Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-14T19:25:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T17:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T17:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-16T17:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Geissospermum urceolatum is an Apocynaceae popularly known as acariquara-branca, acariquara, quinarana, acariubarana, acarirana, pereira, pau-pereira and pau-forquilha. Besides the quality of its wood, the bitter bark infusion is commonly used in the folk medicine of the Amazonian region to treat stomachache, fever and malaria. There are no scientific reports of this species confirming these actions. This work shows the effects of Geissospermum urceolatum alkaloids in the arterial blood pressure and in rats smooth mucle contraction. The dried and powdered bark was extracted obtaining the aqueous extract (AE) by infusion (2,5%), the ethanolic extract (EETOH) by maceration with ethanol 50% at room temperature, the hydro-alcoholic extract (HAE) by extraction in the Soxhlet apparatus with ethanol 80%; the extracts were filtrated and concentrated. The HAE was re-suspended in chloroform and partitioned with acidic water generating the total alkaloids fraction (TAF). The importance of the popular indication as anti-malarial guided the TAF preliminary test in rodents infected with Plasmodium chabaudi. The TAF purification by HPLC yielded 14 fractions referent to the main peaks (>1% of chromatogram total area), possible chemical markers of the extract after identification and pharmacological evaluation. In the immediate chemical standardization performed to the pharmacological studies, 6 major components were chosen, they are still in identification process. The studies with the standardized extracts were planned for the experimental detection of a wide spectrum of the pharmacological actions, from general tests in vivo with oral administration of the extracts until the study of the purified fractions in isolated preparations in vitro. The pharmacological screening was initiated with the observation test, or Hippocratic test. The oral administration of EETOH (1,0 g/kg) did not produce evident signs of pharmacological activity in the animals. However, the systemic administration by intra-peritoneal pathway reduced the motility, the respiratory rate and produced cyanosis with occurrence and intensity proportional to the doses. These effects were faster and more intense with TAF, confirming the higher concentration of the compounds in this fraction. In anesthetized rats blood pressure, TAF induced fast and temporary hypotension without affecting the hypertensive effect of noradrenalin or the hypotension induced by acetylcholine. Higher doses produced irregular responses with late reversion to the basal level. In rats atrium and papillary muscle, TAF inhibited the pacemaker excitability, but facilitated the excitation-contraction coupling, potentiating the papillary muscle contraction. In rat aortic rings with intact endothelium, TAF relaxed the muscular tonus induced by noradrenalin, but with NOS blockade by the previous incubation of L-NAME, the effect was only 40%, indicating a NO independent mechanism in the TAF relaxant activity. This possibility was confirmed when TAF also relaxed the endothelium deprived aortic rings preparations. In depolarized rat portal vein, TAF reduced the maximum contraction produced by CaCl2 addition, indicating the calcium channel blockade by the alkaloids. In rat vas deferens, TAF potentiated the maximum contraction induced by noradrenalin and reduced the drug affinity to the α1-adrenergic receptors; the acethylcholine action was not changed. These results showed that TAF potentiated the second-messengers of the adrenergic pathway, but did not potentiate the contraction when the second-messengers were activated by the muscarinic receptors stimulation. The study of the purified alkaloids will be essential to understand the mechanisms of action of the effects until now observed. The present work show results with vasorelaxation that may be explained by two mechanisms: indirect, via endothelial NOS activation and direct in the smooth muscle, apparently by blocking the calcium ion influx. This action, however, is not so clear because in the vas deferens, at