L’acide phosphatidique (PA) est un lipide simple qui peut exister sous différentes formes. A partir des sondes que j’ai préparé en se basant sur des domaines de liaison au PA : PDE4A1, Spo20p, et OpiQ2, j’ai pu étudier la localisation subcellulaire du PA dans les cellules PC12 et les macrophages RAW264.7. Ces sondes lient différents formes de PA dans les membranes de différents compartiments subcellulaires. De plus, j’ai pu montrer qu’il y a une néosynthèse de PA et de certaines espèces de PA mono- ou bi-insaturé à la membrane plasmique lors de la stimulation de l’exocytose. Nous avons ainsi observé que la PLD1 semble être la source principale de PA dans les glandes surrénales. D’autre part, mes travaux indiquent une augmentation du niveau global de PA à la membrane plasmique et une diminution importante du PA au niveau du RE dans les macrophages après stimulation de la phagocytose frustrée. Ce qui pourrait ainsi valider le concept d’une fusion d’une partie de la membrane du RE avec la membrane plasmique lors de la phagocytose. / The phosphatidic acid (PA) is a simple lipid which may exist in various forms. I have generated probes based on PA binding domains: PDE4A1, Spo20p and OpiQ2 to study the subcellular localization of PA in PC12 cells and RAW264.7 macrophages. These probes bind different form of PA in different subcellular compartments. In addition, I show that PA and certain species mono- or bi-unsaturated of PA are synthesized at the plasma membrane upon stimulation of exocytosis. We observed that the PLD1 seems to be the main source of PA in the adrenal glands. On the other hand, my research indicates an increase in the level of PA at the plasma membrane and a significant decrease in the ER in macrophages after stimulation of phagocytosis frustrated. Thus these results could validate the concept of a fusion of a portion of the ER membrane with the plasma membrane during phagocytosis.

La croissance neuritique est un mécanisme complexe qui fait toujours l'objet d'intenses investigations. Les donnés actuelles ont permis de mettre en évidence l'implication de trois mécanismes principaux dans la croissance neuritique : i) la dynamique du cytosquelette, ii) le trafic intracellulaire et l'apport membranaire au niveau du cône de croissance et iii) la signalisation cellulaire, principalement via la voie MAPK-ERK1/2, qui abouti à la régulation de la transcription.La PLD1 et son produit l'acide phosphatidique semblent être au centre de voies majeures impliquées dans le développement neuronal. Mes travaux ont permis d'approfondir nos connaissances sur le rôle cellulaire de la PLD1 au cours de la croissance neuritique. J'ai montré que la PLD1 en collaboration avec la kinase RSK2 régule la fusion des vésicules positives pour Ti-VAMP/VAMP7 au cours de la croissance neuritique. D'autre part, j'ai établi que la PLD1 joue un rôle important dans le maintien de la signalisation endosomale de la voie MAPK-ERK1/2-RSK2-CREB induite par les neurotrophines. J'ai également montré que la PLD1 régule l'activation de mTOR/p70S6K en réponse au BDNF. La dérégulation des voies MAPK-ERK1/2 et mTOR/p70-S6K pourraient être à la base de la réduction de l'arborisation dendritique et de la maturation des épines dendritique observée dans les neurones corticaux Pld1-/- en culture. En plus de l'implication de RSK2 dans la régulation de la PLD1, j'ai également montré que la PLD1 régule l'activation de RSK2 en réponse aux neurotrophines, probablement via une boucle de rétrocontrôle. Ainsi les donnés obtenus suggèrent un lien fort entre les deux protéines au cours du développement neuronal. A la lumière de ces donnés, un dysfonctionnement de ce mécanisme pourrait expliquer le retard mental observé chez les patients atteints du syndrome de Coffin-Lowry causé par la perte de l'activité kinase de RSK2. D'autre part, les résultats obtenus suggerent un rôle de la PLD1 dans l'exocytose des vésicules.

