintomi della malattia risultavano ancora non ancora visibili. Le informazioni di sequenza Barcoding, in prospettiva, potranno essere utilizzate per sviluppare nuovi metodi di identificazione fungina più sensibili e rapidi. WP3. Identificazione molecolare di microrganismi vivi o morti in pesto L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare metodiche di V-qPCR (Viability-PCR), per permettere l’identificazione, quantificazione e discriminazione cellule microbiche vive o morte in alimentiprocessati, come il pesto. Per lo studio è stato scelto il batterio patogeno B.cereus, microrganismo ubiquitario, patogeno e sporigeno di difficile identificazione soprattutto in matrici complesse. Durante questo lavoro è stato sviluppato un protocollo analitico che prevede l’estrazione del DNA batterico da pesto, matrice interferente e complessa. Parte del lavoro è stata svolta presso l’Istituto di Microbiologia dell’Università Cattolica e l’Istituto IATA CSIC Institut d’Agroquímica i Tecnologia dels Aliments in Valencia. / Food quality and safety, including food traceability and authenticity, have become crucial in the last decades. Today, molecular and genetic progress can support the agri-food industry, due to the improvement of new analytical tools. Among the available applications, DNA-based methods can detect the presence of a particular species or variety along the food supply chain, verify the genetic identity of food and feed ingredients and detecting the presence of contaminating organisms, thus becoming an essential tool to study patterns, causes, and risk factors of diseases and outbreaks. As a consequence, genetic analysis has become increasingly popular even among non-specialists and highly beneficial for consumers, agricultural farmers, governments, and the private sector (Reid, O’Donnell, and Downey 2006). In this framework, the research developed in this thesis arises by active collaboration between the private company Barilla G. & R. Fratelli S.p.A., the public research institute CREA-GB (Consiglio per la Ricerca in agricoltura e l'analisi dell Economia Agraria) and Università Cattolica del Sacro Cuore, to develop a set of DNA-based methods to improve the traceability and authenticity of plant and microbial species and durum wheat varieties applicable from farm to fork. Following these aims, the research developed in this thesis includes: 1. The optimization and validation of qPCR assay for the discrimination of plant species along the pasta production chain through the organization of a ring test involving nine Italian public and private laboratories. The results obtained in this study were published in the Journal of Cereal Science (Chapter 2); 2. The discrimination of durum wheat varieties by selecting SSRs and DarT molecular markers as reliable methods for variety fingerprinting (Chapter 3). The results confirm the sensitivity of the method and the feasibility to 7 protect the food industry from fraud and ensure the consumer a certified pasta quality; 3. The application of the Barcoding technique and the development of qPCR assay for the identification and quantification of field fungi (Fusarium, Alternaria, Michrodochium, Cochliobolus spp.) and saprophytic fungi (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus spp) along the wheat chain (Chapter 3). The sensitivity of the method was investigated by inoculating potted durum wheat plants at full anthesis and wheat kernels (pre and postharvest trials). The DNA-based methods demonstrate a key role in pathogen detection and the application in several points of the wheat chain (e.g., for control of both locally and imported grains, for storage lots, to evaluate the environmental risk associated with grain powder for farmers and workers); 4. The optimization of Viability q-PCR (V-qPCR) for the discrimination of dead and alive Bacillus cereus, a spore-forming bacteria (Chapter 4). The results of PMAxx, combined with qPCR, have demonstrated the selective discrimination of B.cereus viable cells, with no false-positive signals determined by dead cells, a peculiar aspect of thermally treated food; 5. The comparison of two DNA extraction kits (FastDNA® SPIN Kit for Soil – MB and NucleoSpin Tissue - Macherey Nagel) by detecting B.cereus spores in basil pesto sauce, selected as a model food matrix. Despite the limit of detection (LOD) achieved (respectively 1.8x102 spores/gr by using Fast DNA TM SPIN and 2.7 x 105 spores/gr by using NucleoSpin®), the principal challenge remains the spores' DNA extraction from the complex matrix. Lastly, the results obtained during the doctoral research project were globally discussed (Chapter 5).