the same time that the noradrenalin EC50 was increased in the presence of TAF, the maximum contractile effect of the agonist was potentiated, as if sensitization of the contractile myofibrils had been produced. The purification and isolation of the TAF constituents may permit the dissociation of the effects observed and the determination of the mechanisms of action, mainly of the poorly known effect that potentiated the maximum contraction of the total agonist noradrenalin. / Geissospermum urceolatum é uma Apocynaceae conhecida popularmente como acariquara-branca, acariquara, quinarana, acariubarana, acarirana, pereira, pau-pereira e pau-forquilha. Além da qualidade de suas madeiras, a casca da espécie possui um gosto amargo sendo utilizada comumente na forma de infusões pela medicina popular da Região Amazônica para tratamento de dores no estômago, tontura, febre e malária. Esta espécie não conta com trabalhos científicos confirmando essas ações. Este trabalho mostra os efeitos dos alcalóides de Geissospermum urceolatum A.H. Gentry (acariquara-branca) na pressão arterial e na contração do músculo liso de ratos. Cascas secas à sombra em temperatura ambiente e depois moídas foram extraídas; o extrato aquoso (EA) foi obtido por infusão a 2,5 %; o extrato etanólico (EETOH) foi obtido por agitação do pó a 2,5 % com etanol 50 % à temperatura ambiente; o extrato hidroalcoólico (EHA) à quente foi obtido em Soxhlet com etanol 80%. Os extratos foram filtrados e concentrados em rota evaporador. O EHA foi retomado em clorofórmio e extraído com água ácida, originando a fração alcalóides totais (FAT). A importância da informação popular do uso em malária orientou o teste preliminar da FAT em roedores infectados com Plasmodium chabaudi. A purificação da FAT em CLAE mostrou 14 frações referentes aos picos majoritários (>1% da área total do cromatograma), possíveis marcadores químicos do extrato depois de identificados e avaliados farmacologicamente. Na padronização química imediata realizada para o estudo farmacológico, foram considerados os 6 componentes químicos com os maiores picos, que encontram-se em processo de identificação. Os estudos com extratos padronizados foram planejados para a detecção experimental de um grande espectro de ação farmacológica, desde testes gerais in vivo por administração oral dos extratos, até o estudo das frações purificadas em preparações isoladas in vitro. A triagem geral da atividade farmacológica foi iniciada com o método de observação, ou Teste hipocrático. A administração oral, do EETOH (1,0 g/kg), não produziu sinais evidentes de atividade farmacológica nos animais. Com a administração sistêmica por via intraperitoneal, no entanto, o extrato diminuiu a motilidade, a frequência respiratória e produziu cianose nos animais, sendo todos os efeitos de aparecimento e intensidades proporcionais à dose. Com a FAT os efeitos foram mais rápidos e intensos confirmando a maior concentração dos compostos na fração. Na pressão arterial em ratos anestesiados, a FAT produziu uma hipotensão rápida e passageira, sem alterar o efeito hipertensor da noradrenalina, ou a hipotensão produzida pela acetilcolina. Doses maiores produziram respostas irregulares com reversão demorada. Em átrio e músculo papilar de rato, a FAT inibiu a excitabilidade do marca-passo, mas facilitou o acoplamento excitação-contração, potenciando a contração do músculo papilar; na aorta de rato com endotélio, a FAT relaxou o tônus muscular produzido pela noradrenalina, mas após o bloqueio da NOS com L-NAME, o relaxamento foi reduzido de apenas 40%, indicando um outro mecanismo independente de NO na ação relaxante da FAT. Esta possibilidade foi confirmada quando a FAT também relaxou a aorta desprovida de endotélio. Na veia porta despolarizada, a FAT reduziu a contração máxima produzida pela adição de CaCl2, indicando bloqueio dos canais de cálcio pelos alcalóides. Nos estudos em ducto deferente de rato, a FAT potenciou a contração máxima produzida pela incubação de noradrenalina, e diminuiu a afinidade da droga pelos receptores α1-adrenérgicos. A ação da acetilcolina não foi potenciada. Estes resultados mostraram que a FAT potenciou a ação de segundos-mensageiros da via adrenérgica, mas não potenciou a contração quando os segundos-mensageiros foram ativados pela estimulação