O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

LIMK2 is a serine/threonine/tyrosine kinase that promotes tumor cell invasion and metastasis by phosphorylating cell proteins and altering their functions. There is a need to find tumor-specific substrates for LIMK2 in order to understand the downstream pathway of these substrates, their function, and how they are regulated by LIMK2. Recently, our labrotory identified LIMK2 as an excellent target for curing castration-resistant prostate cancer (CRPC). In this study, we identify two novel substrates for LIMK2 in CRPC: speckle-type POZ protein (SPOP), and Y-box binding protein-1 (YBX1). While LIMK2 negatively regulates SPOP, it positively regulates YBX1 − both by phosphorylation using in-vitro kinase assays. A study in our labrotory also proved that LIMK2 regulates Aurora A kinase (AURKA), where AURKA directly phosphorylates LIMK2. AURKA is a serine/threonine kinase that regulates cell cycle during mitosis; it is known to be upregulated, with uncontrolled activity, in many types of cancer, including prostate cancer. It is therefore important to identify new substrates for AURKA, especially in light of reported lethality in early embryonic mice, in association with AURKA-knockout. In other words, targeting AURKA directly may cause severe toxicity, a finding that has prevented direct inhibitors from passing Phase II clinical trials. In this study, we also identified SPOP and YBX1 as direct substrates for AURKA. Our results confirm what we know about the LIMK2/AURKA relationship: that AURKA negatively regulates SPOP and positively regulates YBX1. Targeting LIMK2 and AURKA indirectly through SPOP, YBX1 and its other substrates holds tremendous therapeutic potential in treating prostate cancer. With this, we open the door for researches to investigate the direct phosphorylation of SPOP and YBX1 in other types of cancer cells known to have overexpression in SPOP and/or YBX1.

Mutações ativadoras no gene KRAS são prevalentes em cancer de pulmão e a as vias de sinalização de RAS estão aumentadas em células iniciadoras de tumor (CITs), que são definidas como células autorrenováveis capazes de iniciar a formação tumoral, sustentar o crescimento tumoral e promover a disseminação tumoral. Entretanto, terapias direcionadas a RAS não foram efetivas até hoje e a identificação de alvos de KRAS que contribuam para o fenótipo oncogênico é necessária. Como a quinase Aurora A (AURKA) já foi implicada, tanto na oncogênese induzida por KRAS, quanto em promover a função das CITs, nós hipotetizamos que a inibição das vias de AURKA seria detrimental para a função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, desta forma diminuindo o comportamento maligno do câncer de pulmão. Para avaliar a função das CITs, nós usamos ensaios de crescimento de tumoresferas que permitem o crescimento seletivo de CITs in vitro. As linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às linhagens parentais, às células oriundas de tumoresferas apresentaram maior capacidade clonogênica in vitro e maior tumorigenicidade in vivo. Além disso, uma análise por qPCR revelou que as células oriundas de tumoresferas possuem expressão aumentada de fatores de células tronco, uma característica de CITs. Em seguida, nós inibimos a AURKA nas linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 por interferência de RNA (RNAi) ou com um inibidor das quinases Aurora (AI II). A inibição de AURKA diminuiu a formação de tumoresferas e o crescimento destas em culturas seriadas, além de reduzir a capacidade clonogênica das células oriundas de tumoresferas. Estes resultados indicam que a AURKA é importante para a autorrenovação e a oncogenicidade de CITs, e que a AURKA induz o fenótipo tronco-tumoral, o que é corroborado pelo achado de que a inibição de AURKA nas tumoresferas reduz a expressão de fatores de célula tronco. Um destes fatores regulados por AURKA é o marcador de superfície de célula tronco CD24. De fato, quando comparadas às células cultivadas de forma aderente, as células oriundas de tumoresferas apresentam maior número de células positivas para CD24 (CD24+) e estes números são reduzidos pelo tratamento com AI II. Finalmente, nós purificamos células H358 CD24+ por citometria de fluxo e mostramos que, quando comparadas às células negativas para CD24, as células CD24+ apresentam maior capacidade de formar tumoresferas em culturas seriadas, e o tratamento com AI II inibe preferencialmente a capacidade de células CD24+ de formarem tumoresferas. Nossos resultados sugerem que uma terapia baseada na inibição de AURKA pode reduzir o número e função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e, portanto, pode representar uma estratégia terapêutica atraente para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / Activating mutations in KRAS are prevalent in lung cancer and RAS sinaling is enhanced in cancer initiating cells (CICs), which are defined as self-renewing tumor cells able to initiate tumor formation, sustain tumor growth and drive tumor dissemination. However, therapies targeted to oncogenic RAS have been ineffective to date and identification of KRAS targets that impinge on the oncogenic phenotype is warranted. Because Aurora kinase A (AURKA) has been implicated both in RAS oncogenesis and in promoting CIC function, we hypothesized that targeting AURKA pathways would impair KRAS-positive lung CIC function, thereby decreasing lung cancer malignant behavior. To evaluate CIC function, we used tumorsphere assays that allow selective growth of CICs in vitro. KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells formed tumorspheres under low attachment conditions, and, when compared to the parental cell lines, sphere-forming cells had increased clonogenic ability in vitro and increased tumorigenicity in vivo. In addition, qPCR analysis revealed that tumorsphere cells displayed increased expression of stem cell factors, a hallmark of CICs. Next, we targeted AURKA in KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells by RNA interference (RNAi) or with an Aurora inhibitor (AI II). AURKA targeting decreased tumorsphere formation and growth in serial cultures and reduced clonogenic growth of tumorsphere-forming cells. These results indicate that AURKA is important for CIC selfrenewal and oncogenicity and that AURKA induces a CIC phenotype, which is further underscored by the finding that AURKA targeting in tumorspheres decreases expression of stem cell factors. One such factor shown to be regulated by AURKA is the stem cell surface marker CD24. In fact, when compared to adherent cultures, A549 and H358 tumorspheres display increased numbers of CD24-positive (CD24+) cells and these numbers are reduced by AI II treatment. Finally we purified H358 CD24+cells by flow cytometry and showed that, when compared to CD24-negative cells, CD24+ cells have increased ability to form tumorspheres in serial cultures, and AI II treatment preferentially reduced the ability of CD24+ cells to form tumorspheres. Our results suggest that AURKA inhibition therapy can reduce the number and function of KRAS-positive lung CICs, and, therefore might be an attractive therapeutic strategy to reduce recurrence and metastasis in KRAS-induced lung cancer.

