Thesis (Ph. D.)--University of Missouri-Columbia, 2008. / The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from title screen of research.pdf file (viewed on June 19, 2009) Includes bibliographical references.

Weakening of fruit and petal abscission zones in Rubus idaeus L. cv. Glen Clova was accompanied by increased rates of ethylene production. Both processes were accelerated by a supply of exogenous ethylene. In the ripe fruit natural ethylene levels were saturating. The rise in ethylene production clearly preceded petal abscission but in fruit the increase virtually coincided with the start of weakening. Raspberry fruit of other varieties and blackberries clearly showed the abscission zone weakening could precede any increase in ethylene production. The internal ethylene concentrations of Glen Clova fruit at the mottled stage reached those levels which had to be added to stimulate abscission (ie 0.25 to 0.5 ppm). This is the very stage at which abscission zone weakening was first noticeable. Both fruit and petal abscission was retarded by the application of inhibitors of ethylene production ( AVG, Co 2+) or action (Ag+ ). Likewise a reduction in the internal ethylene under hypobaric pressure also retarded fruit abscission. None of these treatments were totally capable of preventing abscission. In fruit abscission the receptacle appears to have an important role. The increase in receptacle ethylene production precedes that of the drupelets. The enlargement and swelling of the receptacle tissues are important in both abscission zone weakening and ethylene production. This receptacle development may in turn be controlled by the development of fertilised drupelets. The ethylene production in both fruit and petal abscission is limited initially by the supply of ACC. In both cases endogenous ACC levels increase in step with ethylene production. Ethylene's role as a coordinating/accelerating agent in fruit and petal abscission is discussed.

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Apple preharvest fruit drop frequently results in severe economic losses. Cultural control of preharvest drop has relied upon plant growth regulators (PGRs), but the loss of daminozide (Alar) and 2,4,5-TP has severely limited the choices of effective stop-drop compounds. A more complete understanding of factors involved in preharvest drop is therefore imperative. Experiments were conducted to provide information about cellulase activity in the abscission zone, effects of applied auxin and ethylene biosynthesis inhibition on drop, changing sensitivity to abscission induction during the season, and relationships among seed number, fruit weight, and day of drop. Observational studies were used to study effects of fruit maturity, canopy positions, and morphology of stem attachment on time of fruit drop as well as characterizing the natural timing of late-season fruit drop. Increased activity of cellulase, but not polygalacturonase, in the abscission zone was detected within 4 days of cutting fruit to induce abscission. Both aminoethoxyvinyl glycine (AVG) and naphthaleneacetic acid (NAA) applied 2 or 4 days after cutting delayed drop, but NAA delayed drop 1.6 days longer than did AVG. Fruit of "RedChief Delicious"(D) exhibited a significantly reduced sensitivity to abscission-inducing treatments from mid-June until early July compared to earlier orr later in the season. Application of plant growth regulators to cut fruit revealed a significant interaction of NAA treatment with AVG treatment such that NAA delayed drop when applied with AVG but not without AVG. Fallen fruit had lower starch and higher soluble solids than fruit on the tree on the day of collection. The highest fruit in the canopy fell an average of 4.4d earlier than the lowest fruit. Day of drop was not different for fruit from king blooms vs. side blooms within an inflorescence. There was a trend for fruit from first year wood to drop later than fruit from older wood on "Delicious", but not "Smoothee Golden Delicious" trees. There was no detectable effect of angle of orientation of the subtending spur on the limb, the pedicel:spur abscission zone, or fruit axis of symmetry on time of fruit drop. No difference was detected in time of fruit drop between East and West or North and South sides of the trees. No substantial variation in day of drop of individual fruit was explained by number of seed in the fruit. Daily drop was recorded for three cultivars ("RedChief Delicious", "Smoothee Golden Delicious", and "Commander York") for three years. Variance of average day of drop from year to year was 40.1, while variance among cultivars within a year was 51.8. Variance from tree to tree within each cultivar, within each year, was only 18.6. Multiple regression modeling to identify relationships between weather factors and daily fruit drop revealed that much of the variability in time of drop was due to factors other than the weather events modeled. The best regression models developed explained only 8% to 35% of the variability in time of drop. The most important weather factors were daily minimum temperatures and precipitation. Rain events of greater than 5.0 mm following a drier period appeared to cause increased drop of all three cultivars in one out of the three years investigated. / Ph. D.

