GOMES, B. A.; Contribuição ao conhecimento químico de plantas do Nordeste: Cissus verticillata L. (Vitaceae). 2012. 114 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2014-10-17T18:12:03Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-11-11T23:27:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T23:27:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) Previous issue date: 2012 / The presente work describe the results of chemical study of Cissus verticillata (Vitaceae), plant known as insulin and commonly used as anti-diabetic. Using column chromatography on silica gel from the hexane extract of the stems was isolated a steroid (β-sitosterol), while the hexane extract of leaves provided an alcohol (tetracosonol) and a pentaciclic triterpene (3β-taraxerol). In addition, from the original constituents, using classical chemical reactions (acetylation, oxidation and formulation), derivatives were prepared in order to compare the original constituents with the derivatives with respect to anticholinesterase activity. We also studied the composition of fatty acids present in the hexane extract of the stems through the process of saponification followed by methylation and analised using gas chromatography coupled to mass spectrometry. All compounds original constituents and derivatives) were characterized by spectrometric methods, nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C, infra-red and mass spectroscopic. / O presente trabalho descreve o estudo da espécie botânica Cissus verticillata (Vitaceae) conhecida como “insulina vegetal” que é utilizada popularmente como anti-diabética. Através de cromatografia gravitacional utilizando gel de sílica como fase estacionária foi isolado um constituinte esteróidal, β-Sitosterol a partir do extrato hexânico dos talos e do extrato hexânico das folhas foi isolado um álcool primário conhecido como n-tetracosanol e um triterpeno chamado 3β-taraxerol. Em adição, foram efetuadas algumas reações clássicas para obtenção de derivados, inclusive com o objetivo de comparar a atividade biológica desses derivados com a do constituinte original. Assim, foram realizados testes de atividade anticolinesterásica do constituinte original e dos produtos das reações de acetilação, formilação e oxidação. O estudo do extrato hexânico dos talos e das folhas de C. verticillata L. após saponificação com KOH/MeOH seguida de metilação, forneceu uma mistura de ésteres metílicos que foram identificados por CG/EM. Os principais componentes foram o ácido hexadecanóico, ácido 9,12 octadecadienóico, ácido octadecanóico, ácido eicosanóico, ácido docosanóico. Na caracterização dos metabólitos secundários isolados, assim como, de seus produtos reacionais, foram empregadas técnicas espectrométricas de análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, infravermelho (IV) e espectrometria de massa (EM).

GOMES, B. A. Contribuição ao conhecimento químico de plantas do Nordeste: Cissus verticillata L. (Vitaceae). 2012. 114 f. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2014-10-31T20:39:53Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-03-11T21:52:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T21:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_bagomes.pdf: 3852147 bytes, checksum: 4b535f4f3fae61bbf501ea1c0171a3e9 (MD5) Previous issue date: 2012 / The presente work describe the results of chemical study of Cissus verticillata (Vitaceae), plant known as insulin and commonly used as anti-diabetic. Using column chromatography on silica gel from the hexane extract of the stems was isolated a steroid (β-sitosterol), while the hexane extract of leaves provided an alcohol (tetracosonol) and a pentaciclic triterpene (3β-taraxerol). In addition, from the original constituents, using classical chemical reactions (acetylation, oxidation and formulation), derivatives were prepared in order to compare the original constituents with the derivatives with respect to anticholinesterase activity. We also studied the composition of fatty acids present in the hexane extract of the stems through the process of saponification followed by methylation and analised using gas chromatography coupled to mass spectrometry. All compounds original constituents and derivatives) were characterized by spectrometric methods, nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C, infra-red and mass spectroscopic. / O presente trabalho descreve o estudo da espécie botânica Cissus verticillata (Vitaceae) conhecida como “insulina vegetal” que é utilizada popularmente como anti-diabética. Através de cromatografia gravitacional utilizando gel de sílica como fase estacionária foi isolado um constituinte esteróidal, β-Sitosterol a partir do extrato hexânico dos talos e do extrato hexânico das folhas foi isolado um álcool primário conhecido como n-tetracosanol e um triterpeno chamado 3β-taraxerol. Em adição, foram efetuadas algumas reações clássicas para obtenção de derivados, inclusive com o objetivo de comparar a atividade biológica desses derivados com a do constituinte original. Assim, foram realizados testes de atividade anticolinesterásica do constituinte original e dos produtos das reações de acetilação, formilação e oxidação. O estudo do extrato hexânico dos talos e das folhas de C. verticillata L. após saponificação com KOH/MeOH seguida de metilação, forneceu uma mistura de ésteres metílicos que foram identificados por CG/EM. Os principais componentes foram o ácido hexadecanóico, ácido 9,12 octadecadienóico, ácido octadecanóico, ácido eicosanóico, ácido docosanóico. Na caracterização dos metabólitos secundários isolados, assim como, de seus produtos reacionais, foram empregadas técnicas espectrométricas de análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, infravermelho (IV) e espectrometria de massa (EM).

