Heidelberg, University, Diss., 2003.

Universiẗat, Diss., 2001--München.

University, Diss., 2003--Heidelberg.

Heidelberg, Univ., Diss., 2000.

University, Diss., 2004--Heidelberg.

Over the last decade life sciences have made an enormous leap forward. The development of complex analytical instruments, in particular in fluorescence microscopy, has played a decisive role in this. Scientist can now rely on a wide range of imaging techniques that offer different advantages in terms of optical resolution, recording speed or living cell compatibility. With the help of these modern microscopy techniques, multi-protein complexes can be resolved, membrane receptors can be counted, cellular pathways analysed or the internalisation of receptors can be tracked. However, there is currently no universal technique for comprehensive experiment execution that includes dynamic process capture and super resolution imaging on the same target object. In this work, I built a microscope that combines two complementary imaging techniques and enables correlative experiments in living and fixed cells. With an image scanning based laser spot confocal microscope, fast dynamics in several colors with low photodamage of the cells can be recorded. This novel system also has an improved resolution of 170 nm and was thoroughly characterized in this work. The complementary technique is based on single molecule localization microscopy, which can achieve a structural resolution down to 20-30 nm. Furthermore I implemented a microfluidic pump that allows direct interaction with the sample placed on the microscope. Numerous processes such as living cell staining, living cell fixation, immunostaining and buffer exchange can be observed and performed directly on the same cell. Thus, dynamic processes of a cell can be frozen and the structures of interest can be stained and analysed with high-resolution microscopy. Furthermore, I have equipped the detection path of the single molecule technique with an adaptive optical element. With the help of a deformable mirror, imaging functions can be shaped and information on the 3D position of the individual molecules can be extracted. / Im letzten Jahrzehnt hat der Bereich der Lebenswissenschaften einen enormen Sprung nach vorne gemacht. Maßgeblich dafür waren die Entwicklung von komplexen Analysegeräten insbesondere in der Fluoreszenz Mikroskopie. Die Anwender können nun auf eine Vielzahl von Bildgebungstechniken zurückgreifen die unterschiedliche Vorzüge hinsichtlich optischer Auflösung, Aufnahmegeschwindigkeit oder Lebend Zell Kompatibilität bieten. Mithilfe dieser modernen Mikroskopietechniken lassen sich beispielsweise Multiproteinkomplexe auflösen, Membranrezeptoren zählen, zelluläre Signalwege analysieren oder die Internalisierung von Rezeptoren verfolgen. Für eine umfassende Experimentdurchführung, die Erfassung dynamischer Prozesse sowie superhochauflösende Bildgebung an ein und demselben Zielobjekt beinhalten, gibt es derzeit keine einheitliche Technik. In dieser Arbeit habe ich ein Mikroskop aufgebaut, das zwei komplementäre Bildgebungstechniken vereint und korrelative Experimente von lebend zu fixierten Zellen ermöglicht. Mit einem Image Scanning basierten Konfokal Mikroskop können schnelle Dynamiken in mehreren Farben mit geringer Photoschädigung der Zellen aufgenommen werden. Dieses neuartige System weist zudem eine Auflösungsverbesserung von 170 nm auf und wurde im Rahmen der Arbeit ausführlich charakterisiert. Die komplementäre Technik basiert auf der Einzel-Molekül Lokalisations Mikroskopie, mit der sich eine strukturelle Auflösung von bis zu 20 nm erreichen lässt. Desweiteren habe ich eine Mikrofluidpumpe implementiert, die eine direkte Interaktion mit der auf dem Mikroskop platzierten Probe erlaubt. Zahlreiche Prozesse wie Lebend-Zell Färbung, Lebend-Zell Fixierung, Immuno-Färbung und Puffertausch können damit direkt an der gleichen Zelle beobachtet und durchgeführt werden. So können dynamische Prozesse einer Zelle sozusagen eingefroren werden und die Strukturen von Interesse gefärbt und mit höchstauflösender Mikroskopie analysiert werden. Desweiteren habe ich den Detektionspfad der Einzel-Molekül Technik mit einem adaptiven optischen Element ausgestattet. Mithilfe eines deformierbaren Spiegels lässt sich so Abbildungsfunktion formen und Information zur 3D Position der einzelnen Moleküle gewinnen.

