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Identifier des gènes nucléaires liés au maintien de l’ADN mitochondrial chez le champignon filamenteux Podospora anserina / Identify nuclear genes related to mitochondrial DNA maintenance in the filamentous fungus Podospora anserinaNguyen, Tan-Trung 27 January 2014 (has links)
Les mitochondries jouent un rôle majeur dans le métabolisme de l'ATP des cellules eucaryotes. Le maintien de l'ADN mitochondrial (ADNmt) est fondamental pour la production d'énergie chez les organismes aérobie stricte. De grandes délétions de ADNmt sont à l'origine d'anomalies mitochondriales entrainant des maladies chez l'homme. Plusieurs gènes nucléaires impliqués dans le métabolisme de l’ADNmt ont été identifiés et caractérisés chez l'homme. Cependant, l’ensemble des facteurs et leurs activités requis pour le maintien de l'ADNmt reste largement inconnu. L'identification de ces facteurs et la détermination de leurs activités dans des systèmes modèles simples peuvent contribuer à l’étude du maintien de l'ADNmt et à la compréhension des mécanismes induisant des délétions de l’ADNmt chez l'homme. Le champignon filamenteux Podospora anserina est un modèle d'étude du maintien de l’ADNmt. Chez P. anserina, l’accumulation de délétions région-spécifiques de l’ADNmt (Δmt) est corrélée à la présence de la mutation AS1-4 dans le gène nucléaire codant la protéine cytosolique ribosomale S15. L'altération de la protéine S15 pourrait modifier la traduction de transcrits codant des protéines impliquées dans le maintien de l'ADNmt et indirectement causer l'accumulation des Δmt. Par une approche globale (translatome), nous avons analysé l’ensemble des transcrits associés aux ribosomes AS1-4 en cours de traduction. A partir des données obtenues, deux gènes candidats, PaIML2 et PaYHM2 potentiellement impliqués dans le maintien de l'ADNmt, ont été identifiés et étudiés. L'analyse fonctionnelle a été principalement développée pour PaYHM2. La protéine PaYHM2 partage 68% d’identité avec la protéine mitochondriale bi-fonctionnelle Yhm2 de levure, impliquée dans le transport de métabolites dans la mitochondrie et possèdant un domaine de liaison à l'ADN. J'ai démontré que le gène PaYHM2 est essentiel pour P. anserina, un organisme aérobie stricte et que la protéine PaYHM2 est mitochondriale. Par mutagénèse, j'ai montré que c'est la fonction de transport qui est essentielle à la survie du champignon et non pas la putative capacité à se lier à l'ADN. Les résultats obtenus suggèrent également que PaYHM2 participe au métabolisme de l'acétyl-CoA chez P. anserina. / Mitochondria play main role as adenosine triphosphate (ATP)-energy factories of the eukaryotic cells. To ensure energy production, mitochondrial DNA (mtDNA) maintenance is essential for all obligate-aerobe eukaryotic organisms. Large-scale mtDNA deletions are major causes of mitochondrial dysfunction in human diseases. Several nuclear genes implicated in mtDNA metabolism were identified and characterized in human. Nuclear-encoded factors and their activities required for mtDNA maintenance are, however largely unknown. Identification of these factors and discovery of their activities in simple model systems can contribute to the comprehension of mtDNA maintenance and of the mechanisms leading to mtDNA deletions in human. The filamentous fungus Podospora anserina is a useful model system for studying mtDNA maintenance. An S15 cytosolic ribosomal protein mutant in P. anserina, named AS1-4 mutant, shows a positive correlation with the accumulation of specific large mtDNA deletion (Δmt) at the time of death. Alteration of S15 protein might modify translation of transcripts encoding proteins related to mtDNA maintenance and indirectly cause Δmt accumulation. Polysome profiling (called translatome), a global approach giving genome-wide informations about modified transcripts on translation, was performed on AS1-4 mutant. From the data of this translatome, two candidate genes potentially related to mitochondrial DNA maintenance, the PaIML2 gene and PaYHM2 gene has been identified and functionally analyzed. The function of the PaYHM2 gene has been especially characterized in this project. This gene encodes a protein sharing 68% of identity with yeast Yhm2, a bi-functional protein as a mitochondrial carrier and as a protein with DNA-binding activity. I demonstrated that the PaYHM2 gene is essential for P. anserina, an obligate-aerobe organism and that the PaYHM2 protein localizes to mitochondria. Through mutagenesis approach, I showed that the transport function decides the essentiality of mitochondrial carrier PaYHM2 while the putative DNA binding activity of PaYHM2 protein is important for P. anserina. Furthermore, I found that the function of PaYHM2 probably participates in the cytosolic acetyl-CoA metabolism.