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’- nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´- nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

MARQUES, Rosemarie Brandim. Estudo prospectivo de pacientes com intoxicação aguda por inseticidas organofosforados, atendidos no CEATOX. 2005. 98 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-01-04T13:20:50Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_rbmarques.pdf: 286400 bytes, checksum: e18c94db1de7e0ab89211025bb4a6010 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-01-23T11:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_rbmarques.pdf: 286400 bytes, checksum: e18c94db1de7e0ab89211025bb4a6010 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-23T11:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_rbmarques.pdf: 286400 bytes, checksum: e18c94db1de7e0ab89211025bb4a6010 (MD5) Previous issue date: 2005 / The importance of the pesticides causal agent of intoxication and deaths is clearly shown by the number of registered cases, mainly in developed countries. In Brazil, pesticides places the third more important group of substances responsible for acute intoxication. They act through enzymatic inhibition (acetylcholinesterase) in an irreversible way, leading to characteristic cholinergic signs and symptoms. They are also able to cause the intermediary syndrome and the delayed polyneuropathy. This study aimed to set out the poisoning patients’ epidemiological outline in Ceará state, observed from February to July 2004, who received medical care at Centro de Assistência Toxicológica do Ceará (CEATOX); evaluating the proposed treatment; verifying the signs and symptoms related to the cholinergic and intermediary syndromes; analyzing the risk factors matched to patients recovery. Some preliminary data were obtained from January 2002 to June 2003 concerning to these poisoning events. The data collection was performed from medical recording, CEATOX notification files and patients or their companion interviews. 19 patients were analyzed, 10 (52,6%) men and 9 (47,4%) women. The average age was 27,8 ± 11,4. Agriculturists represented 42,1% (8/19) of all cases. Attempted suicide constituted 84,2% (16/19). There were 4 (21,1%) deaths. The main clinical observations were diarrhea (78,9%), myosis (57,9%) and sialorrhea (52,6%). The AChE levels were measured immediately after admission and expressed in terms of mean ± standard deviation (1,06 ± 1,50 UI/mL). The other AChE measurements were performanced during the permanence of the patients in the hospital. Among clinical complications, those ones related to the respiratory tract were the most relevant (57,2%). Atropine was administered to 16 (84,2%) patients. The average time of admission was 8,6 ± 8,5 days. There was statistical association when were compared ventilation, time spent in the ICU and type of intoxication with clinical complications (p<0,05) (Chi-square test and Fisher’s test). The logistic regression did not show statistical differences when the death risk was analyzed comparing to the studied variables. The results stress the need to adopt more suitable measures with a restructured protocol in handling patients intoxicated with IOF, giving ample publicity at the hospital units of Dr. José Frota Institute and others. The data obtained also point out the critical situation in Ceará State in the use, misure or inappropriate vigilance by the sanitary authorities. / A importância dos praguicidas como agente causal de intoxicações e óbitos é evidenciado pelo número de ocorrências registradas, principalmente nos países em desenvolvimento. No Brasil, os praguicidas ocupam a terceira posição dentre os agentes responsáveis por intoxicações agudas. Eles agem por inibição enzimática (acetilcolinesterase) de modo irreversível, podendo provocar aparecimento de sinais e sintomas colinérgicos característicos. Podem causar ainda o aparecimento da síndrome intermediária e da polineuropatia tardia. Este estudo teve como objetivos traçar o perfil epidemiológico dos pacientes intoxicados no estado do Ceará, no período de fevereiro a julho de 2004, atendidos no Centro de Assistência Toxicológica do Ceará (CEATOX); avaliar o tratamento proposto; verificar os sinais e sintomas das síndromes colinérgica e intermediária e analisar os fatores de risco associados à evolução dos pacientes. Foi realizado um levantamento de dados preliminares referentes a janeiro de 2002 até junho de 2003. A coleta dos dados foi realizada a partir dos prontuários médicos, fichas de notificação do CEATOX e entrevista com o paciente ou responsável. Foram analisados 19 pacientes, sendo 10 (52,6%) do sexo masculino e 9 (47,4%) do feminino. A média de idade foi 27,8±11,4 anos. A ocupação trabalhador agrícola representou 42,1% (8/19). As tentativas de suicídio representaram 84,2% (16/19) dos casos. Houve 4 (21,1%) óbitos. As principais manifestações clínicas foram diarréia (78,9%), miose (57,9%) e sialorréia(52,6%). Fez-se dosagem da AChE na admissão dos pacientes intoxicados, sendo média e desvio-padrão 1,06±1,50 UI/mL. As demais dosagens foram feitas no decorrer do internamento de cada paciente. Dentre as complicações clínicas, as do trato respiratório foram as mais importantes (57,2%). Atropina foi administrada em 16 (84,2%) dos pacientes. A média de internação foi 8,6±8,5dias. Houve associação estatística quando se comparou ventilação, tempo de UTI e tipo de intoxicação com o surgimento de complicações clínicas (p<0,05) (teste do qui-quadrado e exato de Fisher). A regressão logística não mostrou significância estatística quando analisou risco de óbito a partir das variáveis em estudo. Os resultados mostraram que se faz necessário uma reestruturação no protocolo de atendimento e tratamento dos pacientes intoxicados com IOF, bem como sua divulgação no hospital Instituto Dr. José Frota e em outras unidades hospitalares. Os resultados demonstram ainda a situação crítica quanto ao uso inadequado de praguicidas organofosforados no estado do Ceará e a necessidade de orientação ao consumidor e adequada vigilância sanitária quanto ao uso e comercialização dos mesmos.

