University, Diss., 2000--München.

Die Anpassung des Aktinzytoskeletts an extrazelluläre Gewebsstrukturen ist Voraussetzung für die Interaktion mit der extrazellulären Matrix und für die Zellbewegung, einschließlich der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen. Wir untersuchten bei invasiven B16/F1 GFP-Aktin Mausmelanomzellen, ob und wie sich Zellform, Art und Effizienz der Bewegung an physikalisch unterschiedlich beschaffene kollagenöse Umgebungen anpassen: 1) mit Kollagen-Monomeren beschichtete 2D Objektträger, 2) 2D Oberfläche einer fibrillären Kollagenmatrix und 3) Zellen, die in einer 3D Kollagenmatrix eingebettet waren. Zur Darstellung des Aktinzytoskeletts wurden Zellen eingesetzt, die GFP-Aktin Fusionsprotein exprimierten, und mittels Zeitraffer-Videomikroskopie und Konfokalmikroskopie untersucht. Im direkten Vergleich waren Struktur und Dynamik des Aktinzytoskelett wie auch Zellform und Art der Migration unterschiedlich in den verschiedenen Umgebungen. Auf 2D planer Oberfläche erfolgte eine rasche Adhäsion und Abflachung der Zellen (Spreading) mit nachfolgender Migration mit Bildung fokaler Adhäsionszonen, in die kabelartige Aktinstrukturen (Stress fibers) einstrahlten. Dagegen entwickelte sich in 3D Kollagenmatrices eine spindelförmige, fibroblastenähnliche Zellform (mesenchymal) mit zylindrischen fingerförmigen vorderen Pseudopodien, die Zug der Zelle nach vorne bewirken und hochdynamisches polymeres Aktin, nicht jedoch Stress Fibers enthielten. Eine ähnliche Zellform und Struktur des Zytoskeletts entwickelte sich in Zellen auf 2D fibrillärem Kollagen. Die Kontaktfindung und Migrationseffizienz auf oder in fibrillären Matrices war im Vergleich zu 2D kollagenbeschichteter Oberfläche erschwert, die Migrationseffizienz verringert. In Kontrollversuchen wurden Migration und polarisierte Bildung von Aktindynamik durch Inhibitoren des Aktinzytoskeletts (Cytochalasin D, Latrunculin B, Jasplakinolide) stark gehemmt. Diese Befunde zeigen , dass die Struktur und Dynamik des Aktinzytoskeletts sowie die Art der Migration in Tumorzellen stärker als bisher angenommen durch die umgebende Kollagenstruktur bestimmt wird. Während 3D Kollagenmatrices in vivo ähnliche bipolare Zytoskelettstruktur fördern, müssen Abflachung der Zellen mit Bildung von Stress Fibers als spezifische Charakteristika von 2D Modellen angesehen werden. / The dynamics and the adaptation of the actin cytoskeleton in response to extracellular matrix structures is the prerequisite for cell polarisation, shape change, and migration, including the invasion and metastasis of tumor cells. In invasive B16-mouse melanoma cells expressing GFP-actin fusion protein we directly imaged cytoskeletal dynamics, adaptation and movement in response to physically different collagen substrata using time-lapse videomicroscopy and confocal microscopy: 1) cells on 2D surfaces coated with monomeric collagen, 2) 2D surfaces composed of fibrilliar collagen, and 3) cells which were embedded in 3D collagen matrices. In directly comparision the structure and dynamic of the actin cytoskeleton, cell shape and migration efficiency were different between the different collagen substrata. On 2D monomeric collagen quick cell adhesion, spreading, and cell flattening were followed by migration driven by focal contacts in which cable like actin structures (stress fibres) inserted. In 3D collagen matrices however, cells developed a spindle like (mesenchymal) shape with cylindrical finger-like pseudopods which generated the forward-driving force towards collagen fibres. These pseudopods contained dynamic polymerized actin yet lacked stress fibres. A similar mesenchymal cell shape and structure of the actin cytosceleton that lacked stringent focal contacts and stress fibres developed on 2D fibrilliar collagen matrices. The migration efficiency in 3D collagen was significantly lower, compared to 2D substrata, suggesting an impact of matrix barriers on the migration velocity. Both, actin polymerization and migration were severely impaired by inhibitors of the actin cytoskeleton (Cytochalasin D, Latrunculin B, Jasplakinolide), causing cell rounding and oscillatory “running on the spot”. These findings show the dynamics of the actin cytoskeleton in living melanoma cells critically dependent on and respond to the physical structure of the ECM. 3D collagen matrices hence favour in vivo-like cell shape and cytoskeletal organization while flat cell spreading and formation of stress fibres are specific cell characteristics of cells on 2D.

