Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de maladies nosocomiales. Il provoque des infections aiguës ou chroniques en employant conjointement plusieurs facteurs de virulence. Les souches les plus agressives possèdent un système de sécrétion de type III (SST3), injectant des toxines directement dans le cytoplasme des cellules eucaryotes grâce à une nano-aiguille. Récemment, une souche clinique hyper-virulente, appelée CLJ1, a été isolée dans l'unité de soins intensifs de l'hôpital universitaire de Grenoble sur un patient souffrant d'une infection pulmonaire hémorragique. Cette souche ne possède pas les gènes codant pour le SST3 mais sécrète une pore-forming toxin, ExlA, non identifiée auparavant. ExlA est une protéine de 172 kDa, formant des pores de 1,6 nm dans la membrane plasmique de plusieurs types de cellules, à l'exception des érythrocytes. Le pore provoque la rétraction des cellules hôtes et finit par induire la mort de la cellule. Nous avons montré que CLJ1 appartenait à un nouveau clade très divergent des souches classiques de P. aeruginosa, dont les membres possèdent le gène exlA au lieu des gènes codant pour le SST3. Les souches exlA-positives que nous avons collectées dans le monde proviennent d'infections humaines et d'échantillons environnementaux. Leur cytotoxicité, sur diverses cellules humaines et sur un modèle murin d’infection pulmonaire, est corrélée avec les niveaux de sécrétion d'ExlA. En plus de la toxicité membranaire, les souches exlA-positives ont montré des activités protéolytiques élevées envers les VE et E-cadhérines, deux protéines adhésives des jonctions adhérentes requises pour l'intégrité de l'endothélium et de l'épithélium, respectivement. Nous avons démontré que la formation de pores par ExlA dans la membrane eucaryote induisait une entrée massive et rapide de calcium dans le cytosol. Cet afflux de calcium permet la maturation et l'activation d'ADAM10, une protéase eucaryote située à la membrane plasmique. L'activation d’ADAM10 induit le clivage de ses substrats naturels : les VE et E-cadhérines. ExlA fait partie de la même famille de pore forming toxin que ShlA de Serratia marcescens. Nous avons démontré que ShlA utilisait le même mécanisme qu’ExlA pour induire le clivage des cadhérines. En conclusion, les souches bactériennes produisant ExlA ou ShlA détournent un mécanisme naturel de l'hôte pour induire la perte d'intégrité tissulaire. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for nosocomial diseases. It provokes acute or chronic infections due to several virulence factors acting in concert. The most aggressive strains possess a Type III Secretion System (T3SS), injecting toxins directly into the cytoplasm of eukaryotic cells thanks to a nano-needle. Recently, a hyper-virulent clinical strain, called CLJ1, was isolated from a patient suffering of hemorrhagic pulmonary infection, at the intensive care unit of Grenoble University Hospital. This strain lacks a T3SS but secretes a pore-forming toxin, ExlA, not previously identified. ExlA is a 172-kDa protein, forming 1.6-nm pores in the plasma membrane of several cell types, except erythrocytes. The pore causes the retraction of host cells and eventually induces necrotic cell death. We showed that CLJ1 belongs to a recently-discovered and highly divergent clade of P. aeruginosa, whose members possess the exlA gene instead of the genes coding for the T3SS and its effectors. The strains we collected worldwide originate from human infections and environmental samples. Their cytotoxicity on various human cells and mouse models of infection was correlated with ExlA secretion levels. In addition to membrane toxicity, exlA-positive strains displayed high proteolytic activities targeting VE and E-cadherins, two intercellular-junction adhesive proteins required for endothelium and epithelium integrity. We thus investigated the mechanisms of ExlA-induced cadherin cleavage. We demonstrated that ExlA pore formation in the eukaryotic membrane induces a massive and rapid entry of calcium into the cytosol. This calcium influx enables the maturation and activation of ADAM10, an eukaryotic protease located at the cell membrane. ADAM10 activation induces the cleavage of its natural substrates: the VE- and E-cadherins. ExlA is related to other toxins, including ShlA from Serratia marcescens, and altogether they constitute a family of pore-forming toxins with unique properties. We demonstrated that ShlA uses the same mechanism as ExlA to induce the cleavage of the cadherins. In conclusion, exlA- and shlA-positive strains hijack a natural mechanism of the host to induce the loss of tissue integrity.

