>Magister Scientiae - MSc / Liposomes as a drug carrier in the pharmaceutical industry has gained currency since its discovery in 1965 by Bangham A. D. Liposomes have been shown to improve bioavailability as they can be delivered to target sites and possess sustained release properties which could be used to mitigate certain weaknesses associated with current diclofenac sodium eye drops. Diclofenac sodium (DNa) eye drop is a sterile Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug (NSAID) with diclofenac sodium as its active ingredient. It is indicated for the lessening of ocular pain, prevention of miosis in eye operations, easing of postoperative inflammation and cystoids macular edema. The residence time of eye drops after application has been found to be 1-2 minutes as a result of continuous production of tears diluting the active ingredient, draining the eye drops into the nasolacrimal path, and eliminating it during blinking. As a result of the active ingredient not residing at the target site for the required duration, more frequent administration and medication is required and the risk of non-compliance is increased. Given the aforementioned potential of liposomes to redress the above weaknesses of current eye drops (dosage form) available for diclofenac sodium ophthalmic application, this study sought to encapsulate diclofenac sodium into liposomes for ophthalmic application. The main components of liposomes (cholesterol and phosphotidylcholine) and incubation time were set as the independent variables while percentage encapsulation, polydispersity index (PDI) and drug release profile constituted the dependent variable. Using analysis of variance (ANOVA) and t-test statistics, the interaction between the independent variables and their effect on the dependent variables were tested.

Nous avons optimisé des liposomes thermosensibles, encapsulant un principe actif anticancéreux, le 5-Fluorouracile (5-FU), afin de déclencher sa libération par une hyperthermie locale modérée (39-42°C) induite par des ultrasons focalisés. L'hyperthermie sera appliquée au niveau de la tumeur, afin d'améliorer l’efficacité thérapeutique et de réduire la toxicité systémique. Les liposomes ont été formulés par hydratation du film lipidique en mélangeant la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) pour sa thermosensibilité à 41,5 ± 0,5°C, le cholestérol (CHOL) pour favoriser la stabilité des liposomes vis-à-vis des composants du sang, et le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG) pour assurer la furtivité de la formulation. Les expériences ont confirmé que les liposomes formulés à base de DPPC/CHOL/DSPE-PEG dans un ratio molaire 90 : 5 : 5 mol% sont thermosensibles. Des liposomes composés du même mélange lipidique dans un rapport 65 : 30 : 5 mol% ont été considérés comme contrôle négatif non thermosensible. L’optimisation de l’encapsulation passive du 5-FU a permis d’obtenir une efficacité d’encapsulation (5-FU encapsulé/5-FU total) de 13%, mais le 5-FU est très faiblement retenu (12%) dans la cavité aqueuse des liposomes du fait du gradient osmotique à la dilution. La rétention du 5-FU a été optimisée (93%) par la technique d’encapsulation active basée sur la complexation intraliposomale du 5-FU avec le complexe cuivre-polyéthylèneimine préalablement encapsulé dans les liposomes. Cette technique a également permis d’améliorer l’efficacité d’encapsulation d’un facteur trois environ (37%), avec un taux de charge (ratio final 5-FU/lipides, mole/mole) de 50% environ. Nous avons alors obtenu des liposomes thermosensibles d'un diamètre hydrodynamique de 65 nm et de charge de surface de -10 mV. Les liposomes non thermosensibles, ont été caractérisés par un diamètre hydrodynamique de 105 nm et une charge de surface de -4,9 mV. La libération du 5-FU déclenchée par une hyperthermie induite par des ultrasons focalisés a été mesurée in vitro. En réponse à une hyperthermie de 42°C, les liposomes thermosensibles libèrent 68% de leur contenu, au bout de 10 min, alors que les liposomes non thermosensibles en libèrent moins de 20%. En outre, la cytotoxicité des liposomes encapsulant le complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine a été évaluée vis-à-vis de la lignée cellulaire HT-29 du carcinome colorectal humain. Les résultats ont révélé que les lipides à une concentration de 800 µM ne sont pas cytotoxiques (80% de viabilité). De plus, la complexation du 