Classic Galactosemia (CG) is an autosomal recessive disorder caused by deleterious mutations of galactose-1-phosphate uridyltransferase (E.C. 2.7.7.12) (GALT) gene, which results in the inability to metabolize galactose and the accumulation of galactose-1-phosphate (gal-1-p) in patients' cells. Newborn screening has resulted in presymptomatic diagnosis and treatment. Although a galactose-restricted diet prevents the neonatal lethality of this disorder, many well-treated patients continue to develop debilitating complications such as premature ovarian insufficiency (POI), dyspraxic speech, ataxia and other neurological defects. The causes of these unsatisfactory outcomes remain unclear, but accumulation of gal-1-p is regarded as the major factor responsible for these chronic complications. In previous studies we found that gal-1-p was a competitive inhibitor of the UTP dependent, glucose-1-phosphate pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9) and inositol monophosphatase (EC 3.1.3.25). As a result there were deficiencies in cellular UDP-glucose and UDP-galactose as well as impaired G-protein-stimulated inositol responses of Ca++ release, respectively. In this study, we found that when we challenged GALT-deficient yeast and GALT-deficient human diploid fibroblasts with galactose, these cells exhibited environmental stress and endoplasmic reticulum (ER) stress, which was characterized by the up-regulation of the gene encoding the master regulator of ER stress, GRP78/BiP. In separate studies using GALT-deficient diploid fibroblasts and comparative expression arrays, we found that the expression level of a tumor suppressor gene called aplysia ras homolog I (ARHI) was significantly higher in patient cells under galactose challenge. This ARHI gene was lost in rodents during evolution and GALT knockout mice did not express the human phenotype for galactosemia whereas over-expression of this gene in transgenic mice resulted in phenotypes characteristic of those seen in patients with galactosemia. We therefore propose here that ARHI could be an important target of galactose toxicity in Classic Galactosemia, and also explain the absence of patient phenotypes in GALT knock-out mice. In order to prevent accumulation of gal-1-p caused by GALT-deficiency, we experimentally screened over 300,000 chemical compounds against human galactokinase (GALK) in vitro. To date, we obtained from two high-throughput screenings (HTS), 200 GALK inhibitors with IC50s ranging from 700nM to 35μM. We subsequently established selectivity and toxicity profiles of 34 selected GALK inhibitors. Based on these results, we selected four compounds for further characterization, which included kinetic studies, site-directed mutagenesis and molecular docking experiments. From these experiments, we learned how these compounds interacted with the GALK enzyme and built detailed binding models for each of them. We demonstrated that three of the in vitro inhibitors of GALK could lower intracellular gal-1-p accumulation in GALT-deficient cells. Of considerable interest to us was that one of the compounds, cluster 25-1, not only reduced gal-1-p accumulation, but also corrected the level of GRP78/BiP back to background in the galactose-challenged GALT-deficient cells. These results were the first to demonstrate a direct link between GALT-deficiency and ER stress and provided proof of concept that we could prevent both gal-1-p accumulation and ER stress with GALK inhibitors in GALT deficient human cells. Lastly, we developed a new, virtual method of identifying novel GALK inhibitors by combining software-based, high-throughput virtual screening (HTVS) and fragment-based linkage using docking software. The initial HTVS validation experiments with compounds from the "ZINC" database identified four active GALK inhibitors with IC50s ranging from 70μM to 400μM. We then used HTVS to identify chemical fragments which bind to the active site of the human GALK enzyme. Using fragment-linking software, we identified chemical fragments which could potentially result in high-affinity inhibitors when chemically joined.

In Europa leiden etwa 120 Millionen aller 18- bis 80-jährigen an einer Hörbehinderung (16% Prävalenz). Die altersassoziierte Innenohrschwerhörigkeit (Age related hearing impairment, ARHI) hat damit Anschluss gefunden an die großen Volkskrankheiten: Ischämische Herzerkrankungen (5,9 %), Demenz (5,8 %), Diabetes mellitus und Cerebralen Erkrankungen (je 5,5 %). Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Theorie des Hörens und seinen Störungen, der cochleären Durchblutung, den metabolischen Risikofaktoren, der Molekularbiologie und Epigenetik des Innenohres. Obwohl in der Literatur weitgehend Konsens über den Einfluss exogener Faktoren auf ARHI herrscht, wie Diabetes mellitus, Herz-Kreislauferkrankungen (Framingham Studie und CVD), Hypertonie, Rauchen, Body mass index (BMI) und genderspezifische hormonelle Einflüsse, gibt es kaum HNO-ärztliche Studien dazu. Der zweite Teil geht in einer Praxis-Fallstudie an 202 Patienten folgenden Fragen nach: 1. Gibt es zwischen metabolischen Erkrankungen, wie Adipositas, Störungen des Fett- und Glucosestoffwechsels, der Hypertonie und der Zunahme von Innenohrschwerhörigkeiten im Erwachsenenalter klinische Zusammenhänge? 