Schaut man durch ein Mikroskop auf eine biologische Zelle mit angefärbten Zytoskelett, so erblickt man lange, mehr oder minder gerade Objekte. Mit ziemlicher Sicherheit gehören diese zu einer von drei Arten von Zytoskelettfilamenten -- Aktin- oder Mikrofilamente, Intermediärfilamente und Mikrotubuli. Schon seit mehreren Jahrzehnten versucht man die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen nicht nur zu beschreiben, sondern ihr Verhalten von zwei tieferen Ebenen ausgehend zu verstehen: Inwiefern beschreiben die Eigenschaften von Filamentnetzwerken und -gelen die Zellmechanik und, noch tiefgreifender, wie bestimmen eigentlich die einzelnen Filamente die Netzwerkmechanik. Das Verständnis der Mechanik homogener und isotroper, verhedderter als auch quervernetzter Gele ist dabei erstaunlich detailreich, ohne jedoch vollständig dem jüngeren Verständnis von Zellen als glassartige Systeme zu entsprechen. In den letzten Jahren sind daher anisotrope Strukturen mehr und mehr in den Fokus gerückt, die die Bandbreite möglichen mechanischen Verhaltens enorm bereichern. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit solch einem hochgradig anisotropen System -- nämlich Aktinbündeln -- unter drei Gesichtspunkten. Mit Hilfe von aktiven Biegedeformationen wird ein funktionales Modul, das eine differentielle Antwort auf verschiedenen Zeitskalen liefert, identifiziert. Es handelt sich um Aktinfilamente, die durch transiente Quervernetzer gebündelt werden. Während sich das System nach kurz anhaltenden Deformation völlig elastisch verhält, sorgt eine Restrukturierung der Quervernetzer während langanhaltender Deformationen für eine plastische Verformung des Bündels. In einem weiteren Aspekt widmet sich die Arbeit der frequenz- und längenabhängigen Biegesteifigkeit. Die Methode des Bündel-Wigglings, das Induzieren von \"Seilwellen\", wird dabei genutzt, um aus der Wellenform die Biegesteifigkeit zu berechnen. Bündel von Aktinbündeln zeigen dabei ein Verhalten, das vom klassischen Worm-like-chain-Modell abweicht und stattdessen durch das Worm-like-bundle-Modell beschrieben werden kann. Der letzte Aspekt dieser Arbeit untersucht den Musterbildungsprozess bei der Entstehung von Aktinbündeln. Gänzlich unerwartet entstehen quasi-isotrope Strukturen mit langreichweitiger Ordnung, wenn der Bündelungsprozess erst nach der Polymerisation von Filamenten frei von zusätzlichen mechanischen Einwirkungen einsetzt. Da dieser Zustand nicht von der klassischen Flüssigkristalltheorie vorhergesagt wird, soll eine Simulation eine Hypothese zum Entstehungsmechanismus testen. Die Annahme einer lateralen Kondensation von Filamenten zu Bündeln reicht demnach aus, um die beobachteten Strukturen zu erzeugen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum Verständnis hochgradig anisotroper Strukturen und deren Überstrukturen, wie sie auch in lebendigen Zellen reichlich vorhanden sind. / Being the most basic unit of living organisms, the cell is a complex entity comprising thousands of different proteins. Yet only very few of which are considered to play a leading part in the cell’s mechanical integrity. The biopolymers actin, intermediate filaments and microtubules constitute the so-called cytoskeleton – a highly dynamic, constantly restructuring scaffold endowing the cell not only with integrity to sustain mechanical perturbations but also with the ability to rapidly reorganize or even drive directed motion. Actin has been regarded to be the protagonist and tremendous efforts have been made to understand passive actin networks using concepts from polymer rheology and statistical mechanics. In bottom-up approaches isotropic, homogeneous actin-gels are well-characterized with rheological methods that measure elastic and viscous properties on different time scales. Cells, however, are not exclusively isotropic networks of any of the mentioned filaments. Rather, actin alone can already be organized into heterogeneous and highly anisotropic structures like bundles. These heterogeneous structures have only come into focus recently with theoretical work addressing bundle networks. and, in the case of the worm-like bundle theory, individual bundles. This work aims at characterizing bundles and bundle-crosslinker systems mechanically in two complementary approaches – in the time as well as in the frequency domain. In addition, it illuminates a bundle formation mechanism that leads to bundle networks displaying higher ordering.