Submitted by Tania Ivani Rokohl (tania.rokohl@uffs.edu.br) on 2018-03-14T13:09:55Z No. of bitstreams: 1 PHILIPPSEN.pdf: 516265 bytes, checksum: c031eafdd18797ffabec9c1c4bde8d63 (MD5) / Approved for entry into archive by Diego dos Santos Borba (dborba@uffs.edu.br) on 2018-03-14T14:00:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PHILIPPSEN.pdf: 516265 bytes, checksum: c031eafdd18797ffabec9c1c4bde8d63 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T14:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PHILIPPSEN.pdf: 516265 bytes, checksum: c031eafdd18797ffabec9c1c4bde8d63 (MD5) Previous issue date: 2018-01-18 / Atualmente os produtos orgânicos têm ganhado destaque por sua qualidade nutricional, segurança alimentar e pela sustentabilidade na sua produção. A produção orgânica utiliza fungicidas à base de cobre, como a calda bordalesa, que é composta por sulfato de cobre e cal hidratada. O cobre é um elemento químico natural e fundamental para os organismos vivos, porém há controvérsias em relação aos efeitos causados ao ambiente e à saúde humana. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os teores de cobre em solos e sucos de laranja e uva de uma propriedade orgânica que utiliza a calda bordalesa como fungicida, e a partir das concentrações encontradas, avaliar os efeitos da exposição aguda e crônica sobre o sistema nervoso de Caenorhabditis elegans. O estudo iniciou a partir da coleta dos solos e das frutas, logo após a colheita foram extraídos os sucos de laranja e uva. Posteriormente, foram analisadas as concentrações de cobre em solos e nos sucos de laranjas e uvas através de Espectrofotometria de Absorção Atômica por Plasma de Argônio. Após a determinação dos teores de cobre nos sucos de laranjas e uvas, os C. elegans foram divididos em cinco grupos, o grupo controle recebeu água ultrapura, e os tratados com cobre receberam as doses de 0,05 mg/L, 0,1 mg/L, 0,3 mg/L e 0,7 mg/L. Após a exposição foram avaliados parâmetros comportamentais e enzimáticos de cepas selvagens de C. elegans. Os ensaios das exposições aguda e crônica dos C. elegans ao cobre demonstraram que houve alterações da atividade da Acetilcolinesterase. Na exposição aguda as doses de 0,05 mg/L, 0,1mg/L e 0,7 mg/L ativaram a enzima, resultado similar foi encontrado após exposição crônica para as doses 0,3 mg/L e 0,7 mg/L. Já as doses de 0,05 mg/L e 0,1 mg/L inibiram a enzima após exposição crônica. Os organismos expostos também mostraram alterações comportamentais, como redução nos batimentos faríngeos à exposição aguda na dose de 0,05 mg/L e 0,7 mg/L em exposição crônica e aumento no ciclo de defecação nas doses de 0,1 mg/L e 0,3 mg/L em exposição aguda e redução em exposição crônica à 0,3 mg/L. Conforme já era esperado os níveis de cobre estavam aumentados nos solos que receberam o fungicida a base de cobre, o mesmo foi encontrado para os sucos. Porém, observou-se que as doses encontradas nos sucos promoveram significativas alterações no sistema colinérgico o que repercutiu no comportamento dos vermes. Assim, recomenda-se maior critério para aplicação de calda bordalesa, considerando que o cobre por ser um metal tem potencial de bioacumulação nos sistemas biológicos. / Currently, organic products have gained attention for its nutritional quality, food safety and sustainability in its production. Organic farming uses copper-based fungicides such as a Bordeaux mixture, which is composed of hydrated lime and copper sulfate. Copper is a natural and essential chemical element for living organisms, but there are controversies regarding the effects on the environment and human health. Thus, the objective of this study was to evaluate the copper content in soils, orange and grape juice of an organic property that uses the Bordeaux mixture as fungicide, and from the concentrations found, to evaluate the effects of acute and chronic exposure on Caenorhabditis elegans nervous system. The study started from the collection of soil and fruit, after harvest were extracted the orange and grape juices. Subsequently, the copper concentrations in soil and in the juice were analysed by Atomic Absorption Spectrometry Plasma Argon. After determination of the copper concentration in the juices, the C. elegans were divided into five groups, the control group received ultrapure water, and treated with copper received the 0.05 mg/L, 0.1 mg/L, 0.3 mg/L and 0.7 mg/L. After the exposure, behavioral and enzymatic parameters of wild strains of C. elegans were evaluated. The trials of acute and chronic exposures of C. elegans to copper showed that there were changes in acetylcholinesterase activity. In the acute exposure doses of 0.05 mg/L, 0.1 mg/L and 0.7 mg/L activated the enzyme, a similar result was found after chronic exposure at doses 0.3 mg/L and 0.7 mg/L. Doses of 0.05 mg/L and 0.1 mg/L inhibited the enzyme after chronic exposure. Exposed organisms also showed behavioral changes, such as reduction in pharyngeal beats to acute exposure at a dose of 0.05 mg/L and 0.7 mg/L on chronic exposure and increase in the defecation cycle at doses of 0.1 mg/L and 0.3 mg/L on acute exposure and reduction on chronic exposure at 0.3 mg/L. As expected, copper levels were increased in soils that received the copper-based fungicide, the same was found for juices. However, it was observed that the doses found in the juices promoted significant changes in the cholinergic system, which had repercussions on the behavior of the worms. Thus, it is recommended major criterion for the application of Bordeaux mixture, considering that copper metal has to be a potential for bioaccumulation in biological systems.

