The ubiquitylation cascade regulates multiple cellular functions and is involved in numerous diseases. The distinct transfer cascade, involving E1-E2-E3 enzymes, serves as a promising target for drug development. However, E3 ligases (E3s) represent an important class of enzymes yet there are currently no effective tools for profiling their activity. Herein, a new class of E3 activity-based probe (ABP) is presented which is built by re-engineering ubiquitin (Ub)-charged E2 conjugating enzymes. The utility of these probes has been demonstrated by the rapid dissection of the activation determinants of the RING-Between-RING E3 (RBR) E3, Parkin. Furthermore, biotin-E3 ABPs allow us to systematically discover and dissect the E3 activities of a broad spectrum of E3s that are associated with different diseases. By interfacing the ABPs with mass spectrometry, we establish an activity based protein profiling (ABPP) system and apply it to uncover a new class of E3. We show that MYCBP2 is an E3 ligase with a novel mechanism of action that ubiquitylates threonine residues. MYCBP2 contains a RING domain, that recruits the ubiquitin-loaded E2, and a novel Zn-binding fold that contains two catalytic cysteine residues which relay the Ub to substrate via two thioester intermediates (RING-Cys-Relay, RCR). This discovery demonstrates the power and potential of our E3 activity based protein profiling (ABPP) system.

The calpain family of intracellular Ca2+-dependent cysteine proteases is involved in a number of intracellular signaling processes. Calpain hyperactivity has also been implicated in ischemic injury, neurodegenerative diseases and cataract formation. However, the specific function of calpains in these normal and diseased states remains unclear. Competitive inhibition of calpain is useful for studying their functions and can lead to pharmacological treatments, while monitoring their activity with activity-based probes (ABPs) can reveal how calpain is regulated and be applied to screen for inhibitors in vivo. But these strategies are complicated by the similarity of the calpain active-site when compared to other intracellular cysteine proteases. Therefore, there is a need to design inhibitors and ABPs that selectively target calpain. Using X-ray crystallography, the interactions between the calpain active-site and each of two reversible inhibitors was studied. This led to the discovery of novel non-covalent aromatic stacking and hydrogen bonding interactions between the primed-side adenine group of one inhibitor and indole ring of an active-site Trp residue in μ-calpain. A substrate-based competition assay later confirmed that these interactions provided this compound with an inhibitory advantage over the other, which lacked any primed-side interactions, thereby providing insight into the development of new, more specific reversible calpain inhibitors. Next, a fluorescent ABP, containing features borrowed from an irreversible and presumably calpain-specific inhibitor, was evaluated for its ability to detect calpain activitiy. Although this probe appropriately targeted the calpain active site in its Ca2+-activated form, it was unable to detect calpain activity in a cell extract. Nevertheless, the results of this study have yielded insights into ways of improving the calpain detecting ability of this ABP. / Thesis (Master, Biochemistry) -- Queen's University, 2008-09-01 15:39:07.023

Le développement d’une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d’un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu’avec cette nouvelle sonde qu’il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l’ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l’analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l’analyse de carotides humaines de patients souffrant d’athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l’avenir de tester d’autres fluides pathologiques d’origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies. / A new activity-based probe able to covalently modify the active site of proteases belonging to the matrix metalloprotease family (MMPs) has been developed in this thesis project. The probe was shown to behave as potent inhibitor of several MMPs, with nanomolar Ki values. This probe was also able to modify specifically only the free active site of MMPs, with particular high yields of cross-linking varying from 50 % to 11 %, depending of the MMPs tested. Using radioactivity as means of detection, this probe was able to detect active form of MMPs with a threshold of 1 femtomole. Applied to the study of bronchoalvelolar fluids (BAL) from mice exposed to nanoparticles by a lung aspiration protocol, this probe revealed the presence of the catalytic domain of MMP-12 under its active form, but not in control animals. When used to detect active form of MMPs from extracts obtained from human arteries of patient suffering from atherosclerosis, the probe was not able to detect such MMP active forms. Despite this negative result, the detection of active form of MMP in pathological fluid like BAL has never been reported before this work. Having validated this novel MMP activity-based probe, it will be possible to use it now for detecting MMPs from other pathological fluids or tissues extracts in which MMPs can be good markers of the pathology.

Le développement d'une nouvelle sonde dite " activity-based probe " pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d'un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu'avec cette nouvelle sonde qu'il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l'ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l'analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l'analyse de carotides humaines de patients souffrant d'athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l'avenir de tester d'autres fluides pathologiques d'origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.