Mutações ativadoras no gene KRAS são prevalentes em cancer de pulmão e a as vias de sinalização de RAS estão aumentadas em células iniciadoras de tumor (CITs), que são definidas como células autorrenováveis capazes de iniciar a formação tumoral, sustentar o crescimento tumoral e promover a disseminação tumoral. Entretanto, terapias direcionadas a RAS não foram efetivas até hoje e a identificação de alvos de KRAS que contribuam para o fenótipo oncogênico é necessária. Como a quinase Aurora A (AURKA) já foi implicada, tanto na oncogênese induzida por KRAS, quanto em promover a função das CITs, nós hipotetizamos que a inibição das vias de AURKA seria detrimental para a função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, desta forma diminuindo o comportamento maligno do câncer de pulmão. Para avaliar a função das CITs, nós usamos ensaios de crescimento de tumoresferas que permitem o crescimento seletivo de CITs in vitro. As linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às linhagens parentais, às células oriundas de tumoresferas apresentaram maior capacidade clonogênica in vitro e maior tumorigenicidade in vivo. Além disso, uma análise por qPCR revelou que as células oriundas de tumoresferas possuem expressão aumentada de fatores de células tronco, uma característica de CITs. Em seguida, nós inibimos a AURKA nas linhagens pulmonares positivas para KRAS H358 e A549 por interferência de RNA (RNAi) ou com um inibidor das quinases Aurora (AI II). A inibição de AURKA diminuiu a formação de tumoresferas e o crescimento destas em culturas seriadas, além de reduzir a capacidade clonogênica das células oriundas de tumoresferas. Estes resultados indicam que a AURKA é importante para a autorrenovação e a oncogenicidade de CITs, e que a AURKA induz o fenótipo tronco-tumoral, o que é corroborado pelo achado de que a inibição de AURKA nas tumoresferas reduz a expressão de fatores de célula tronco. Um destes fatores regulados por AURKA é o marcador de superfície de célula tronco CD24. De fato, quando comparadas às células cultivadas de forma aderente, as células oriundas de tumoresferas apresentam maior número de células positivas para CD24 (CD24+) e estes números são reduzidos pelo tratamento com AI II. Finalmente, nós purificamos células H358 CD24+ por citometria de fluxo e mostramos que, quando comparadas às células negativas para CD24, as células CD24+ apresentam maior capacidade de formar tumoresferas em culturas seriadas, e o tratamento com AI II inibe preferencialmente a capacidade de células CD24+ de formarem tumoresferas. Nossos resultados sugerem que uma terapia baseada na inibição de AURKA pode reduzir o número e função de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e, portanto, pode representar uma estratégia terapêutica atraente para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / Activating mutations in KRAS are prevalent in lung cancer and RAS sinaling is enhanced in cancer initiating cells (CICs), which are defined as self-renewing tumor cells able to initiate tumor formation, sustain tumor growth and drive tumor dissemination. However, therapies targeted to oncogenic RAS have been ineffective to date and identification of KRAS targets that impinge on the oncogenic phenotype is warranted. Because Aurora kinase A (AURKA) has been implicated both in RAS oncogenesis and in promoting CIC function, we hypothesized that targeting AURKA pathways would impair KRAS-positive lung CIC function, thereby decreasing lung cancer malignant behavior. To evaluate CIC function, we used tumorsphere assays that allow selective growth of CICs in vitro. KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells formed tumorspheres under low attachment conditions, and, when compared to the parental cell lines, sphere-forming cells had increased clonogenic ability in vitro and increased tumorigenicity in vivo. In addition, qPCR analysis revealed that tumorsphere cells displayed increased expression of stem cell factors, a hallmark of CICs. Next, we targeted AURKA in KRAS positive lung cancer H358 and A549 cells by RNA interference (RNAi) or with an Aurora inhibitor (AI II). AURKA targeting decreased tumorsphere formation and growth in serial cultures and reduced clonogenic growth of tumorsphere-forming cells. These results indicate that AURKA is important for CIC selfrenewal and oncogenicity and that AURKA induces a CIC phenotype, which is further underscored by the finding that AURKA targeting in tumorspheres decreases expression of stem cell factors. One such factor shown to be regulated by AURKA is the stem cell surface marker CD24. In fact, when compared to adherent cultures, A549 and H358 tumorspheres display increased numbers of CD24-positive (CD24+) cells and these numbers are reduced by AI II treatment. Finally we purified H358 CD24+cells by flow cytometry and showed that, when compared to CD24-negative cells, CD24+ cells have increased ability to form tumorspheres in serial cultures, and AI II treatment preferentially reduced the ability of CD24+ cells to form tumorspheres. Our results suggest that AURKA inhibition therapy can reduce the number and function of KRAS-positive lung CICs, and, therefore might be an attractive therapeutic strategy to reduce recurrence and metastasis in KRAS-induced lung cancer.

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