CHAVES, Tatiana Vieira Souza. Avaliação do impacto do uso de agrotóxicos nos trabalhadores rurais dos municípios de Ribeiro Gonçalves, Baixa Grande do Ribeiro e Uruçuí - Piauí. 2007. 195 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-16T17:54:35Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tvschaves.pdf: 2438260 bytes, checksum: b50584fb7e9892c6a9a7c3d8ec4c33e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-18T13:03:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tvschaves.pdf: 2438260 bytes, checksum: b50584fb7e9892c6a9a7c3d8ec4c33e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-18T13:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tvschaves.pdf: 2438260 bytes, checksum: b50584fb7e9892c6a9a7c3d8ec4c33e8 (MD5) Previous issue date: 2007 / The pesticides are some of the main risky factors for agricultural laborers’ health. In the state of Piauí, the agricultural expansion which was implemented in the cerrados through the growth of the soy crops in the 90’s was a relevant factor that increased the use of pesticides. The unbalanced usage of pesticides is often related to acute and chronic poisonings. The dosage of plasma cholinesterase and erythrocyte cholinesterase are relevant parameters to diagnose mainly cases in which an acute contact has occurred. The genotoxicity related to the use of these kinds of products has been studied and there are strong evidences that they are carcinogenic. Deaths which the main suspicion was poisoning by the misuse of agricultural pesticides happened in September of 2007 in the city of Ribeiro Gonçalves, state of Piauí. The fact unchained an investigation in the cities that produce soy (Uruçuí, Ribeiro Gonçalves and Baixa Grande do Ribeiro). The purpose of this study was evaluating the impact of the use of pesticides on agricultural laborer’s health in the cities of Uruçuí, Ribeiro Gonçalves and Baixa Grande do Ribeiro. The study was divided in three steps. Firstly, a social epidemiologic questionnaire Word Health Organization (WHO) was applied and samples and collected material to biochemical, hematological and enzymatic plasma acetylcholinesterase and erythrocyte acetylcholinesterase analysis of 120 agricultural laborers from the region. The second step was a study of these workers. These ones submitted salf of Piauí to a second evaluation which used, as a tool, the tests which had been previously discribed. In the third step 31 individuals with irregular parameters were submitted to a micronucleus test. Cells from the oral mucosa were collected to evaluate the level of DNA injury through micronucleus counting. The results of the social epidemiologic questionnaire pointed that 100% of the subjects who had benn studied were males with an average age of 35 years old. 66% were married, 76.67% worked in farms (farmers, machinists and agricultural technicians), 16.67% worked as endemic diseases agents or civil servants. 21.3% of them used non-prescribed medication and 71.67% had not did medical tests for the last 6 months. About life and work style the investigation showed that 33.33% of the workers is smokers, 55.83% drink alcohol, 29.9% has direct contact with the pesticide while it was being prepared to be use, 38% during the pulverization process, 10% during the equipment cleaning and maintenance, 17.5% did not take any safety protection measure, while the most used only a single kind of EPI. Another related discovery about the workers showed that they used more than 34 different formulations. Insecticides (45.18%), herbicides (27.68%) and fungicides (6.21%) were the most used products. Concerning the time of exposure the workers had to the pesticides, 50.84% were exposed to them for less than 2 years and 10% for more than 10 years. The effects on the SNC detached themselves among the most related symptoms with a 230 complaints reported during the application of the social epidemiologic questionnaire. Concerning the final destination of the containers, 84.21% were burned, buried and left outdoors while 15.79% were brought to the appropriate organ headquarter. The results from the biochemical and hematological analysis indicated that 11.67%; 4.17%; 10.83%; 0.83%; 5.83%; 5% e 9.17% of the individuals who were submitted to the first sample collection had, respectively, irregular levels of Gamma-Glutamyl Transferase (GGT); Alkaline Fosfatase and Glutamic-Oxaloacetic Transaminase/ Glutamic Pyruvic Transaminase; Urea; Creatinine; Proteic components; Plasma acetylcholinesterase and Erythrocyte acetylcholinesterase. The findings in the second step indicated that the individuals had irregular levels of: Gamma GT (4.00%); Alkaline Fosfatase and GOT/GPT (4.00%); Urea (4.00%); Creatinine (5.33%); Total Protein (17.33%); Plasma acetylcholinesterase (4.00%) and Erythrocyte acetylcholinesterase (2.67%). In the third step, 84.00% of the 31 subjects who