dos receptores muscarínicos. O estudo dos alcalóides purificados será essencial para o entendimento dos mecanismos das ações até agora evidenciadas. O presente trabalho apresentou resultados que mostram ação vasodilatadora que pode ser explicada por dois mecanismos: indireto, via ativação de NOS endotelial e direto na musculatura lisa, aparentemente por bloquear o influxo de íons cálcio. Esta ação, no entanto, não é tão clara, pois na musculatura do ducto deferente, ao mesmo tempo em que a CE50 da noradrenalina é aumentada na presença da FAT, o efeito contrátil máximo do agonista foi potenciado, aparentando uma sensibilização das miofibrilas contráteis. A purificação e o isolamento dos constituintes deverá permitir a dissociação dos efeitos observados e a determinação dos mecanismos de ação, principalmente do efeito pouco conhecido que potenciou a contração máxima do agonista total noradrenalina.

Submitted by Wendell Amoedo (wendell.amoedo@hotmail.com) on 2018-11-26T15:15:35Z No. of bitstreams: 3 Tese Bruna de Oliveira-correcaoposdefesa-versaoFINAL.pdf: 9414772 bytes, checksum: 23fd577cbdccab11729ea5da62b18de2 (MD5) ficha catalografica.pdf: 1870 bytes, checksum: 853f822f2c2a4569b1b196a49b10a940 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Submitted by Wendell Amoedo (wendell.amoedo@hotmail.com) on 2018-11-28T12:59:58Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Bruna de Oliveira-correcaoposdefesa-versaoFINAL.pdf: 9414772 bytes, checksum: 23fd577cbdccab11729ea5da62b18de2 (MD5) ficha catalografica.pdf: 1870 bytes, checksum: 853f822f2c2a4569b1b196a49b10a940 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-11-28T18:11:52Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Bruna de Oliveira-correcaoposdefesa-versaoFINAL.pdf: 9414772 bytes, checksum: 23fd577cbdccab11729ea5da62b18de2 (MD5) ficha catalografica.pdf: 1870 bytes, checksum: 853f822f2c2a4569b1b196a49b10a940 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-28T18:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese Bruna de Oliveira-correcaoposdefesa-versaoFINAL.pdf: 9414772 bytes, checksum: 23fd577cbdccab11729ea5da62b18de2 (MD5) ficha catalografica.pdf: 1870 bytes, checksum: 853f822f2c2a4569b1b196a49b10a940 (MD5) Previous issue date: 2018-03-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The malaria situation in Brazil and in the world is still very worrying these days. One of the causes of this situation is the existence of Plasmodium strains resistant to current antimalarials. Therefore, there is a need for the search for new drugs, which are more effective and less toxic. Several plant species have been used in folk medicine as antimalarials, such as Cinchona spp. and Artemisia annua, plants that have been isolated from quinine and artemisinin. In the family Apocynaceae, the species of the genus Geissospermum and Aspidosperma, has been highlighted as an antimalarial potential. Thus, the objective of this work was to study the chemical composition and to evaluate the in vitro antiplasmodic activity of extracts, fractions and substances of Geissospermum urceolatum, through a bioguided study. The plant material was collected at the Ducke Forest Reserve of the National Institute of Amazonian Research (INPA), in Manaus, Amazonas. Seven (7) different extraction methods were compared for each part of the plant (leaf, twig and bark), but method 7 was tested only on the bark. In order to define the initial chemical profile of dry extracts, high resolution mass spectrometry (HRMS) analysis was performed by direct infusion of the samples. The data obtained by EMAR were treated and interpreted chemimetrically through the Chemoface program. These were evaluated by the plant separately (leaf, twig and bark), comparing extraction method, m / z and percentage relative to the base peak (greater than 5%). The nineteen extracts were tested for antimalarial activity (Inhibitory Concentration 50% - IC50) in vitro, three (3) of the shell extracts were active, with IC50 of 14.5 μg / mL, 12 μg / mL and 9 , 7 μg / mL respectively. The chemometric data were used to find a relation between the active extracts and the chemical profile, where what differentiates this group from the others is the presence of three (3) main peaks: 329,18; 175.18; 217.07. In order to correlate the activity