Le léiomyome utérin est la pathologie utérine la plus fréquente chez les femmes en âges de procréer. Des résultats précédent obtenus avec les cellules ELT3, une lignée de cellules de léiomyomes de rat, ont montré que l'acide lysophosphatidique (LPA) activait les MAP kinases ERK1/2 via le récepteur LPA1 couplé à la protéine Gi et l'activation de Raf, Ras et de MEK. Durant ce travail, nous avons caractérisé l'activité phosphatase responsable de la dégradation du LPA dans cette lignée de cellules ELT3. Nous avons montré que le LPA était dégradé exclusivement par la lipide-phosphate phosphatase 1 (LPP1), seule isoforme exprimé dans les cellules ELT3. Dans un deuxième temps nous nous somme intéressés aux effets du diacylglycerol pyrophosphate (DGPP). Le DGPP est un médiateur lipidique qui, sous sa forme dioctanoyl (DGPP8:0), est décrit comme un antagoniste des récepteurs LPA1 et LPA3 chez les mammifères. Dans cette étude, nous montrons que le DGPP8:0 n'a pas d'effet antagoniste sur l'activation du module MAP kinase ERK1/2 par le LPA mais qu'il induit une activation de ERK1/2 dans plusieurs lignées de cellules de mammifères. En effet le DGPP active ERK1/2 à travers l'activation des PKC, Raf et MEK. De plus, nous montrons que l'activation induite par le DGPP repose sur sa déphosphorylation catalysée par une LPP. Nous montrons également que l'inhibition de LPP1 par le VPC32183 ou l'utilisation de siRNA dirigé contre la lipide phosphate-phosphatase 1 (LPP1) réduit l'activation ERK1/2 induite par le DGPP. Ceci montre que le DGPP active ERK1/2 via sa déphosphorylation en acide phosphatidique (PA8:0), catalysée par la LPP1. Enfin dans une dernière partie nous montrons que le myomètre sain, contrairement aux cellules ELT3, exprime à la fois la LPP1 et la LPP3. En étudiant l'effet de la surexpression de la LPP3 dans les cellules ELT3, nous avons observé que la LPP3 interagissait avec la LPP1 et qu'elle pourrait la séquestrer dans des compartiments membranaires internes. Cette séquestration entraine une diminution de l'actvité ecto-LPP au profit de l'activité intracellulaire qui pourrait réguler négativement la production de seconds messagers phospholipidiques. Ces résultats montrent l'importance des LPP dans la régulation des effets des phospholipides bioactifs et suggère un lien entre le caractère tumorale des cellules de léiomyomes et l'absence de la LPP3.

La croissance neuritique est un mécanisme complexe qui fait toujours l’objet d’intenses investigations. Les donnés actuelles ont permis de mettre en évidence l’implication de trois mécanismes principaux dans la croissance neuritique : i) la dynamique du cytosquelette, ii) le trafic intracellulaire et l’apport membranaire au niveau du cône de croissance et iii) la signalisation cellulaire, principalement via la voie MAPK-ERK1/2, qui abouti à la régulation de la transcription.La PLD1 et son produit l’acide phosphatidique semblent être au centre de voies majeures impliquées dans le développement neuronal. Mes travaux ont permis d’approfondir nos connaissances sur le rôle cellulaire de la PLD1 au cours de la croissance neuritique. J’ai montré que la PLD1 en collaboration avec la kinase RSK2 régule la fusion des vésicules positives pour Ti-VAMP/VAMP7 au cours de la croissance neuritique. D’autre part, j’ai établi que la PLD1 joue un rôle important dans le maintien de la signalisation endosomale de la voie MAPK-ERK1/2-RSK2-CREB induite par les neurotrophines. J’ai également montré que la PLD1 régule l’activation de mTOR/p70S6K en réponse au BDNF. La dérégulation des voies MAPK-ERK1/2 et mTOR/p70-S6K pourraient être à la base de la réduction de l’arborisation dendritique et de la maturation des épines dendritique observée dans les neurones corticaux Pld1-/- en culture. En plus de l’implication de RSK2 dans la régulation de la PLD1, j’ai également montré que la PLD1 régule l’activation de RSK2 en réponse aux neurotrophines, probablement via une boucle de rétrocontrôle. Ainsi les donnés obtenus suggèrent un lien fort entre les deux protéines au cours du développement neuronal. A la lumière de ces donnés, un dysfonctionnement de ce mécanisme pourrait expliquer le retard mental observé chez les patients atteints du syndrome de Coffin-Lowry causé par la perte de l’activité kinase de RSK2. D’autre part, les résultats obtenus suggerent un rôle de la PLD1 dans l’exocytose des vésicules. / Neurite outgrowth is a complex mechanism that is still the subject of intense investigation. Current given helped to highlight