2. Könnte eine erste Ohrsymptomatik Prädikator einer okkulten pathologischen Stoffwechselveränderung sein? 3. Gibt es Möglichkeiten einer Prävention? Im Ergebnis zeigten sich bei Patienten mit ARHI im Verhältnis Männer/Frauen: Störung des Glukosestoffwechsels bei 97 %/84 %, Lipidstoffwechselstörungen bei 76 %/85 %, eine Homocysteinämien bei 70 %/62 %, ein Anstieg des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors (PAI) bei 65 %/38 % und eine Harnsäureerhöhung bei 48 %/15 %. Auch bei ersten Ohrsymptomen (Ohrdruck, Tinnitus, einzelne Frequenzsenken) fanden sich in jedem einzelnen Fall metabolische Veränderungen, die entweder allein oder in unterschiedlichen Kombinationen vorlagen. Männern mit metabolisch initiierten KHK-Erkrankung haben als Prädikator häufig eine erektile Dysfunktion. Erste auditorische Symptomen könnten Prädikator okkulter metabolischer Störungen bei Männern und Frauen sein. Anamnestisch unklare Innenohrprobleme sollten daher auf Stoffwechselstörungen untersucht werden, da diese Risikofaktoren darstellen, die leitlinienbasiert zu therapieren sind. Eine Prognose ist in keinem Einzelfall möglich, da die Folgen auf die molekularbiologischen Prozesse im Innenohres individuell nicht erkennbar sind. Doch sahen wir bei einigen Patienten deutliche Verbesserungen der Symptome und einen Hörschwellenanstieg. Andere Patienten zeigten innerhalb des Beobachtungszeitraums keine Änderung der audiogenen Symptomatik. Behandlungen über einen längeren Zeitraum an einer größeren Fallzahl wären daher sinnvoll. Die Ergebnisse könnten als erste sekundärpräventive Behandlung betrachtet werden, die im Einzelfall eine Hörgeräteversorgung entbehrlich machte. Sie stellen einen Beitrag zu Pfisters Empfehlung dar, mit den vorhandenen Erkenntnissen exogener Risikomechanismen, dringend neue therapeutische Präventionsstrategien für die HNO-ärztliche Tätigkeit zu entwickeln, die die neurale und molekulare Basis anstelle der Symptome der Erkrankung fokussieren.

In Europa leiden etwa 120 Millionen aller 18- bis 80-jährigen an einer Hörbehinderung (16% Prävalenz). Die altersassoziierte Innenohrschwerhörigkeit (Age related hearing impairment, ARHI) hat damit Anschluss gefunden an die großen Volkskrankheiten: Ischämische Herzerkrankungen (5,9 %), Demenz (5,8 %), Diabetes mellitus und Cerebralen Erkrankungen (je 5,5 %). Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Theorie des Hörens und seinen Störungen, der cochleären Durchblutung, den metabolischen Risikofaktoren, der Molekularbiologie und Epigenetik des Innenohres. Obwohl in der Literatur weitgehend Konsens über den Einfluss exogener Faktoren auf ARHI herrscht, wie Diabetes mellitus, Herz-Kreislauferkrankungen (Framingham Studie und CVD), Hypertonie, Rauchen, Body mass index (BMI) und genderspezifische hormonelle Einflüsse, gibt es kaum HNO-ärztliche Studien dazu. Der zweite Teil geht in einer Praxis-Fallstudie an 202 Patienten folgenden Fragen nach: 1. Gibt es zwischen metabolischen Erkrankungen, wie Adipositas, Störungen des Fett- und Glucosestoffwechsels, der Hypertonie und der Zunahme von Innenohrschwerhörigkeiten im Erwachsenenalter klinische Zusammenhänge? 2. Könnte eine erste Ohrsymptomatik Prädikator einer okkulten pathologischen Stoffwechselveränderung sein? 3. Gibt es Möglichkeiten einer Prävention? Im Ergebnis zeigten sich bei Patienten mit ARHI im Verhältnis Männer/Frauen: Störung des Glukosestoffwechsels bei 97 %/84 %, Lipidstoffwechselstörungen bei 76 %/85 %, eine Homocysteinämien bei 70 %/62 %, ein Anstieg des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors (PAI) bei 65 %/38 % und eine Harnsäureerhöhung bei 48 %/15 %. Auch bei ersten Ohrsymptomen (Ohrdruck, Tinnitus, einzelne Frequenzsenken) fanden sich in jedem einzelnen Fall metabolische Veränderungen, die entweder allein oder in unterschiedlichen Kombinationen vorlagen. Männern mit metabolisch initiierten KHK-Erkrankung haben als Prädikator häufig eine erektile Dysfunktion. Erste auditorische Symptomen könnten Prädikator okkulter metabolischer Störungen bei Männern und Frauen sein. Anamnestisch unklare Innenohrprobleme sollten daher auf Stoffwechselstörungen untersucht werden, da diese Risikofaktoren darstellen, die leitlinienbasiert zu therapieren sind. Eine Prognose ist in keinem Einzelfall möglich, da die Folgen auf die molekularbiologischen Prozesse im Innenohres individuell nicht erkennbar sind. Doch sahen wir bei einigen Patienten deutliche Verbesserungen der Symptome und einen Hörschwellenanstieg. Andere Patienten zeigten innerhalb des Beobachtungszeitraums keine Änderung der audiogenen Symptomatik. Behandlungen über einen längeren Zeitraum an einer größeren Fallzahl wären daher sinnvoll. Die Ergebnisse könnten als erste sekundärpräventive Behandlung betrachtet werden, die im Einzelfall eine Hörgeräteversorgung entbehrlich machte. Sie stellen einen Beitrag zu Pfisters Empfehlung dar, mit den vorhandenen Erkenntnissen exogener Risikomechanismen, dringend neue therapeutische Präventionsstrategien für die HNO-ärztliche Tätigkeit zu entwickeln, die die neurale und molekulare Basis anstelle der Symptome der Erkrankung fokussieren.