had a micronucleus test presented cytogenetic injuries. The cytogenetic injuries which could be observed were not related to age, smoke, alcohol consumption; safety equipment, medications and diseases which confirms the co-relation between the presented cytogenetic injuries and the exposure to pesticides ( P<0.05). / Os agrotóxicos estão entre os mais importantes fatores de risco para a saúde dos trabalhadores. No Piauí, a expansão agrícola implementada nos cerrados, por intermédio da intensificação do plantio de soja, a partir da década de 1990, consistiu em um forte fator para o aumento do uso de agrotóxicos. A utilização indiscriminada dos agrotóxicos, geralmente, está associada a intoxicações agudas e crônicas. A dosagem de colinesterase plasmática e eritrocitária são parâmetros relevantes para diagnóstico de casos cuja exposição se deu, principalmente, de forma aguda. A genotoxicidade associada ao uso destes produtos vem sendo estudada, sendo fortes as evidências que estes produtos são carcinogênicos. No estado do Piauí, em setembro de 2005, no município de Ribeiro Gonçalves, ocorreram mortes cuja suspeita principal era de intoxicação por uso dos pesticidas agrícolas. Este fato desencadeou uma investigação nos municípios produtores de soja (Uruçuí, Ribeiro Gonçalves e Baixa Grande do Ribeiro). O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto do uso de agrotóxicos sobre a saúde dos trabalhadores rurais dos municípios de Uruçuí, Ribeiro Gonçalves e Baixa Grande do Ribeiro. Dividiu-se, metodologicamente, o estudo em três etapas. Na primeira, aplicou-se questionário sócio epidemiológico de acordo com Organização Mundial de Saúde (OMS) e coletaram-se amostras de material biológico para análises bioquímicas, hematológicas e enzimáticas (acetil colinesterase plasmática e eritrocitária) de 120 trabalhadores agrícolas da região sul do Piauí. Na segunda etapa, estudou-se 75 indivíduos. Estes se submeteram a uma segunda avaliação, tendo como ferramenta os mesmos exames anteriormente realizados. Como terceira etapa, realizou-se o teste de micronúcleo em 31 indivíduos que encontravam-se com os parâmetros alterados. Fez-se coleta de células da mucosa oral, para avaliação do nível de lesão de DNA através de contagem de micronúcleos. Quanto ao questionário sócio epidemiológico os resultados encontrados indicaram que 100% da população estudada pertencia ao sexo masculino, com idade média de 35 anos. Ainda sobre o questionário, 66% eram casados, 76,67% trabalhavam em fazendas (lavradores, operadores de máquinas e técnicos agrícolas), 16,67% eram agentes de endemias ou servidores público, sendo que 21,3% tomavam medicamento sem prescrição médica e que 71,67% não realizaram exames médicos nos últimos 06 meses. A investigação evidenciou ainda que, quanto ao estilo de vida e trabalho, 33,33% dos trabalhadores possuem o hábito de fumar, 55,83% de consumir bebidas alcoólicas, 29,9% entraram em contato direto com o agrotóxico durante o preparo do produto, 38% através da aplicação do produto por pulverização, 10% através da limpeza e manutenção dos equipamentos, 17,5% não utilizavam nenhuma proteção, sendo que a grande maioria utilizavam apenas 01 tipo de EPI. Outro achado relatado refere-se que os trabalhadores utilizaram mais de 34 diferentes formulações, sendo as classes mais utilizadas os inseticidas (45,18%), herbicidas (27,68%) e fungicidas (6,21%). Quanto ao tempo de exposição dos trabalhadores aos pesticidas, 50,84% estavam expostos a menos de 2 anos e 10% estavam expostos a mais de 10 anos. Dentre os sintomas mais relatados, os efeitos no SNC destacaram-se com 230 queixas relatadas durante a aplicação do questionário sócio-epidemiológico. Sobre o destino final das embalagens, 84,21% dos mesmos eram queimados, enterrados e deixados a céu aberto, sendo 15,79% entregues na central de recebimento. Em relação às análises bioquímicas e hematológicas dos indivíduos submetidos à primeira coleta, os resultados indicaram que 11,67%; 4,17%; 10,83%; 0,83% ; 5,83%; 5% e 9,17% encontravam-se com níveis respectivamente alterados de Gama GT, Fosfatase Alcalina e TGO/ TGP, Uréia, Creatinina componentes protéicos, acetilcolinesterase plasmática e eritrocitária . Na segunda etapa, os achados indicaram que os indivíduos estavam com os níveis alterados de: gama GT ( 4,00%); fosfatase alcalina e TGO/TGP ( 4,00%); uréia (4,00%); creatinina (5,33%); proteínas totais (17,33%); acetilcolinesterase plasmática (4,00%) e acetilcolinesterase eritrocitária (2,67%). Com relação à terceira etapa, dos 31 indivíduos que realizaram teste de micronúcleo 84,00% encontravam-se com danos citogenéticos. Os danos citogenéticos evidenciados não apresentaram correlações com idade, fumo, bebidas, equipamentos de proteção, medicamentos e doenças, confirmando a correlação dos danos citogenéticos evidenciados, com a exposição aos agrotóxicos (P<0,05).