the involvement of three main mechanisms in neurite growth : i) the dynamics of the cytoskeleton, ii) the intracellular membrane trafficking and membrane supply at the growth cone and iii) cell signaling , mainly via the MAPK-ERK1 / 2, which resulted in the regulation of transcription. The PLD1 and its product the phosphatidic acid (PA) appear to be at the center of the major pathways involved in neuronal development. My work has deepened our understanding of the cellular role of PLD1 during neurite outgrowth. I showed that PLD1 together with the protein kinase RSK2 regulates the fusion of vesicles positive for Ti-VAMP/VAMP7 during neurite outgrowth. On the other hand, I have determined that PLD1 plays an important role in maintaining the endosomal signaling pathwayMAPK-ERK1/2-RSK2-CREB induced by neurotrophin. I also showed that PLD1 regulates the activation of mTOR/p70S6K in response to BDNF. Deregulation of MAP -ERK1 / 2 and mTOR/p70-S6K pathways could be the basis for the reduction of dendritic arborization and maturation of dendritic spines observed in cortical neurons Pld1-/- culture. In addition to the involvement of RSK2 in the regulation of PLD1, I also showed that PLD1 regulates RSK2 activation in response to neurotrophin, possibly via a feedback loop. Thus given obtained suggest a strong link between the two proteins during neuronal development. In the light of these data, alteration of this mechanism could explain the mental retardation observed in patients with Coffin -Lowry syndrome caused by loss of the kinase activity of RSK2. On the other hand, our results suggest a role for PLD1 in exocytosis of vesicles.

Les cellules eucaryotes possèdent un territoire membranaire dit « électrostatique » qui est définit par la présence de phospholipides négativement chargés sur la face cytosolique des membranes. Cette propriété permet le recrutement de protéine cytosolique contenant des motifs/domaines positivement chargés au niveau des membranes via des interactions électrostatiques. Nous nous sommes demandés si le territoire électrostatique est présent chez les cellules végétales et quel est son organisation ? Quels sont le(s) lipide(s) anionique(s) impliqués dans son maintien ? Et quel est son (ces) rôle(s) dans la signalisation et le développement des plantes ? Premièrement, nous avons mis en avant que la membrane plasmique est le compartiment intracellulaire le plus électronégativement chargé (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). Ce champ électrostatique est gouverné par trois lipides anioniques différents, l’acide phosphatidique, la phosphatidylserine et le phosphatidylinositol-4-phosphate. Nous avons montré que cette propriété unique de la membrane plasmique permet de réguler des voies de signalisation hormonale, tel que celle de l’auxine et des brassinostéroïdes. Notamment, la phosphatidylserine régule la dynamique spatiotemporelle des petites GTPases de la famille Rho. En réponse à l’auxine, ce lipide permet de regrouper les protéines Rho dans des domaines membranaires. La formation de ces domaines est requise pour l’activité de ces protéines permettant de contrôler l’endocytose, la dynamique du cytosquelette mais également régule la morphogenèse cellulaire ainsi que la réponse gravitropique de la racine. / The « electrostatic territory» is part of the eukaryotic membrane organization and is defined by the enrichment of negatively charged phospholipids at the membrane cytosolic face. This feature is involved in the membrane recruitment of cytosolic proteins, which contain positively charged motifs and/or domains. In this work, we used Arabidopsis thaliana as a model and explored the existence of an electrostatic territory in plant cells. We found that the plasma membrane is the most anionic intracellular membrane (Simon, Platre et al., 2016 Nature Plants). This electrostatic field is maintained by lipid cooperation between, phosphatidic acid, phosphatidylserine and phosphatidylinositol-4-phosphate. The cell surface unique feature is involved in the regulation of hormonal signalling such as auxin and brassinosteroids pathways. We found that phosphatidylserine tunes the spatiotemporal dynamics of small GTPases from the Rho family. During auxin response, PS is required to cluster Rho into specialized membrane domains. We show that nanocluster formation is required for Rho-mediated auxin signaling including the regulation of endocytosis, cytoskeleton organization, morphogenesis and the root gravitropic response.