Schaut man durch ein Mikroskop auf eine biologische Zelle mit angefärbten Zytoskelett, so erblickt man lange, mehr oder minder gerade Objekte. Mit ziemlicher Sicherheit gehören diese zu einer von drei Arten von Zytoskelettfilamenten -- Aktin- oder Mikrofilamente, Intermediärfilamente und Mikrotubuli. Schon seit mehreren Jahrzehnten versucht man die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen nicht nur zu beschreiben, sondern ihr Verhalten von zwei tieferen Ebenen ausgehend zu verstehen: Inwiefern beschreiben die Eigenschaften von Filamentnetzwerken und -gelen die Zellmechanik und, noch tiefgreifender, wie bestimmen eigentlich die einzelnen Filamente die Netzwerkmechanik. Das Verständnis der Mechanik homogener und isotroper, verhedderter als auch quervernetzter Gele ist dabei erstaunlich detailreich, ohne jedoch vollständig dem jüngeren Verständnis von Zellen als glassartige Systeme zu entsprechen. In den letzten Jahren sind daher anisotrope Strukturen mehr und mehr in den Fokus gerückt, die die Bandbreite möglichen mechanischen Verhaltens enorm bereichern. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit solch einem hochgradig anisotropen System -- nämlich Aktinbündeln -- unter drei Gesichtspunkten. Mit Hilfe von aktiven Biegedeformationen wird ein funktionales Modul, das eine differentielle Antwort auf verschiedenen Zeitskalen liefert, identifiziert. Es handelt sich um Aktinfilamente, die durch transiente Quervernetzer gebündelt werden. Während sich das System nach kurz anhaltenden Deformation völlig elastisch verhält, sorgt eine Restrukturierung der Quervernetzer während langanhaltender Deformationen für eine plastische Verformung des Bündels. In einem weiteren Aspekt widmet sich die Arbeit der frequenz- und längenabhängigen Biegesteifigkeit. Die Methode des Bündel-Wigglings, das Induzieren von \"Seilwellen\", wird dabei genutzt, um aus der Wellenform die Biegesteifigkeit zu berechnen. Bündel von Aktinbündeln zeigen dabei ein Verhalten, das vom klassischen Worm-like-chain-Modell abweicht und stattdessen durch das Worm-like-bundle-Modell beschrieben werden kann. Der letzte Aspekt dieser Arbeit untersucht den Musterbildungsprozess bei der Entstehung von Aktinbündeln. Gänzlich unerwartet entstehen quasi-isotrope Strukturen mit langreichweitiger Ordnung, wenn der Bündelungsprozess erst nach der Polymerisation von Filamenten frei von zusätzlichen mechanischen Einwirkungen einsetzt. Da dieser Zustand nicht von der klassischen Flüssigkristalltheorie vorhergesagt wird, soll eine Simulation eine Hypothese zum Entstehungsmechanismus testen. Die Annahme einer lateralen Kondensation von Filamenten zu Bündeln reicht demnach aus, um die beobachteten Strukturen zu erzeugen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum Verständnis hochgradig anisotroper Strukturen und deren Überstrukturen, wie sie auch in lebendigen Zellen reichlich vorhanden sind.:1 Actin filament bundles and patterns 1.1 Actin and other cytoskeletal filaments 1.2 Filament and bundle mechanics 1.2.1 Polymer models 1.2.2 Worm-like bundle theory 1.3 Filament bundling 1.4 Active crosslinkers – contraction and pattern formation 2 Materials and Methods, Instruments and Software 2.1 Actin purification and labeling 2.2 Optical tweezers 2.3 Software libraries for instrument integration 3 Bundle mechanics in the time domain 3.1 Bundle formation and sample preparation 3.2 Bundle bending experiment 3.2.1 LabView VI for bundle bending 3.2.2 Bundle bending 3.2.3 Image analysis and data survey 3.3 Bundle workout – Results of the bending experiments 3.3.1 Multiple bends and elastic response 3.3.2 Endurance test – Plastic response after longer holds 3.3.3 Purely elastic depletion-force induced bundles 3.4 Elastic and plastic deformations of F-actin bundles – Discussion 3.4.1 Bundle formation process and bundle thickness 3.4.2 Elastic response 3.4.3 Elastic versus plastic response 3.5 Differential mechanical response – Summary 4 Bundle mechanics in the frequency domain 4.1 Bundle wiggling – the method 4.2 Bundle formation and sample preparation 4.3 Bundle wiggling experiment 4.3.1 LabView VI for bundle wiggling 4.3.2 Wiggling images to wiggle data 4.4 Bundle wiggling – Results 4.4.1 Bead at end 4.4.2 Wiggling bundled bundles 4.4.3 Thick bundles connected to networks 4.5 Frequency-dependent elastic response of bundles – Discussion 5 Actin bundle networks 5.1 Actin condensation in confined environments – The experiment 5.2 Simulating filament