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’- nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´- nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-16T13:12:14Z No. of bitstreams: 1 2013_LaisFlaviaNunesLemes_Parcial.pdf: 3812069 bytes, checksum: 9b30c03cd994332dd848dda905805156 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-24T13:53:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LaisFlaviaNunesLemes_Parcial.pdf: 3812069 bytes, checksum: 9b30c03cd994332dd848dda905805156 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-24T13:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LaisFlaviaNunesLemes_Parcial.pdf: 3812069 bytes, checksum: 9b30c03cd994332dd848dda905805156 (MD5) / No âmbito do programa de pesquisa que visa à utilização dos lipídeos fenólicos do líquido da castanha do caju como arcabouços moleculares no desenvolvimento de novos compostos candidatos a agentes terapêuticos, descrevemos neste trabalho a síntese e a avaliação farmacológicas de novos inibidores da enzima acetilcolinesterase, planejados a partir do cardanol por meio da estratégia de hibridação molecular de subunidades de reconhecimento molecular do homodímero Bis-7-tacrina e donepezil. Neste contexto, foram sintetizados 25 compostos por meio de metodologia convergente, fornecendo os derivados-alvo em rendimentos de bons a excelentes (55-97%). Os resultados farmacológicos referentes à inibição da AChE evidenciaram a capacidade desses ligantes atuarem sobre a enzima, onde os derivados benzilamínicos apresentaram melhor perfil inibitório com valores de IC50 entre 6,6-17,2 μM. Os derivados piperazínicos substituídos em N4, não apresentaram atividade inibitória significativa, assim como os bioisósteros, com exceção do LDT140 com IC50 26,4 μM. Os derivados piperidínicos carbamoilados e acetilados apresentaram bons resultados, especialmente os substituídos na posição 3 (LDT149, IC50 16,2 μM e LDT150, IC50 14,3 μM), sugerindo reconhecimento molecular acetilcolina-like, com distância entre a carbonila e o nitrogênio quartenário (4,90 Å) próxima ao substrato endógeno acetilcolina (4,92 Å). Estudos computacionais em modelagem molecular, resolução enantiomerica e a avaliação da atividade antiagregante A induzida pela AChE compreendem às perspectivas deste trabalho para validação do planejamento estrutural visando a obtenção de inibidores duais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the scope of a research program that aims the use of phenolic lipids of the cashew nutshell liquid as molecular scaffold in the development of new compounds candidates to therapeutic agents, we describe in this work the synthesis and pharmacological evaluation of novel inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) designed from cardanol by molecular hybridization strategy of the molecular recognition subunit of Bis-7-tacrine homodimer and donepezil. Thus, 25 compounds were synthesized by converged methodology providing the target compounds in good to excellent yields (55-97%). The pharmacological results related to the AChE inhibition demonstrated the ability of the ligands acting on the enzyme, where the benzylamine derivatives showed better inhibitory profile with IC50 values between 6.6 to 17.2 The piperazine derivatives substituted in N4 showed no significant inhibitory activity, as well as the bioisosters, except LDT140 with IC5 The carbamoyl and acetyl derivates of piperidine showed good results especially those substituted in position 3 (LDT149, IC50 16.2 μM and LDT150, IC5014.3 μM), suggesting an acetylcholine-like molecular recognition, with distance between the carbonyl and the quaternary nitrogen (4.90 Å) similar to the endogenous substrate acetylcholine (4.92 Å). Computational studies in molecular modeling, enantiomeric resolution, and the evaluation of inhibition of A agregation activity induced by AChE are the perspectives of this work to validate the structural design aimed to obtaining dual inhibitors.