Maize is the principal staple food/feed crop exposed to mycotoxins, and the co-occurrence of multiple mycotoxins and their metabolites has been well documented. Dietary (co)-exposure to mycotoxins is associated with human and animal health concerns as well as economic losses. The present thesis aims to apply a holistic approach for the risk assessment of mycotoxin mixtures in food and feed, i.e. from fungal production and occurrence to harmonised risk characterisation. This was done in three folds. Firstly, available environmental, ecological, and agronomic factors that may affect the relative abundance of co-occurring mycotoxins in the contaminated crops were collected from peer-reviewed literature, with focus on maize (Chapter I). Secondly, (co-)occurrence data on mycotoxins in core cereals was extracted from available articles in the scientific literature and analysed to estimate potential pattern of co-exposure in humans and animals (Chapter II). Finally, Chapter III investigates the applicability of the EFSA guidance to multiple mycotoxins through a scenario of possible co-exposure in humans and animals, using maize as a case study. In particular, a human and animal risk assessment to mycotoxin mixture in maize was conducted using a modelled component-based approach for selected mixture of mycotoxins, that, according to our data, co-occur in maize based feed and food products. / Maize is the principal staple food/feed crop exposed to mycotoxins, and the co-occurrence of multiple mycotoxins and their metabolites has been well documented. Dietary (co)-exposure to mycotoxins is associated with human and animal health concerns as well as economic losses. The present thesis aims to apply a holistic approach for the risk assessment of mycotoxin mixtures in food and feed, i.e. from fungal production and occurrence to harmonised risk characterisation. This was done in three folds. Firstly, available environmental, ecological, and agronomic factors that may affect the relative abundance of co-occurring mycotoxins in the contaminated crops were collected from peer-reviewed literature, with focus on maize (Chapter I). Secondly, (co-)occurrence data on mycotoxins in core cereals was extracted from available articles in the scientific literature and analysed to estimate potential pattern of co-exposure in humans and animals (Chapter II). Finally, Chapter III investigates the applicability of the EFSA guidance to multiple mycotoxins through a scenario of possible co-exposure in humans and animals, using maize as a case study. In particular, a human and animal risk assessment to mycotoxin mixture in maize was conducted using a modelled component-based approach for selected mixture of mycotoxins, that, according to our data, co-occur in maize based feed and food products.

L’aglio è coltivato a livello mondiale nelle regioni temperate, secondo la FAO nel 2016 1.5 milioni di ettari sono stati destinati a questa coltura. A partire dal 2002 Fusarium proliferatum è stato segnalato come principale agente causale del marciume secco dell’aglio in post raccolta. I sintomi sono identificabili come macchie necrotiche sui bulbilli e in presenza di forti infezioni è possibile osservare la presenza di micelio bianco. F. proliferatum è un patogeno in grado di produrre Fumonisina B1 e B2, micotossine che potrebbero accumularsi all’interno dei bulbi ed essere tossiche per il consumatore. In Italia nel 2012 il 30% del raccolto è stato perso a causa di questo patogeno. Essendo la Fusariosi una malattia emergente a livello mondiale in letteratura si trovano ancora scarse informazioni sul suo sviluppo a livello di campo e sulle strategie di contenimento. 1. Allo scopo di verificare la quantità di inoculo fungino presente nell’ambiente si è proceduto all’analisi dei suoli in presemina con specifica attenzione alla quantificazione e all’identificazione delle specie fungine presenti. A tale scopo è stata eseguita: la conta delle Unità Formanti Colonia per grammo di terreno (UFC/g) su terreni specifici per l’isolamento del genere Fusarium spp. per grammo di terreno. Le identificazioni sono state eseguite al microscopio ottico e confermate successivamente con metodi molecolari. 2. Per seguire l’avanzamento della malattia durante la stagione colturale, invece, si è proceduto al campionamento in tre fasi fenologiche (inizio formazione dei bulbilli BBCH 15, ingrossamento dei bulbilli BBCH 45, maturazione di raccolta BBCH 49) con caratterizzazione dei sintomi, isolamento e riconoscimento dei funghi associati al marciume. 3. Per verificare la correlazione tra andamento meteo e incidenza delle specie fungine associate al marciume secco, sono stati raccolti i dati di meteorologici relativi al totale delle piogge, ai gradi giorno, all’umidità relativa media e alla temperatura media nei quadrati corrispondenti alle aziende agricole oggetto di studio. I dati sono stati correlati attraverso il coefficiente di correlazione di Pearson con i valori di gravità e incidenza della malattia stimati a fine stagione colturale. 4. Per verificare l’insorgenza dalla malattia nella fase di post raccolta si è proceduto con campionamenti di bulbi in conservazione, posa in piastra di bulbilli sintomatici e asintomatici e calcolo dell’incidenza delle specie fungine associate ai sintomi del marciume. 5. Al fine di verificare la possibile presenza di fumonisine nei campioni analizzati durante la stagione colturale e nel post raccolta, si è proceduto all’analisi attraverso HPLC di estratti di aglio. 