En fin de cytocinèse, le fin pont cytoplasmique qui relie les deux cellules filles est clivé au niveau d’une structure dense en microtubules, le midbody, et permet ainsi la séparation physique de leurs deux cytoplasmes. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de ce processus, appelé abscission, sont très étudiés dans des modèles de cellules en culture. Cependant, ils restent encore mal connus dans le contexte d’un organisme en développement. L’ovogenèse de drosophile est un modèle de choix pour l’étude de la régulation développementale de l’abscission. En effet, des cellules à abscission complète (cellules souches germinales) et incomplète (cystes germinaux) sont situées côte à côte au sein de la même unité développementale, le germarium. Les cellules souches se divisent asymétriquement, pour donner une autre cellule souche et un cystoblaste individualisé. Celui-ci entre en alors en différenciation, un programme au cours duquel il réalise quatre cycles cellulaires synchrones au cours desquels la cytocinèse est incomplète. Un cyste germinal de seize cellules interconnectées est ainsi formé. La durée de l’abscission est régulée précisément et dépend du contexte développemental. Notre laboratoire a récemment montré que les kinases Aurora B et Cdk1/ Cyclin B sont des régulateurs de la durée d’abscission dans les cellules germinales de drosophile et en cellules en culture de vertébrés. Mon travail a consisté à explorer la fonction de la protéine Shrub, un membre du complexe ESCRT-III, au cours de l’abscission dans la lignée germinale femelle de drosophile. Nous avons montré que Shrb est localisé au midbody des cellules souches en fin de cytocinèse, et promeut l’abscission. En effet, nous avons montré qu’une réduction du niveau de Shrub dans la lignée germinale provoque un fort délai de l’abscission des cellules souches, supérieur à la durée de leur cycle cellulaire. La cellule souche et son cystoblaste restent donc connecté jusqu’à la mitose suivante, formant ainsi des structures de plusieurs cellules connectées, appelées stem-cyst . L’abscission tardive au sein du stem cyst libère un progéniteur binucléé qui entre en différenciation. En conséquence, des chambres ovariennes à 32 cellules, au lieu de 16, sont formées. De plus, la fonction de Shrub dans l’abscission semble être contrecarrée par Aurora B, puisqu’une réduction des niveaux d’Aurora B dans des hétérozygotes Shrub réduit le nombre de stem-cysts et de chambres à 32 cellules observés. Enfin, nous avons identifié un nouveau facteur impliqué lors de l’abscission, la protéine Lethal giant discs (lgd), dont la perte de fonction induit, comme celle de Shrub, la formation de stem-cysts. En accord avec son rôle dans l’abscission, nous avons montré que Lgd est localisé au midbody. Lgd est requis pour la fonction de Shrub dans la voie endosomale, mais son implication lors de la cytocinèse était inconnue. Nous avons montré qu’un niveau réduit de Lgd augmente le nombre de stem-cysts des hétérozygotes Shrub, indiquant que Lgd et Shrub fonctionnent ensemble pour l’abscission des cellules souches. De façon surprenante, un nombre réduit de chambres à 32 cellules est observé dans ces ovaires, suggérant une fonction antagoniste de Lgd sur Shrub dans les cystes germinaux. Dans ces cystes, une abscission tardive se produit, qui divise en deux cystes de 16 cellules les cystes de 32 cellules, et expliquant ainsi le paradoxe observé (plus de stem-cysts, mais moins de chambres à 32 cellules). / At the end of cytokinesis, a thin cytoplasmic intercellular bridge is cleaved to allow physical separation of the two daughter cells. This process is called abscission, and its cellular and molecular events have been extensively explored in yeast and isolated mammalian cells. However, how abscission is regulated in different cell types or in a developing organism remains poorly understood.Drosophila oogenesis is a great model to study how abscission is regulated developmentally, as within the same developmental unit, the germarium, we find cells undergoing abscission next to others where this process is blocked. Indeed, the germline stem cell (GSC) divides asymmetrically to give rise to another GSC and to an individualized cystoblast. This cell then enters a well-studied process of differentiation, where through four rounds of mitosis with incomplete cytokinesis, gives rives to a cyst of 16 interconnected cells. The duration of abscission, seems to be tightly regulated and dependent on the developmental context. Our lab has recently discovered that AurB and CycB/Cdk1 function as abscission timers in Drosophila GSC and isolated mammalian cells. Thus, my work consisted in exploring how this process is regulated in the Drosophila female germline.We showed that the ESCRT-III protein Shrb localizes to the midbody of the dividing GSC, functioning to promote abscission. Indeed, we found that reduced levels of Shrb resulted in the blockage, or strong delay, of abscission in the GSC and formation of a structure similar to a cyst. In these so called stem-cysts, the GSC keeps dividing while interconnected to its daughter cells. As a consequence, we saw the appearance of egg chambers formed of 32 cells, instead of 16. Furthermore, Shrb function in abscission seems to be counteracted by AurB, as reducing AurB levels in Shrb heterozygous resulted in decreased stem-cysts and 32-cell cysts. Finally, Lethal giant discs (lgd), required for Shrb function in the endosomal pathway, was also seen localizing at the midbody and regulating abscission in GSCs. Removing one copy of Lgd from Shrb heterozygous increased the number of stem-cysts, but surprisingly the number of 32-cell cysts was reduced. This paradoxical result was explained with the observation of late abscission events in mitotic cysts, which divided the 32-cell cysts in the middle, leading to the formation of two cysts of 16 cells.