Le léiomyome utérin est la pathologie utérine la plus fréquente chez les femmes en âges de procréer. Des résultats précédent obtenus avec les cellules ELT3, une lignée de cellules de léiomyomes de rat, ont montré que l’acide lysophosphatidique (LPA) activait les MAP kinases ERK1/2 via le récepteur LPA1 couplé à la protéine Gi et l’activation de Raf, Ras et de MEK. Durant ce travail, nous avons caractérisé l’activité phosphatase responsable de la dégradation du LPA dans cette lignée de cellules ELT3. Nous avons montré que le LPA était dégradé exclusivement par la lipide-phosphate phosphatase 1 (LPP1), seule isoforme exprimé dans les cellules ELT3. Dans un deuxième temps nous nous somme intéressés aux effets du diacylglycerol pyrophosphate (DGPP). Le DGPP est un médiateur lipidique qui, sous sa forme dioctanoyl (DGPP8:0), est décrit comme un antagoniste des récepteurs LPA1 et LPA3 chez les mammifères. Dans cette étude, nous montrons que le DGPP8:0 n’a pas d’effet antagoniste sur l’activation du module MAP kinase ERK1/2 par le LPA mais qu’il induit une activation de ERK1/2 dans plusieurs lignées de cellules de mammifères. En effet le DGPP active ERK1/2 à travers l’activation des PKC, Raf et MEK. De plus, nous montrons que l’activation induite par le DGPP repose sur sa déphosphorylation catalysée par une LPP. Nous montrons également que l’inhibition de LPP1 par le VPC32183 ou l’utilisation de siRNA dirigé contre la lipide phosphate-phosphatase 1 (LPP1) réduit l’activation ERK1/2 induite par le DGPP. Ceci montre que le DGPP active ERK1/2 via sa déphosphorylation en acide phosphatidique (PA8:0), catalysée par la LPP1. Enfin dans une dernière partie nous montrons que le myomètre sain, contrairement aux cellules ELT3, exprime à la fois la LPP1 et la LPP3. En étudiant l’effet de la surexpression de la LPP3 dans les cellules ELT3, nous avons observé que la LPP3 interagissait avec la LPP1 et qu’elle pourrait la séquestrer dans des compartiments membranaires internes. Cette séquestration entraine une diminution de l’actvité ecto-LPP au profit de l’activité intracellulaire qui pourrait réguler négativement la production de seconds messagers phospholipidiques. Ces résultats montrent l’importance des LPP dans la régulation des effets des phospholipides bioactifs et suggère un lien entre le caractère tumorale des cellules de léiomyomes et l’absence de la LPP3. / Leiomyoma is the most common uterine disease in women in age of procreation. Previous result have shown that in ELT3 cells, which is a rat leiomyoma-derived cell line, lysophosphatidic acid (LPA) was able to activate ERK1/2 MAP kinases through the activation of the LPA1 receptor via the classical MAP kinase pathway involving Raf, Ras and MEK. We have observed that LPA was dephosphorylated in ELT3 cells by Lipid-phosphate phosphatase 1 (LPP1) which is the only LPP isoform expressed in these cells. In a second part, we investigated the effect of diacylglycerol pyrophosphate (DGPP). DGPP, in its octanoyl form (DGPP8:0), is described as an LPA1, 3-antognist. Here, we show that DGPP had no antagonistic effect on LPA-ERK activation, but was able to induce ERK activation by itself. This activation occurred through the activation of PKC, Raf and MEK. On the other hand, we show that DGPP-ERK activation required its dephosphorylation by LPP. Next we observed that the DGPP-ERK activation was inhibited by VPC32183, which we showed to inhibit LPP activity, and by siRNA treatment targeting LPP1. This results show that DGPP needs to be dephosphorylated into PA to induce ERK phosphorylation, and this dephosphorylation is catalyzed by LPP1. Finally, in the third part of this study, we were interested in the differential LPP expression between ELT3 cells and myometrium cells. Indeed, we have previously observed that ELT3 cell express only LPP1 while myometrial cells express LPP1 and LPP3. We observed that when LPP3 is expressed in ELT3 cells, it can interact with LPP1 and may restrain its plasma membrane localization reducing ectoLPP activity in favor of intracellular LPP activity. This may result in a negative regulation of intracellular phospholipidic second messengers. All these results show the significance of LPP in the regulation of bioactive phospholipid effects and suggest a relationship between the tumoral phenotype of leiomyoma cells and the absence of LPP3.