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Métabolisme de l'acétyl-CoA : modulation pharmacologique, approches thérapeutiques et nouvelles maladies / Acetyl-coA metabolism : pharmacological treatment, therapeutic approaches and new diseasesHabarou, Florence 24 November 2016 (has links)
L’acétyl-coA occupe une place centrale dans le métabolisme intermédiaire. Il constitue le point de jonction de plusieurs voies métaboliques telles que la .-oxydation, la glycolyse, le catabolisme de certains acides aminés, la cétolyse, la cétogenèse et la synthèse d’acides gras. Il est également impliqué dans d’autres processus tels que l’acétylation des protéines. Au cours de mon travail de thèse, je me suis attachée à étudier différents aspects du métabolisme de l’acétyl-coA. La première partie de mon travail a porté sur la modulation pharmacologique de la .- oxydation dans le but de corriger des déficits de cette voie métabolique. L’intérêt de traitements par 400µM de bézafibrate ou 75µM de resvératrol dans les formes modérées de déficit en VLCAD et en CPT2 avait été montré précédemment. Par des méthodes de référence et grâce à la mise au point de nouvelles techniques, j’ai pu montrer sur des fibroblastes de patients déficitaires en LCHAD que des traitements par une combinaison de 35µM de bézafibrate et 30µM de resvératrol permettent d’augmenter les capacités d’oxydation du palmitate en stimulant la synthèse protéique. L’effet de cette combinaison était comparable à celui d’un traitement par 400µM de bézafibrate. Dans un second temps, je me suis intéressée à deux cofacteurs impliqués dans le métabolisme de l’acétyl-coA : l’acide lipoïque, cofacteur de quatre .-cétoacides déshydrogénases (PDHc, BCKDHc, .- KGDHc et GCS) et la riboflavine, cofacteur d’acyl-coA déshydrogénases de la .-oxydation et de déshydrogénases impliquées dans le catabolisme des acides aminés ramifiés. Ainsi, j’ai participé à la description d’anomalies du métabolisme de l’acide lipoïque, un nouveau groupe de maladies héréditaires du métabolisme caractérisé par un déficit combiné en .-cétoacides déshydrogénases. Par ailleurs, j’ai pu montrer qu’une hyperprolinémie constitue un biomarqueur intéressant pour le diagnostic d’acidurie glutarique de type II primaire ou secondaire, ces dernières pouvant se rencontrer en cas d’anomalie du métabolisme de la riboflavine. J’ai également évalué l’utilisation d’un mélange racémique de L,D-3-hydroxybutyrate afin de corriger les déficits énergétiques induits par un déficit en PDHc ou GLUT1. Via la cétolyse, le L,D-3- hydroxybutyrate génère de l’acétyl-coA. De façon surprenante, l’administration de ce composé s’est traduite par une amélioration de l’état clinique des patients atteints de déficits en PDHc, alors qu’une dégradation a été observée chez les patients atteints de déficits en GLUT1. Cette évolution différente pourrait souligner l’importance de l’anaplérose chez les patients déficitaires en GLUT1. Enfin, la dernière partie de mon travail de thèse porte sur la description d’un patient atteint d’une forme modérée de déficit en pyruvate carboxylase, cette enzyme étant régulée par l’acétyl-coA. Les difficultés diagnostiques rencontrées devant ces formes modérées sont rapportées, ainsi que des essais de traitement par des composés anaplérotiques et par le bézafibrate, malheureusement sans bénéfice net que ce soit in vitro ou in vivo. En conclusion, le métabolisme de l’acétyl-coA est altéré dans de nombreuses maladies héréditaires du métabolisme, dont certaines sont de description récente. Il peut être modulé par différentes approches pharmacologiques. Le développement de nouvelles techniques et notamment les analyses de flux métaboliques fournissent des outils utiles à son exploration et à l’étude de nouveaux traitements. / Acetyl-CoA is crucial for intermediary metabolism. It is at the crossroad of several metabolic pathways such as beta-oxidation, glycolysis, aminoacid catabolism, ketolysis, and fatty acid synthesis. It is also involved in other processes such as protein acetylation. In this document I studied different aspects of acetyl-CoA metabolism. First, I tried to correct fatty acid oxidation defects through pharmacological approach. Thanks to well- known methods and new ones, I showed that a combination of 30µM resveratrol and 35µM bezafibrate increased fatty acid oxidation capacities by increasing protein synthesis, as well as 400µM bezafibrate. Acetyl-CoA metabolism is also altered due to cofactors defects such as lipoic acid or riboflavine deficiency. I was involved in new diseases description and research for new biomarkers in this context. PDHc and GLUT1 deficiency are two different diseases with the same consequence : a defect in acetyl- CoA production from glucose. In order to improve patients’ quality of life, I evaluated the substitution of ketogenic diet with a racemic mix of L,D-3-hydroxybutyrate in PDHc and GLUT1 deficiency. The clinical evolution of patients was strikingly different, with an improvement in PDHc patients, whereas a degradation was noticed in GLUT1 patients. This difference might underline the role of anaplerosis in GLUT1 deficiency. Finally, I evaluated anaplerotic treatment and bezafibrate treatment in pyruvate carboxylase deficiency, an enzyme allosterically regulated by acetyl-CoA. To conclude, acetyl-CoA metabolism is altered in numerous inherited errors of metabolism, some of them being recently described. It can be modulated by pharmacological approaches. The development of new techniques such as metabolic flux analysis are useful for its study and for new treatments evaluation.
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