La dernière étape de la cytocinèse, l’abscission, consiste en la coupure du pont intercellulaire reliant les deux cellules filles à la suite de la contraction de l’anneau acto-myosique. Comme toutes les étapes de la division cellulaire, l’abscission doit être régulée dans l’espace et dans le temps afin qu’elle intervienne au bon endroit et au bon moment. Mon travail de doctorat a porté sur l’étude de la régulation dans le temps de l’abscission par l’environnement des cellules filles, en particulier par les forces de traction exercées par les cellules sur le pont intercellulaire. En utilisant une combinaison d’approches permettant de contrôler le confinement spatial 2D des cellules filles, de mesurer les forces exercées par les cellules au cours de la cytocinèse et de micro-manipuler le pont intercellulaire, j’ai montré que, de façon contre-intuitive, une tension exercée au niveau du pont retardait l’abscission et qu’au contraire la relâche de cette tension induisait l’abscission. De plus, la régulation temporelle de l’abscission par les facteurs environnementaux des cellules filles implique les protéines des « Endosomal Sorting Complex Required for Transport III » (ESCRT-III), machinerie centrale de l’abscission. Enfin, des expériences préliminaires suggèrent que cette régulation serait importante pour le maintien de l’intégrité tissulaire et la morphogenèse au cours du développement. / The last step of cytokinesis, abscission, consists in the severing of the intercellular bridge connecting the two daughter cells after the contraction of the acto-myosin ring. As any other step of cell division, abscission has to be regulated both in time and space in order to take place at the proper time and proper place. During my PhD, I studied the temporal regulation of the abscission by the cell micro-environment, particularly by the traction forces exerted by the cells on the intercellular bridge. I used a combination of approaches to control the daughter cells 2D spatial confinement, to measure the forces exerted by the cells throughout cytokinesis, and to micro-manipulate the intercellular bridge. Counter-intuitively, a tension exerted on the intercellular bridge delayed abscission while a release of tension in the bridge induced abscission. Moreover, the temporal regulation of abscission by the environment of the daughter cells implies the Endosomal Sorting Complex Required for Transport III (ESCRT-III), the main abscission machinery. Finally, preliminary experiments suggest that this mechanism could be important for tissue integrity and morphogenesis.

Pour maintenir l'organisation et la polarité du tissu épithélial, de nouvelles jonctions cellulaires ont besoin de se former lors de la division cellulaire. Pour comprendre les mécanismes de formation de la jonction durant la cytokinèse, nous avons exploré dans les tissus épithéliaux de la Drosophile, la formation des jonctions septées tricellulaires (TCJs), critique à la fois dans la fonction de barrière tissulaire, dans l'homéostasie des cellules souches, ainsi que dans l'orientation du fuseau mitotique. Durant les dernières étapes de la constriction de l'anneau contractile, les membranes des deux cellules filles et des cellules voisines localisées sous la jonction adhérente (JA) restent enchevêtrées dans une structure à 4 cellules apposée au corps intermédiaire. Les constituants protéiques de la jonction septée, Discs-large (Dlg) et Neuroglian (Nrg), ainsi que les composants de la TCJ, Gliotactin (Gli) et Anakonda (Aka), s'accumulent dans cette structure à 4 cellules. Par la suite, la descente basale du corps intermédiaire est corrélée au détachement des membranes des cellules voisines, au désengagement des cellules filles de leurs voisines, et à la formation de TCJs matures. Le détachement des cellules voisines du corps intermédiaire est indépendant de l'abscision. Au contraire, la perte de la fonction Gli ou Aka empêche le détachement entre les cellules filles-voisines et le mouvement du corps intermédiaire. Ainsi, nous proposons que les protéines de la TCJ contrôlent une étape additionnelle de la cytokinèse, nécessaire au désengagement des cellules filles et de leurs voisines durant la cytokinèse épithéliale. / To maintain epithelial tissue organisation and polarity, new cell-cell junctions need to be formed upon cell division. To understand the mechanisms of junction formation during cytokinesis, we explored in Drosophila epithelial tissues, the de novo formation of tricellular septate junctions (TCJs), which are critical to tissue barrier function, stem cell homeostasis and mitotic spindle orientation. During the final stages of cytokinetic ring constriction, the membranes of the two daughter cells and of the neighbouring cells located below the adherens junction (AJ) remain entangled in a 4-cell structure apposed to the midbody. Protein constituents of the septate junction Discs-large (Dlg) and Neuroglian (Nrg) and the components of the TCJ Gliotactin (Gli) and Anakonda (Aka) accumulate in this 4-cell structure. Subsequently, a basal descent of the midbody correlates with the detachment of the neighbouring cell membranes, disengagement of the daughter cells from their neighbours and the formation of mature TCJs. The detachment of the neighbouring cells from the midbody is independent of abscission. On the contrary, the loss of Gli or Aka function prevents the resolution of the connection between the daughter-neighbour cells and the midbody movement. Altogether, we propose that TCJ proteins control an additional step of cytokinesis necessary for the disentanglement of the daughter cells and their neighbours during epithelial cytokinesis.