La voie de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (Ras/MAPK) occupe un rôle central dans la régulation de différents processus biologiques tels que la croissance, la survie mais aussi la prolifération cellulaire. En réponse à des signaux extracellulaires, cette voie de signalisation mène à l’activation des protéines ERK1/2, impliquées dans l’activation de nombreux substrats cellulaires dont les protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase). Ces protéines kinases sont, entre autres, impliquées dans l’invasion et la migration cellulaire mais les mécanismes responsables de ces phénomènes biologiques restent inconnus à ce jour. Dans mon mémoire, je développe tout d’abord les travaux précédemment réalisés dans notre laboratoire, et identifie la protéine p120-Catenin (p120ctn), un composant majeur des jonctions adhérentes (AJ), comme un nouveau substrat de la voie Ras/MAPK. En utilisant notamment un anticorps phospho-spécificique, nous avons pu démontrer que p120ctn est phosphorylée sur la sérine 320, un nouveau site de phosphorylation, d’une manière dépendante des kinases RSK. D’autre part, nous avons trouvé que la signalisation Ras/MAPK réduit l’interaction entre les protéines p120ctn et N-cadhérine. Ainsi, nos observations suggèrent que l’activation de la voie Ras/MAPK est impliquée dans la diminution de l’adhérence entre cellules par la déstabilisation des AJ. Compte tenu du rôle primordial de la voie de signalisation Ras/MAPK dans le cancer, ce mécanisme nouvellement décrit pourrait contribuer à l’avancement des connaissances sur le développement des cancers dépendents de cette voie de signalisation. / The Ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase) signalling pathway is vital in regulating cell growth, survival and proliferation in response to extracellular signals. Positioned downstream in the pathway, the p90 ribosomal S6 kinase (RSK) family regulates cell invasion by weakening cell-cell adhesion, but the mechanisms involved remain elusive. In this thesis, I expand upon previous work performed in our lab and identify p120ctn, a major component of adherens junctions (AJ), as a new substrate of the Ras/MAPK pathway. Using a phospho-specific antibody, we demonstrate that p120ctn is phosphorylated on a new phosphorylation site on S320 upon activation of MAPK signalling in a RSK-dependent manner. Furthermore, we show that Ras/MAPK signaling reduces p120ctn binding to N-cadherin, suggesting a new mechanism by which MAPK activity decreases cell-cell adhesion by destabilizing AJs. Finally, we designed and optimized two individual assays to be used in future experiments examining the effects of Ras/MAPK signalling on AJ function. Taken together, our data identifies RSK as a regulator of p120ctn phosphorylation, and also implicates Ras/MAPK signalling in regulating cell-cell adhesion by destabilizing AJ through p120ctn. Given the role of Ras/MAPK signalling in cancer, this new mechanism may play a role in the development and progression of Ras-driven cancers.

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L'adenocarcinoma ductal de pàncrees és un càncer molt agressiu que actualment representa la quarta causa de mort per càncer als països occidentals. Les teràpies clàssiques, basades en la resecció quirúrgica, la radioteràpia i el tractament amb quimioteràpics com la gemcitabina, no són efectives en la gran majoria del pacients. En aquests darrers anys s'està estudiant l'aplicació de la teràpia gènica com a teràpia alternativa o adjuvant per al tractament d'aquesta neoplàsia. Una aproximació important és la que es basa en la transferència del gen de la timidina quinasa del virus Herpes simplex tipus 1 (TK) i l'administració de la pro-droga ganciclovir (GCV). Un dels atractius que presenta aquest sistema TK/GCV és que disposa d'un mecanisme amplificador de la mort cel·lular, que va més enllà d'eliminar la cèl·lula tumoral modificada genèticament amb el gen TK i que es coneix com l'efecte adjacent. S'ha proposat, que aquest efecte podria ser degut al trànsit dels metabòlits tòxics del GCV a través dels canals intercel·lulars que formen les unions gap.En aquesta tesi hem realitzat una caracterització de l'expressió de les molécules constitutives de les unions gap, les connexines, en l'adenocarcinoma de pàncrees; i hem estudiat el seu paper en l'eficàcia de dues estratègies terapèutiques basades en l'administració de compostos anàlegs de nucleòsids: el sistema suïcida TK/GCV i el quimioteràpic gemcitabina. S'ha estudiat també la possible contribució de l'E-cadherina, element clau de les unions adherents epitelials, en l'efecte citotòxic d'aquestes teràpies i amb especial èmfasi en el sistema TK/GCV.

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