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica, onde pode agir em receptores específicos localizados na membrana celular denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ecto-nucleotidases. Dentre este grupo de enzimas, destacam-se as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5’-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso, já foi descrito na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. A acetilcolina é um neurotransmissor secretado pelos nervos colinérgicos terminais, juntamente com o ATP. Após exercido seu sinal nos receptores nicotínicos e muscarínicos, a acetilcolina é inativada pela ação de uma enzima denominada acetilcolinesterase (AChE), que hidrolisa a acetilcolina até colina e acetato. O gene da AChE já foi clonado e seqüenciado e esta atividade enzimática foi detectada em cérebro de zebrafish. O metanol é um composto neurotóxico responsável por sérios danos ao SNC. Além de ser encontrado como um contaminante ambiental, este álcool é também empregado como componente de soluções crioprotetoras para embriões de zebrafish. Os efeitos do consumo agudo de etanol exercem uma variedade de modificações como coordenação motora, percepção sensorial e cognição. O etanol promove diversas alterações bioquímicas e fisiológicas em células do sistema nervoso central. Portanto, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo dos álcoois metanol e etanol sobre as ectonucleotidases e acetilcolinesterase em SNC de zebrafish. Após o tratamento agudo com metanol a 0,5 e 1,0% houve uma redução significativa na hidrólise de ATP e ADP. Entretanto, não foram verificadas alterações na atividade da ecto-5´-nucleotidase em cérebro de zebrafish. Uma inibição significativa na atividade da AChE foi observada na faixa de 0,25 a 1,0% de exposição ao metanol. Quatro seqüências de NTPDase foram identificadas através de uma análise filogenética, na qual uma é similar a NTPDase1 e as outras a NTPDase2. O metanol foi capaz de inibir os transcritos para a NTPDase1, duas isoformas da NTPDase2 e AChE. Metanol a 1,5 e 3,0% inibiu in vitro a hidrólise de ATP, e a hidrólise de ADP somente a 3,0%. No entanto, a hidrólise de AMP e a atividade da AChE não foram alteradas. A exposição ao etanol a 0,5 e 1,0% diminuiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto que a atividade da AChE apresentou um aumento significativo a 1,0%. Nenhuma alteração foi observada na atividade da ecto-5’- nucleotidase. Etanol in vitro a 0,5 e 1,0% não alterou a hidrólise de ATP, ADP e a atividade da AChE, mas a hidrólise de AMP foi inibida. Acetaldeído in vitro, na faixa de 0,5-1,0%, inibiu a hidrólise de ATP e ADP, mas a hidrólise de AMP e acetiltiocolina foi reduzida a 0,25, 0,5 e 1,0%. Acetato in vitro não alterou a atividade destas enzimas. O tratamento com etanol reduziu os níveis de mRNA para AChE, NTPDase1 as três isoformas de NTPDase2. Estes resultados demonstram que a intoxicação aguda por metanol e etanol pode influenciar as enzimas envolvidas na degradação dos neurotransmissores ATP e acetilcolina, sugerindo que os sistemas purinérgico e colinérgico podem ser alvos para os efeitos neurotóxicos destes álcoois. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. In the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors named purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5’-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDases and ecto-5’-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter secreted by the cholinergic nerve endings and ATP is co-released with ACh. After exerts its signaling on nicotinic e muscarinic receptors, ACh is inactivated through an enzyme named acetylcholinesterase (AChE), that can hydrolyze ACh into choline and acetate. The AChE gene is already cloned and sequenced and this enzyme activity was detected in zebrafish brain. Methanol is a neurotoxic compound responsible for serious damage on CNS. Besides it can be found as an environmental contaminant, this alcohol is also employed as a component of cryoprotector solutions for zebrafish embryos. The effects of acute ethanol consumption promote several changes related to motor coordination, sensory perception and cognition. Ethanol promotes many biochemical and physiological alterations on nervous cells. Therefore, we investigated the in vitro and in vivo effect of alcohols methanol and ethanol on ectonucleotidases and acetilcholinesterase in CNS of zebrafish. After acute treatment, there was a significant decrease of ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%. However, no significant alteration on ecto-5´-nucleotidase activity was verified in zebrafish brain. A significant inhibition on AChE activity was observed in the range of 0.25 to 1.0% methanol exposure. Four NTPDase sequences were identified from phylogenetic analyses, which one is similar to NTPDase1 and the others to NTPDase2. Methanol was able to inhibit NTPDase1, two isoforms of NTPDase2 and AChE transcripts. Methanol inhibited in vitro ATP hydrolysis at 1.5 and 3.0% and ADP hydrolysis only at 3.0%. Nevertheless, AMP hydrolysis and AChE activity were not changed. Ethanol exposure decreased ATP and ADP hydrolysis at 0.5 and 1.0%, while the AChE activity presented a significant increased at 1.0%. No changes on ecto-5’-nucleotidase activity were observed in zebrafish brain membranes. Ethanol in vitro did not alter ATP, ADP hydrolysis and AChE activity, but AMP hydrolysis was inhibited at 0.5 and 1.0%. Acetaldehyde in vitro, in the range 0.5-1.0%, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but AMP and acetylthiocholine hydrolysis were reduced at 0.25, 0.5 and 1.0%. Acetate in vitro did not alter these enzyme activities. Semi-quantitative expression analysis of NTPDase and ecto-5´- nucleotidase was performed. Ethanol treatment reduced AChE, NTPDase1 and three isoforms of NTPDase2 mRNA levels. These results demonstrate that acute methanol and ethanol intoxication may influence the enzymes involved in the degradation of neurotransmitters ATP and ACh, suggesting that the purinergic and colinergic system can be a target to the neurotoxic effects of these alcohols.