Le contrôle de la qualité des fruits est un objectif de recherche agronomique, génétique mais également de production. La notion de qualité est cruciale pour les fruits destinés au commerce du fruit frais. Chez les agrumes, fruitier non climactérique, elle est définie sur l'arbre et utilisée pour déclencher la récolte qui doit précéder l'abscission des fruits. Néanmoins cette chute de fruit est parfois très proche du stade de maturité et occasionne donc des pertes du fait de délais trop courts pour assurer la récolte. Ceci est généralement observé chez les orangers cultivés en Espagne et en Tunisie. Par ailleurs, la qualité d'un agrume est souvent définie par la couleur de peau, la taille du fruit, l'absence de pépin, l'arôme et les teneurs en jus, en sucres et en acidité. Si l'absence de pépin peut être obtenue par la mutation induite ou par la triploïdie, le contrôle de la variation des autres caractères repose sur de nombreux facteurs: la variété, l'interaction avec le porte-greffe, les effets de l'environnement et les techniques culturales. Parmi eux le génotype variétal, c'est-à-dire sa structure génétique héritée de ses parents est un facteur prépondérant pour atteindre le niveau d'amélioration attendu. L'obtention d'une structure génétique adaptée aux objectifs de production n'est pas aisée car les caractéristiques liées à la reproduction telles que la polyembryonie, la phase juvénile ou l'auto-incompatibilité gamétique, sont contraignantes chez les agrumes. Dans le cadre de ce travail, nous avons eu pour objectif de développer des connaissances sur la variation des caractères de la qualité du fruit, en y incluant l'abscission, mais également sur leur héritabilité et leur hérédité afin de faciliter les programmes de sélection et de création variétale. Nous avons tout d'abord étudié la variation de l'abscission chez plusieurs variétés d'orangers sur 3 sites, en Tunisie en Espagne et en Corse. Cette étude démontre que pour des variétés identiques, le processus d'abscission mesurée via la diminution de la force de détachement du fruit du pédoncule (FDF), est très dépendante de l'environnement et non des caractères de qualité du fruit. De façon originale la Corse ne semble pas être favorable à l'expression de ce caractère. Parmi les facteurs environnementaux décrits sur les trois sites, celui de l'augmentation du nombre de jours favorable à la croissance (température moyenne ≥ 13°C) en fin d'hiver semble être à l'origine de la chute massive et soudaine des fruits. Néanmoins, en Corse, la FDF peut aussi diminuer au cours de la maturation sur d'autres agrumes que les oranges. L'analyse de l'hérédité des caractères de la qualité des fruits et de leur abscission a été réalisée par une approche de la ségrégation de QTLs dans une population de 116 hybrides issus d'un croisement de type backcross (clémentinier × mandarinier), le clémentinier étant déjà un hybride (mandarinier x oranger). Les analyses ont été reproduites sur deux campagnes de production à plusieurs dates de maturité et bornées par celles des deux parents. La plupart des caractères ont une variation importante et une hérédité transgressive découlant de l'hétérozygotie élevée des génomes parentaux. Trois cartes génétiques ont été développées (les parentales et la consensus) à l'aide de marqueurs SNP et SSR couvrant environ 75% du génome de référence. Après estimation de l'effet aléatoire sur la variance des caractères (BLUP), des QTLs de chacun des caractères ont été détectés (1 QTL pour l'acidité, le citrate, la teneur en jus, la TSS, la FDF à 5 QTLs pour l'indice a* de coloration). La plupart d'entre eux ne sont détectés qu'à une seule date de maturation. La stabilité interannuelle et inter-population de ces QTLs devra être vérifiée avant une possible utilisation des marqueurs liés dans les programmes d'amélioration. / Fruit quality control is an agronomic, genetics and production research objective. The concept of quality is crucial for fruit produced for the fresh fruit market. In citrus, which are non-climacteric fruit, fruit quality traits in the tree is set to trigger the harvest time that must precede fruit abscission. However, this fruit drop is sometimes very close to the stage of maturity and therefore causes losses because of shorter time to ensure the harvest. This is usually observed in orange grown in Spain and Tunisia. Furthermore, the quality of a citrus fruit is often defined by the skin color, fruit size, lack of seeds, aroma