6. Per individuare possibili strategie di controllo della malattia durante la stagione colturale sono stati eseguiti test di efficacia di prodotti chimici e biologici in vitro e in campo. I prodotti chimici sono stati provati su PDA modificato inoculato centralmente con F. proliferatum, mentre per gli agenti di biocontrollo sono state allestite prove di coltura duale. La prova in campo, invece, è stata eseguita all’interno di un campo sperimentale a strip plot. L’aglio delle diverse tesi è stato conservato in cella frigorifera per 9 mesi, per valutare la persistenza dei prodotti utilizzati alla concia. I risultati ottenuti hanno dimostrato che F. proliferatum e F. oxysporum sono le specie maggiormente associate al marciume dell’aglio durante la stagione colturale. L’andamento delle due specie è complementare e varia a seconda dell’andamento meteorologico della stagione colturale. F. proliferatum è correlato positivamente con l’aumento della temperatura e delle piogge, mentre F. oxysporum sembra prevalere nelle stagioni meno piovose ed ha mostrato correlazione positiva con la gravità dei sintomi rilevati in campo sulle corone. La carica micotica di Fusarium nel terreno rimane costante negli anni di analisi, facendo presupporre un maggiore ruolo del seme nella trasmissione della malattia. Per quanto riguarda il post raccolta, invece, F. proliferatum risulta la specie isolata con maggiore frequenza dai bulbilli e si correla positivamente ai sintomi rilevati sugli spicchi, confermando il suo ruolo come agente causale del marciume secco durante lo stoccaggio. F. oxysporum, invece, colonizza in prevalenza le radici e la parte basale della pianta dividendo il patosistema in due subsistemi: F. proliferatum-bulbi; F. oxysporum-radici. F. proliferatum è stato isolato anche dagli spicchi asintomatici con frequenza del 25%, ed è stato possibile rilevare la presenza di fumonisine con l’avanzare del tempo di stoccaggio in cella. Essendo il fungo presente anche sugli spicchi asintomatici maggiori studi saranno necessari per garantire la sicurezza dei consumatori. Infine, dalle prove di concia in campo è emerso che il principio attivo Tebuconazolo, riduce la comparsa dei sintomi da Fusarium, ma non in modo risolutivo. Ciononostante, una volta che il prodotto viene riportato a temperatura ambiente dopo lo stoccaggio in cella refrigerata, l’incidenza di F. proliferatum aumenta nuovamente con possibilità di sviluppo di danni al prodotto da commercializzare. / Since 2002, Fusarium proliferatum has been reported as the main causal agent of garlic dry rot during the postharvest stage, but information on the development of the disease throughout the production chain was nearly absent. Dry rot has caused huge economic losses in the past few years (up to 30 % of the yield), symptoms are visible on bulbs during storage as necrotic spots and in the most severe attacks, white mycelium may become visible on cloves. Few pest management strategies were tested in the recent past, but none were satisfactory. Due to the economic effect that this pathogen can have on local productions, the thesis aimed to deeply investigate the pathosystem with a field to fork approach and to test new strategies to control fungal infections. First of all, the work focused on garlic (Allium sativum L.) cropping season, intending to clarify the role of F. proliferatum in bulb infection as well as the impact of crop growing conditions on the development of the pathogen. A 3-year study was conducted in Piacenza (northern Italy) by sampling six garlic farms with different dry rot history (three highly contaminated and three low contaminated). Soil samples were recovered at sowing time for the counting of fungal colony-forming units (CFU). Plant samples were collected at three relevant growth stages, from April to July, for which disease severity assessment and fungi isolations were performed. Fusarium was the most frequently isolated genus, and F. proliferatum and F. oxysporum the dominant species during the garlic cropping season. F. oxysporum was dominant in the first year of the study, but F. proliferatum registered the highest incidence in all the farms tested. F. oxysporum incidence was correlated with dry weather, whereas F. proliferatum was enhanced in rainy years. To conclude, F. proliferatum is confirmed to be associated with garlic bulbs, even at crop’s early growth stages and symptoms are visible mainly on roots and basal plates at the field stage, related to F. oxysporum. Then, the focus was made in detecting the presence of F. proliferatum on garlic bulbs during prolonged storage, and to identify other fungal species associated with garlic dry rot. Moreover, fumonisin contamination in symptomatic and asymptomatic cloves were detected. Samples of 100 plants were collected over three production seasons in six farms located in Northern Italy at three-time points (at harvest, processing, and 6 months storage at –4° C). Results obtained lead to think that Fusarium–garlic pathosystem is split into two parts: basal plate/root and bulb. F. proliferatum had the highest incidence in infected bulbs and was confirmed as the causal agent of postharvest dry rot in garlic (mean incidence: 35.4%). F. oxysporum co-occurred with F. proliferatum but symptoms were visible only on basal plate/root. Dry rot incidence slightly increased during cold storage (from 14.6% at processing