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-14T22:20:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Paula Rayane de Souza.pdf: 1282150 bytes, checksum: 8f89b2ccd184812b4c0dd7f80e5658c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-16T18:38:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Paula Rayane de Souza.pdf: 1282150 bytes, checksum: 8f89b2ccd184812b4c0dd7f80e5658c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:38:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Paula Rayane de Souza.pdf: 1282150 bytes, checksum: 8f89b2ccd184812b4c0dd7f80e5658c4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / A ostra nativa é um fruto do mar bastante consumido e por ser um bivalve de hábito filtrador é considerado um excelente bioindicador ambiental. Assim, o presente trabalho tem o objetivo de caracterizar parcialmente parâmetros cinéticos e físico-químicos da acetilcolinesterase de brânquias e vísceras de Crassostrea rhizophorae do Canal de Santa Cruz, localizado em Itamaracá e investigar o efeito in vitro de pesticidas e íons metálicos sobre sua atividade a fim de investigar seu potencial como biomarcador dessas substâncias. Acetilcolinesterase é uma enzima do grupo das serino-esterases que atua na hidrólise do neurotransmissor acetilcolina garantindo a intermitência dos impulsos nervosos responsáveis pela comunicação neuronal. A inibição deste mecanismo ocorre devido aos efeitos da exposição a pesticidas organofosforados e carbamatos, bem como a íons metálicos e resulta em acúmulo de acetilcolina na fenda sináptica gerando uma hiper-estimulação colinérgica. Desta forma, ostras foram coletadas, brânquias e vísceras retiradas separadamente e feito os homogenatos em Tris-HCl 0,1M, pH 8,0. A partir destes homogenatos foram realizadas a determinação da atividade enzimática, temperatura ótima, estabilidade térmica, avaliação do efeito de inibidores específicos, pesticidas e o efeito de íons metálicos. Os resultados demonstraram que o pH ótimo foi de 8,0 e 8,5 para a enzima de brânquias e vísceras, respectivamente. Temperatura ótima de 70°C para AChE branquial e 75°C para AChE visceral. A enzima apresentou estabilidade térmica até 100°C em ambos tecidos. Os parâmetros cinéticos de Vmₐₓ em brânquias e vísceras foram de 18.169 ± 0.52 mU/mg e 12.139 ± 0.31 mU/mg, respectivamente. O valor de Km 0.502 ± 0.05 mM para as brânquias e 0.255 ± 0.04 mM para vísceras. Todos os pesticidas utilizados apresentaram efeito inibitório na atividade da AChE apresentando decréscimo significativo. Os íons Zn²⁺; Cu²⁺+; Hg²⁺; Mn²⁺ ; Ba²⁺ e Al²⁺ em 0,1 mM inibiram a atividade nos dois tecidos de estudo, brânquias em 79%, 88%, 73%, 100%, 77% e 100% . E para vísceras uma inibição de 85%, 100%, 41%, 65%, 100% e 59% respectivamente. A AChE isolada nas brânquias de C. rhizophorae mostrou potencial biomarcador para o carbamato carbaril, e o íon Cu²⁺. Esta enzima pode ser considerada uma ferramenta útil no monitoramento de toxicidade ambiental. / The native oyster is a sea fruit widely consumed and for being a strainer habit of bivalve is considered an excellent environmental bioindicator. Therefore, the aim for this study was partially characterize the kinetic parameters and physico-chemical of acetylcholinesterase gills and viscera of Crassostrea rhizophorae from the Canal Santa Cruz, Itamaracá and investigate the in vitro effect of pesticides and metallic ions on activity for investigate its potential as a biomarker of these substances. Acetylcholinesterase is an enzyme from the group of serine esterase which acts on the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine ensuring the burst of nerve impulses responsible for neuronal communication. This inhibition mechanism is due to the effects of exposure to organophosphorus and carbamate pesticides, as well as metal ions and results in the accumulation of acetylcholine in the synaptic cleft generating a cholinergic overstimulation. Oysters were collected, gills and viscera removed separately and made homogenates with 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0. Homogenates were centrifuged and subsequently to carry out the enzymatic activities, experiments the optimum temperature, thermal stability, trials with specific inibidors, pesticides and the effect of metal ions. The results showed that the optimum pH was 8.0 and 8.5 for the enzyme gills and viscera, respectively. Optimum temperature of 70 ° C gill AChE and 75 ° C visceral AChE. The enzyme showed to be stable up to 100 ° C in both tissues. The kinetic parameters, Vmₐₓ gills and viscera was 18.169 ± 0.52 mU/mg e 12.139 ± 0.31 mU/mg respectively. The value of Km 0.502 ± 0.05 to the gills and 0.255 ± 0.04 mM for viscera. All pesticides used showed inhibitory effect on AChE activity presenting significant decrease. The ions íons Zn²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Mn²⁺ Ba²⁺ and Al²⁺ 0.1 mM inhibited the activity in both tissue study, gills 79%, 88%, 73%, 100%, 77% and 100%. Viscera 85%, 100%, 41%, 65%, 100% and 59% respectively. The AChE gills of C. rhizophorae showed potential biomarker for carbaryl carbamate, and copper ion Cu²⁺, enzyme considered a useful tool in monitoring environmental toxicity.