and juice content, sugar and acidity. If seedlessness can be obtained by induced mutations or triploidy, the control of the change in other characters is based on many factors: variety, interaction with the rootstock, environmental impact and cultivation techniques. Among them, the varietal genotype, which means the genetic structure inherited from the parents, is a key factor to achieve the expected level of improvement in breeding. In citrus, obtaining a genetic structure adapted to production targets is not easy because the characteristics associated with reproduction such as polyembryony, juvenility or gamete self-incompatibility. In the present work, we aimed to develop knowledge on the variation of fruit quality traits by including abscission, heritability and traits inheritance to facilitate breeding programs and breeding.We first studied the variation of the abscission in several varieties of orange on 3 sites, Tunisia, Spain and Corsica. This study showed that for the same varieties, the process of abscission measured by investigating the decrease the fruit detachment force (FDF) required to separate the fruit from the calyx, was very dependent on the environment, but not on the fruit quality traits. Interestingly, Corsica does not seem favorable to the expression of this trait. Among the environmental factors described on the three locations, the increase of the number of days that favor growth (average temperature ≥ 13 °C) in late winter seems to be the cause of the sudden and massive fruit drop. Nevertheless, in Corsica, the FDF can also decrease during maturation in other citrus than oranges.The analysis of inheritance of fruit quality traits and abscission was achieved by investigating the segregation of QTLs in a population of 116 hybrids resulting from a backcross (clementine × mandarin), clementine being itself a hybrid (mandarin × orange). Analyzes were replicated two consecutive years at several maturity dates which were bounded by maturity dates of both parents. Most traits presented a significant variation and a transgressive inheritance arising from the high heterozygosity of parental genomes. Three genetic maps have been developed (parental and consensus) using SSR and SNP markers covering about 75% of the reference genome. After estimating the random effect on the variance of the traits (BLUP), QTLs of each trait were detected (1 QTL for acidity, citrate, juice content, TSS, FDF as well as 5 QTLs for the a* color index). Most of them were detected at a single date of maturation.Interannual and inter-population stability of these QTLs will be checked before any possible use of the linked markers in breeding programs.

Polar body emission (PBE), a form of asymmetric division, occurs twice during vertebrate oocyte maturation and is required to produce a haploid egg for sexual reproduction. Our lab elucidated parts of the mechanism that regulates PBE in Xenopus laevis oocytes. Cdc42 and RhoA, two GTPases, were shown to mediate membrane protrusion and the contractile ring, respectively. It is believed that cdc42 is mediating the protrusion by regulating actin polymerization. However, it is not clear what upstream signaling pathway regulates cdc42 activation during PBE. One possibility is calcium signaling, which occurs at fertilization, and is required for second PBE. Interestingly, the fertilization calcium transient also regulates cortical granule exocytosis/membrane retrieval, a process that also involves cdc42-mediated actin assembly. Furthermore, active cdc42 and RhoA are found in non-overlapping concentric zones in single-cell wound healing; their activation requires calcium signaling. To determine possible calcium transients during polar body emission, we employed the calcium-binding C2 domain of PKCβ in live cell imaging. Surprisingly, the most prominent C2 signal was seen after cdc42 activation and membrane protrusion. Co-localization experiments indicated that the C2 signal appeared at the cortical area marked by the contractile ring component anillin, and after partial constriction of the ring. Injection of the calcium chelator, dibromo-BAPTA, abolished the C2 signal, suggesting that it is indeed depicting a calcium transient. Dibromo-BAPTA injection also inhibited polar body abscission, as assessed by a novel abscission assay developed in our lab. We have for the first time detected a calcium signal during PBE that is essential to the last step of cytokinesis—abscission.