condensation 5.2.1 Implementation details 5.3 Simulation of filament condensation to bundle networks 5.4 Condensation drives pattern formation – Discussion 6 Conclusion A Calculations A.1 Subcircular bending arc and radius of curvature A.2 Correction factor for relaxations times of bundles with bead B Protocols B.1 G-actin from rabbit skeletal muscle B.1.1 Acetone powder prep B.1.2 Actin prep B.1.3 Actin gel-filtration B.2 Buffers B.3 NEM-myosin beads B.3.1 NEM-inactivated myosin B.3.2 NEM-myosin coated beads B.4 Bundle preps B.4.1 Depletion force induced and ff-actinin crosslinked bundles B.4.2 Depletion force induced bundles for wiggling experiments Bibliography / Being the most basic unit of living organisms, the cell is a complex entity comprising thousands of different proteins. Yet only very few of which are considered to play a leading part in the cell’s mechanical integrity. The biopolymers actin, intermediate filaments and microtubules constitute the so-called cytoskeleton – a highly dynamic, constantly restructuring scaffold endowing the cell not only with integrity to sustain mechanical perturbations but also with the ability to rapidly reorganize or even drive directed motion. Actin has been regarded to be the protagonist and tremendous efforts have been made to understand passive actin networks using concepts from polymer rheology and statistical mechanics. In bottom-up approaches isotropic, homogeneous actin-gels are well-characterized with rheological methods that measure elastic and viscous properties on different time scales. Cells, however, are not exclusively isotropic networks of any of the mentioned filaments. Rather, actin alone can already be organized into heterogeneous and highly anisotropic structures like bundles. These heterogeneous structures have only come into focus recently with theoretical work addressing bundle networks. and, in the case of the worm-like bundle theory, individual bundles. This work aims at characterizing bundles and bundle-crosslinker systems mechanically in two complementary approaches – in the time as well as in the frequency domain. In addition, it illuminates a bundle formation mechanism that leads to bundle networks displaying higher ordering.:1 Actin filament bundles and patterns 1.1 Actin and other cytoskeletal filaments 1.2 Filament and bundle mechanics 1.2.1 Polymer models 1.2.2 Worm-like bundle theory 1.3 Filament bundling 1.4 Active crosslinkers – contraction and pattern formation 2 Materials and Methods, Instruments and Software 2.1 Actin purification and labeling 2.2 Optical tweezers 2.3 Software libraries for instrument integration 3 Bundle mechanics in the time domain 3.1 Bundle formation and sample preparation 3.2 Bundle bending experiment 3.2.1 LabView VI for bundle bending 3.2.2 Bundle bending 3.2.3 Image analysis and data survey 3.3 Bundle workout – Results of the bending experiments 3.3.1 Multiple bends and elastic response 3.3.2 Endurance test – Plastic response after longer holds 3.3.3 Purely elastic depletion-force induced bundles 3.4 Elastic and plastic deformations of F-actin bundles – Discussion 3.4.1 Bundle formation process and bundle thickness 3.4.2 Elastic response 3.4.3 Elastic versus plastic response 3.5 Differential mechanical response – Summary 4 Bundle mechanics in the frequency domain 4.1 Bundle wiggling – the method 4.2 Bundle formation and sample preparation 4.3 Bundle wiggling experiment 4.3.1 LabView VI for bundle wiggling 4.3.2 Wiggling images to wiggle data 4.4 Bundle wiggling – Results 4.4.1 Bead at end 4.4.2 Wiggling bundled bundles 4.4.3 Thick bundles connected to networks 4.5 Frequency-dependent elastic response of bundles – Discussion 5 Actin bundle networks 5.1 Actin condensation in confined environments – The experiment 5.2 Simulating filament condensation 5.2.1 Implementation details 5.3 Simulation of filament condensation to bundle networks 5.4 Condensation drives pattern formation – Discussion 6 Conclusion A Calculations A.1 Subcircular bending arc and radius of curvature A.2 Correction factor for relaxations times of bundles with bead B Protocols B.1 G-actin from rabbit skeletal muscle B.1.1 Acetone powder prep B.1.2 Actin prep B.1.3 Actin gel-filtration B.2 Buffers B.3 NEM-myosin beads B.3.1 NEM-inactivated myosin B.3.2 NEM-myosin coated beads B.4 Bundle preps B.4.1 Depletion force induced and ff-actinin crosslinked bundles B.4.2 Depletion force induced bundles for wiggling experiments Bibliography