and yield of the tested methods, method 7 (M7) was defined as the method of study, then a new scale extraction was performed, two dry extracts (BOT1 and BOT2) were obtained. Sephadex LH-20 and mobile phase 100% of the 8 subfractions obtained were submitted to IC 50 test, using a chromatographic column (CC) as the stationary phase. and EMAR. Of these, one was partially active (PA) (30 μg / mL) and one was active (A) (1.93 μg / mL). The dry extract (BOT2) was partitioned and 2 main fractions were obtained, both of which were submitted to NMR, HRT and IC50 test, both fractions were active. These fractions were fractionated using CC and HPLC, of these 4 substances were elucidated as: Methyl Sinapiato (S2) (IC50 24.5 μg / mL) and 4-N-methyl-akuammicine (S3) (IC50 27.1 μg / mL ) that did not present antiplasmodic activity in the in vitro tests; aspidocarpine (S1) (IC50 2.42 μg / mL) which showed lower antiplasmodic activity than observed in previous studies and phenyl propanoid (S4) dimer. The bioguided fractionation was efficient in the isolation of substances with antiplasmodic activity in vitro. / A situação da malária no Brasil e no mundo ainda é muito preocupante nos dias atuais. Uma das causas desta situação é a existência de cepas do Plasmodium resistente aos antimaláricos atuais. Por isso, há necessidade da busca por novas drogas, que sejam mais eficazes e menos tóxicas. Diversas espécies vegetais vêm sendo usadas na medicina popular como antimaláricos, como a Cinchona spp. e a Artemisia annua, plantas que foi isolado a quinina e a artemisinina. Na família Apocynaceae, as espécies do gênero Geissospermum e Aspidosperma, tem se destacado como potencial antimalárico. Assim, esse trabalho teve como objetivo estudar a composição química e avaliar a atividade antiplasmódica in vitro de extratos, frações e substâncias da Geissospermum urceolatum, através de estudo bioguiado. O material vegetal foi coletado na Reserva Florestal Ducke do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), em Manaus, no Amazonas. Foram comparados sete (7) métodos de extração diferentes para cada parte da planta(folha, galho e casca), porém o método 7 foi testado apenas na casca. Para definir o perfil químico inicial dos extratos secos foi realizada análise por espectroscopia de massa de alta resolução (EMAR) por infusão direta das amostras. Os dados obtidos por EMAR foram tratados e interpretados quimiometricamente através do programa Chemoface. Esses foram avaliados por parte da planta separadamente (folha, galho e casca), comparando método de extração, m/z e porcentagem em relação ao pico base (maior que 5%). Os dezenove (19) extratos foram testados para atividade antimalárica (Concentração Inibitória 50% - CI50) in vitro, três (3) dos extratos da casca se mostraram ativos, com CI50 de 14,5 μg/mL, 12 μg/mL e 9,7 μg/mL respectivamente. Os dados quimiométricos foram trabalhados para encontrar uma relação entre os extratos ativos e o perfil químico, onde o que diferencia esse grupo dos demais é a presença de três (3) picos principais: 329,18; 175,18; 217,07. Correlacionando atividade e rendimento dos métodos testados, definiu-se o método 7 (M7) como método de estudo, então uma nova extração em maior escala foi realizada, foram obtido dois extratos secos (BOT1 e BOT2). O extrato seco preparado (BOT1), foi submetido a fracionamento, utilizando coluna cromatográfica (CC), como fase estacionária foi utilizado Sephadex LH-20 e fase móvel MeOH 100%, das 8 subfrações obtidas, 5 foram submetidas a teste de CI50, RMN e EMAR. Destas uma foi parcialmente ativa (PA) (30 μg/mL) e uma foi ativa (A) (1,93 μg/mL). O extrato seco (BOT2) foi submetido a partição e foi obtido 2 frações principais, ambos foram submetidos RMN, EMAR e teste de CI50, ambas frações foram ativas. Essas frações foram fracionadas utilizando CC e CLAE, destas 4 substâncias foram elucidadas como: Sinapiato de metila (S2) (CI50 24,5 μg/mL) e 4-N-metil-akuammicine (S3) (CI50 27,1 μg/mL) que não apresentaram atividade antiplasmódica nos testes in vitro; aspidocarpina (S1) (CI50 2,42 μg/mL) que apresentou atividade antiplasmódica menor do que observado em estudos anteriores e o dímero de fenil propanóide (S4). O fracionamento bioguiado se mostrou eficiente no isolamento de substâncias com atividade antiplasmódica in vitro.