5-FU n’influence pas sa cytotoxicité ce qui prouve que la toxicité provient du 5-FU et non des excipients. En revanche, l’encapsulation du complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine dans les liposomes induit une diminution de la concentration inhibitrice médiane de 115 (solution du complexe) à 49 µM environ, corrélée à leur internalisation cellulaire. La pharmacocinétique chez des souris porteuses d’un modèle de tumeur colorectale HT-29 xénogreffée a montré que les liposomes permettent de prolonger d’un facteur 1,4 la demi-vie plasmatique de distribution du 5-FU. De plus, les aires sous la courbe des concentrations plasmatiques sur 24 h sont 1,9 et 2,9 fois plus élevées lorsque le 5-FU est administré sous forme de liposomes thermosensibles et non thermosensibles, respectivement, par rapport à la solution de 5-FU. Enfin, les liposomes non thermosensibles augmentent significativement d'un facteur 2 l'accumulation du 5-FU dans la tumeur par rapport à la solution de 5-FU. En conclusion, les liposomes thermosensibles développés présentent un fort intérêt pour une application thérapeutique en combinaison avec des ultrasons focalisés. / We optimized thermosensitive liposomes encapsulating an anticancer drug, 5-Fluorouracil (5-FU), in order to trigger the release upon focused ultrasound-mediated mild hyperthermia at the tumor. This approach would improve drug efficacy and would lower side effects. Liposomes were prepared by the lipid hydration method by mixing 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) for its temperature sensitivity at 41.5 ± 0.5°C, cholesterol (CHOL) to promote liposome stability towards blood components, and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) to confer stealthiness to the formulation. The experiments confirmed that the liposomes formulated with DPPC/CHOL/DSPE-PEG in a molar ratio 90:5:5 mol% are thermosensitive, while liposomes composed of the same lipid mixture in a ratio 65:30:5 mol% were considered non thermosensitive negative control. The optimization of passive encapsulation of 5-FU yielded an encapsulation efficacy (encapsulated 5-FU/total 5-FU) of 13%. 5-FU was, however, very weakly retained (12%) in the aqueous core of liposomes following dilution due to the generation of an osmotic gradient. The retention of 5-FU has been optimized (93%) by the active encapsulation technique based on the intraliposomal complexation of 5FU with copper-polyethylenimine complex encapsulated beforehand into liposomes. This technique also improved 5-FU encapsulation efficacy by 3-fold (37%), yielding a loading efficiency (final drug/lipid ratio, mol/mol) of approximately 50%. The resulting thermosensitive liposomes and non thermosensitive liposomes have a hydrodynamic diameter and a surface charge around 65 nm and -10 mV, and 105 nm and -4.9 mV, respectively. Heat-triggered drug delivery was evaluated using focused ultrasound, and showed a release of 68% of the encapsulated 5-FU from thermosensitive liposomes, within 10 min, whereas release remained below 20% for the non thermosensitive formulation. Furthermore, the cytotoxicity of 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes towards HT-29 human colorectal carcinoma cell line was evaluated. Results revealed that lipids at a concentration of 800 µM are not cytotoxic (80% viability). Moreover, 5-FU complexation has no impact on its cytotoxic activity, disclosing that liposomes toxicity arose from 5-FU and not from the excipients. Nevertheless, 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes exhibited a lower half maximal inhibitory concentration of 49 µM compared to 115 µM for complex solution. This enhancement of cytotoxicity was attributed to the cellular internalization of liposomes. Pharmacokinetics in mice bearing HT-29 xenograft tumor showed that liposomes can extend the plasma distribution half-life of 5-FU by a factor 1.4. Furthermore, areas under the concentration-time curve over 24 h were higher by 1.9- and 2.9-fold when the drug was encapsulated into thermosensitive and non thermosensitive liposomes, respectively, compared to free 5-Fluorouracil. Finally, non thermosensitive liposomes significantly increased 5-FU accumulation in tumor by 2-fold, compared to 5-FU solution. In conclusion, these 5-FU-loaded thermosensitive liposomes represent valuable carriers to investigate the therapeutic efficacy following focused ultrasound-mediated heat application.