to 18.4% at 6-month storage); although, F. proliferatum incidence was stable during cold storage, fumonisin were produced from harvest through storage. Cloves showing symptoms were more contaminated compared to those asymptomatic, both by the fungus (mean incidence 39% vs 25.3%) and the toxin (287.0 vs 24.4 µg kg-1). Therefore, cold storage limits garlic dry rot, but health concerns related to fumonisin should be seriously considered. Regarding disease management, garlic crop is commonly propagated by plant parts (cloves). To protect garlic crop from early growth stages it is important to find commercial products able to control the pathogen growth on seedlings. The experiment aimed to test in vitro and in vivo the efficacy of triazoles and biocontrol agents (BCAs) against F. proliferatum and F. oxysporum. In in vitro trials, the best performance was achieved by propiconazole+prochloraz (100%), followed by tebuconazole (88.9%). BCAs were less effective but still showed great capacity to control the pathogen with maximum growth inhibition of 80% (Trichoderma harzianum +T. gamsii). In both cases, temperature influenced the capacity to control the pathogen with minimum effect at 25°C compared to lower temperatures. In vivo bacterial BCAs showed a similar capacity to control Fusaria compared to chemical products (mean of severity index 18.6% and 11.7%, respectively) and did not show side effects on root length. In vitro and in vivo results are comparable, except for Trichoderma, with the worst performances in terms of disease severity on plants. Finally, a field trial was designed to verify the efficacy of chemical and biological active ingredients as seed coating both at crop stage and postharvest, simulating the entire production chain, by taking into account visible symptoms and incidence of fungi. All products tested reduced the severity of symptoms on basal plates at the field stage, but none of them was able to reduce Fusarium incidence. A postharvest analysis conducted on bulbs demonstrated the efficacy of Tebuconazole, B. subtilis, and Trichoderma+B. subtilis in reducing the number of cloves showing symptoms per bulb (mean 34.3% vs control 45.8%). Moreover, Tebuconazole was able to reduce the incidence of F. proliferatum by 48% with respect to untreated control. The trial highlighted also that the incidence of F. proliferatum increased by 37% when garlic bulbs were kept for 15 days at room temperature simulating storage at consumers houses. Results obtained in the trial are promising and seed coating had a positive effect on garlic dry rot postharvest; although further studies are needed to test the persistence of seed coating treatments after prolonged storage period, especially when the product is kept outside cold chambers.

Le principali anomalie evidenziate nelle nocciole avariate riguardano la presenza di macchie necrotiche, imbrunimenti interni rilevati inseguito al taglio dei frutti e la presenza di marciumi parziali o totali su di essi con conseguente riduzione del prodotto disponibile sul mercato e ingenti perdite economiche. Sulla base di quanto premesso, lo scopo principale di questa tesi è stato quello di identificare e caratterizzare l'agente causale/i dei difetti del nocciolo e di definire un protocollo di gestione del problema, secondo i principi IPM. È stata quantificata l'incidenza dei generi fungini isolati da nocciole provenienti da diverse aree geografiche (Caucaso e Turchia), raccolte in diversi anni e in diverse fasi di crescita della coltura. Diaporthe è stato identificato come il principale genere fungino associato ai difetti della nocciola, e la caratterizzazione molecolare ha confermato il ruolo predominante della specie D. eres. Sono state studiate le caratteristiche ecologiche di questo fungo e l'efficacia in vitro di fungicidi chimici e biologici per controllarne la crescita miceliale, lo sviluppo di picnidi e la formazione di cirri. I risultati ottenuti costituiscono una base per definire linee guida per la corretta gestione della coltura al fine di prevenire la comparsa del patogeno identificato e delle difettosità nelle nocciole / Defects on hazelnuts are responsible for a significant reduction in the availability of high-quality hazelnuts with profound economic impacts. A reduction in the occurrence of defects, based on the identification of causal agents and on their control, is critical to improve the quality of raw nut products and reduce yield losses. Based on this background, the main aim of this thesis was to identify and characterize the causal agent/s of kernel defects in hazelnuts and to define a management protocol, according to IPM principles. Defects affecting hazelnuts are cause of brown spots on the kernel surface and darkening/browning inside the kernel, visible after nuts are half-cut. The incidence of fungal genera in hazelnuts coming from different geographical areas (Caucasus and Turkey), collected in different years at different crop growth stages, was quantified. Diaporthe was identified as the main genus involved in hazelnut defects, and the molecular characterization confirmed the predominant role of D. eres. Its ecological needs were investigated, and the in vitro efficacy of chemical and biological fungicide were screened to control D. eres growth, pycnidial conidiomata development and cirrhi occurrence. This would be an essential tool for a sustainable crop protection approach in this economically important crop