Single-molecule localization microscopy (SMLM) is the method of choice to study biological specimens on a nanoscale level. Advantages of SMLM imply its superior specificity due to targeted molecular fluorescence labeling and its enhanced tissue preservation compared to electron microscopy, while reaching similar resolution. To reveal the molecular organization of protein structures in brain tissue, SMLM moves to the forefront: Instead of investigating brain slices with a thickness of a few µm, measurements of intact neuronal assemblies (up to 100 µm in each dimension) are required. As proteins are distributed in the whole brain volume and can move along synapses in all directions, this method is promising in revealing arrangements of neuronal protein markers. However, diffraction-limited imaging still required for the localization of the fluorophores is prevented by sample-induced distortion of emission pattern due to optical aberrations in tissue slices from non-superficial planes. In particular, the sample causes wavefront dephasing, which can be described as a summation of Zernike polynomials. To recover an optimal point spread function (PSF), active shaping can be performed by the use of adaptive optics. The aim of this thesis is to establish a setup using a deformable mirror and a wavefront sensor to actively shape the PSF to correct the wavefront phases in a super-resolution microscope setup. Therefore, fluorescence-labeled proteins expressed in different anatomical regions in brain tissue will be used as experiment specimen. Resolution independent imaging depth in slices reaching tens of micrometers is aimed. / Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie ist die Methode der Wahl zur Untersuchung biologische Proben im Bereich von Nanometern. Vorteile von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie sind vor allem ihre hohe Spezifität von molekularen Farbstoffbindungen sowie die erreichte hohe Auflösung, die vergleichbar ist mit der elektronenmikroskopischen Auflösung, wobei in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie keine Konservierung der Probe vorgenommen werden muss. Vor allem in der Untersuchung der molekularen Organisation von Proteinstrukturen konnte sich die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie bewähren. Die Verteilung von Proteinen im gesamten Gehirn, sowie ihre Eigenschaft, sich entlang neuronaler Strukturen zu bewegen, kann mithilfe der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie untersucht werden und zu einem besseren Verständnis neuronaler Prozesse beitragen. Proben induzieren optische Aberrationen: Diese Dephasierungen der Wellenfront, welche als Summe von Zernike-Polynomen beschrieben werden kann, verhindert das Erreichen der Auflösungsgrenze. Zur Wiederherstellung einer optimalen Punktspreizfunktion kann die Wellenfront mittels adaptiver Optik aktiv geformt werden. Ziel dieser Arbeit ist der Aufbau eines Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopes mit integrierter adaptiver Optik, bestehend aus einem deformierbaren Spiegel und einem Wellenfrontsensor, um aktiv die Wellenfront zu formen und die Dephasierung zu korrigieren. Zu diesem Zweck werden fluoreszenzmarkierte Proteine, welche in verschiedenen Hirnregionen exprimiert werden, als Proben herangezogen. Optimalerweise könnte so in verschiedenen Tiefen eine ähnliche Auflösung wie bei einer oberflächlichen Messung erreicht werden. Um die Möglichkeiten des Setups zu evaluieren, welches im Verlauf dieser Arbeit aufgebaut wurde, wurden artifizielle Proben erstellt, indem eine Einzelzellschicht hippocampaler Neuronen der Maus, in welchen α-tubulin mit Alexa Fluor 647 angefärbt ist, auf einem 100 µm Maushirnschnitt plaziert wurden. Da letzterer ein hochgradig diffuses Medium zwischen dem Objektiv und den Fluorophoren darstellt, induziert es verschiedene optische Aberrationen, vor allem Sphärische Aberration und Astigmatismus. Indem die Wellenfront und die Punktspreizfunktion von 4 µm Fluosphere Beads, welche eine maximale Emission bei 505 nm haben, und 0.1 µm Tetraspeck Beads, welche eine maximale Emission bei 505 nm zeigen, aufgenommen wurde, konnten die Aberrationen von 521 nm zu 116 nm Quadratmittel des Wellenfrontfehlers reduziert werden. Weiterhin konnten mithilfe der adaptiven Optik Bruchpilot-Anhäufungen in einem Hirnschnitt der Honigbiene in den Calyx der Pilzkörper in einer Messtiefe von 80 µm sichtbar gemacht werden, welche im unkorrigierten Bild nicht sichtbar waren, indem das Quadratmittel des Wellenfrontfehlers von 587 nm auf 196 nm reduziert wird. Insgesamt zeigt die Reduktion des Quadratmittels des Wellenfrontfehlers eine erfolgreiche Korrektur an, aber ist weit entfernt von einer Mikroskopiertechnik, die eine gewinnbringende Forschung in lebenswissenschaftlichen Bereichen garantiert.

Heidelberg, Univ., Diss., 2006.

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Darmstadt.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Berlin.