Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-05-08T18:42:12Z No. of bitstreams: 1 CinthiaMeirellyDeAraujoElpidio_DISSERT.pdf: 4353427 bytes, checksum: 62f438ac4ae7fb4d67e844f0f38cd0a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Monica Paiva (monicalpaiva@hotmail.com) on 2017-05-08T18:46:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CinthiaMeirellyDeAraujoElpidio_DISSERT.pdf: 4353427 bytes, checksum: 62f438ac4ae7fb4d67e844f0f38cd0a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-08T18:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CinthiaMeirellyDeAraujoElpidio_DISSERT.pdf: 4353427 bytes, checksum: 62f438ac4ae7fb4d67e844f0f38cd0a1 (MD5) Previous issue date: 2016-02-03 / O objetivo do presente trabalho ? sintetizar e caracterizar um adsorvente pelicular adequado ao processo de Adsor??o em Leito Expandido (ALE). O composto sintetizado possui um n?cleo composto de esferas de zirc?nia estabilizadas com ?tria e recobertas por uma matriz insol?vel de agarose. Nos ensaios para obten??o das part?culas revestidas foi utilizado um sistema agitado com temperatura controlada. A prote?na modelo (Albumina de Soro Bovino - BSA) foi utilizada como adsorbato durante os ensaios. Uma triagem dos corantes reativos (ligantes) Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi feita variando-se o pH para encontrar o ligante com maior capacidade de adsor??o e a melhor condi??o para operar o processo. O corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi selecionado, visto que apresentou um bom desempenho (26,02 mg/g adsorvente) e se mostrou mais est?vel em pH 4,5 a 5,0. A an?lise morfol?gica das part?culas revestidas foi realizada por microscopia ?ptica e mostrou que a espessura do adsorvente pelicular ? aproximadamente 5 ?m. A distribui??o de tamanho realizada em Granul?metro Cilas mostrou que a maioria das part?culas adsorventes possui di?metro entre 112 - 300 ?m, cujo di?metro m?dio foi 197,54 ?m e 202,25 ?m, para a esfera sem e com cobertura, respectivamente. A densidade ligante mostrou que a quantidade de BSA adsorvida ? maior quando a rela??o corante/adsorvente (?g/mg) ? maior. O estudo cin?tico da part?cula imobilizada mostrou o decaimento padr?o. A isoterma de adsor??o mostrou que pela equa??o de Langmuir a capacidade de adsor??o m?xima (qm) da BSA com a part?cula revestida imobilizada com o corante reativo Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado ? igual a 102,328 mg/mL de adsorvente. Palavras-chave: adsor??o em leito expandido, cromatografia por afinidade, adsorvente pelicular. / O objetivo do presente trabalho ? sintetizar e caracterizar um adsorvente pelicular adequado ao processo de Adsor??o em Leito Expandido (ALE). O composto sintetizado possui um n?cleo composto de esferas de zirc?nia estabilizadas com ?tria e recobertas por uma matriz insol?vel de agarose. Nos ensaios para obten??o das part?culas revestidas foi utilizado um sistema agitado com temperatura controlada. A prote?na modelo (Albumina de Soro Bovino - BSA) foi utilizada como adsorbato durante os ensaios. Uma triagem dos corantes reativos (ligantes) Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi feita variando-se o pH para encontrar o ligante com maior capacidade de adsor??o e a melhor condi??o para operar o processo. O corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi selecionado, visto que apresentou um bom desempenho (26,02 mg/g adsorvente) e se mostrou mais est?vel em pH 4,5 a 5,0. A an?lise morfol?gica das part?culas revestidas foi realizada por microscopia ?ptica e mostrou que a espessura do adsorvente pelicular ? aproximadamente 5 ?m. A distribui??o de tamanho realizada em Granul?metro Cilas mostrou que a maioria das part?culas adsorventes possui di?metro entre 112 - 300 ?m, cujo di?metro m?dio foi 197,54 ?m e 202,25 ?m, para a esfera sem e com cobertura, respectivamente. A densidade ligante mostrou que a quantidade de BSA adsorvida ? maior quando a rela??o corante/adsorvente (?g/mg) ? maior. O estudo cin?tico da part?cula imobilizada mostrou o decaimento padr?o. A isoterma de adsor??o mostrou que pela equa??o de Langmuir a capacidade de adsor??o m?xima (qm) da BSA com a part?cula revestida imobilizada com o corante reativo Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado ? igual a 102,328 mg/mL de adsorvente. Palavras-chave: adsor??o em leito expandido, cromatografia por afinidade, adsorvente pelicular.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-02T19:56:10Z No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-06T00:09:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T00:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) Previous issue date: 2017-02-08 / Com o desenvolvimento da ind?stria biotecnol?gica, ? crescente o interesse por ant?genos recombinantes purificados para obten??o de vacinas. Por?m, para essa aplica??o esses ant?genos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso ? de grande relev?ncia o desenvolvimento de t?cnicas que permitam a redu??o do n?mero de opera??es unit?rias necess?rias ao processo de purifica??o, permitindo ainda uma elevada recupera??o e proporcionando uma maior economia na obten??o dos bioprodutos. A Adsor??o em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa prop?cia para o downstream processing, pois ? uma t?cnica cromatogr?fica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarifica??o, concentra??o, purifica??o em uma ?nica opera??o. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os m?todos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacar?deos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor m?todo de rompimento celular para obten??o da prote?na intracelular. As estrat?gias estudadas utilizando lisozima, p?rolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas atrav?s de quatro planejamentos experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsor??o em batelada, utilizando-se cinco ?ons met?licos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor adsor??o do ant?geno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade m?nima de tensoativo Triton X-114 necess?ria na etapa de lavagem da ALE para remo??o do LPS, a fim de obter-se o ant?geno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados ensaios de ALE visando recuperar e purificar a prote?na de interesse. Para os ensaios usando ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avalia??o do rompimento celular, observou-se que maiores quantidades de prote?nas totais e do ant?geno 503 liberadas foram obtidas para o m?todo da ureia e que o ?nico fator significativo para esse planejamento foi a concentra??o, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do ?on met?lico, o cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsor??o do ant?geno 503, apresentando valores de capacidade de adsor??o de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente para as concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as tr?s condi??es analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o percentual de remo??o de LPS foi elevado e que a concentra??o m?nima utilizada (0,01 %) j? foi suficiente para a remo??o de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando elui??o isocr?tica (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recupera??o (3,0 %) do ant?geno 503. Avaliou-se ent?o a elui??o em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Por?m, esta estrat?gia ainda n?o foi eficiente para recuperar a prote?na de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de tr?s passos de elui??o, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse ?ltimo teste mostrou uma recupera??o de 15,0 % da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a t?cnica cromatogr?fica de afinidade por ?ons met?licos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 a partir do homogeneizado de E. coli n?o clarificado. / Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides (endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme, glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump. The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of 503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove 99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized E. coli unclarified.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-03-22T19:38:42Z No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / O crescente interesse e aplica??es dos produtos biotecnol?gicos v?m aumentando o desenvolvimento de novos processos de recupera??o e purifica??o de prote?nas. A adsor??o em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma t?cnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma ?nica opera??o as etapas de clarifica??o, concentra??o e purifica??o da prote?na alvo, reduzindo assim tempo e custos de opera??o. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remo??o de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para definir as condi??es ?timas de adsor??o e elui??o do ant?geno na resina Streamline chelating. Nos ensaios de adsor??o usando o leito na forma expandida empregou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remo??o de endotoxina durante o processo de recupera??o do ant?geno, empregando o tensoativo n?oi?nico triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se elaborar um modelo matem?tico capaz de prever as curvas de ruptura do ant?geno 503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental para adsor??o do ant?geno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentra??o de NaCl de 2,4 M como melhores condi??es de adsor??o. No segundo planejamento, o ?nico fator significativo para elui??o foi a concentra??o de imidazol, definida em 600 mM. A isoterma de adsor??o do ant?geno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade m?xima de adsor??o) e Kd (constante de equil?brio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Atrav?s dos testes de purifica??o diretamente do homogeneizado n?o clarificado obteve-se uma recupera??o de 59,2% da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de 6,0. A adi??o do tensoativo n?o-i?nico Triton X-114 ? etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores (>99%) de remo??o do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condi??es estudadas. O modelo matem?tico obtido para descrever a curva de ruptura do ant?geno 503 na resina Streamline Chelanting em leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa de estimativa de par?metros quanto para de valida??o. O modelo validado foi utilizado na otimiza??o das efici?ncias, obtendo-se os valores m?ximos de efici?ncia do processo e efici?ncia da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto, ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o da prote?na-alvo e remo??o de endotoxina a partir de um extrato de E. coli n?o clarificado em apenas uma etapa. / The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JorgeSC_TESE.pdf: 1730447 bytes, checksum: 39fc94239eeb6e994140c5c0f9a2cc23 (MD5) Previous issue date: 2010-06-22 / Expanded Bed Adsorption plays an important role in the downstream processing mainly for reducing costs as well as steps besides could handling cells homogenates or fermentation broth. In this work Expanded Bed Adsorption was used to recover and purify whey proteins from coalho cheese manufacture using Streamline DEAE and Streamline SP both ionic resins as well as a hydrophobic resin Streamline Phenyl. A column of 2.6 cm inner diameter with 30 cm in height was coupled to a peristaltic pump. Hydrodynamics study was carried out with the three resins using Tris-HCl buffer in concentration of 30, 50 and 70 mM, with pH ranging from 7.0 to 8.0. In this case, assays of the expansion degree as well as Residence Time Distribution (RTD) were carried out. For the recovery and purification steps, a whey sample of 200 mL, was submitted to a column with 25mL of resin previously equilibrated with Tris/HCl (50 mM, pH 7.0) using a expanded bed. After washing, elution was carried out according the technique used. For ionic adsorption elution was carried out using 100 mL of Tris/HCl (50 mM, pH 7.0 in 1M NaCl). For Hydrophobyc interaction elution was carried out using Tris/HCl (50 mM, pH 7.0). Adsorption runs were carried out using the three resins as well as theirs combination. Results showed that for hydrodynamics studies a linear fit was observed for the three resins with a correlation coefficient (R2) about 0.9. In this case, Streamline Phenyl showed highest expansion degree reaching an expansion degree (H0/H) of 2.2. Bed porosity was of 0.7 when both resins Streamline DEAE and Streamline SP were used with StremLine Phenyl showing the highest bed porosity about 0.75. The number of theorical plates were 109, 41.5 and 17.8 and the axial dipersion coefficient (Daxial) were 0.5, 1.4 and 3.7 x 10-6 m2/s, for Streamline DEAE, Streamline SP and Streamline Phenyl, respectively. Whey proteins were adsorved fastly for the three resins with equilibrium reached in 10 minutes. Breakthrough curves showed that most of proteins stays in flowthrough as well as washing steps with 84, 77 and 96%, for Streamline DEAE, Streamline SP and Streamline Phenyl, respectively. It was observed protein peaks during elution for the three resins used. According to these peaks were identified 6 protein bands that could probably be albumin (69 KDa), lactoferrin (76 KDa), lactoperoxidase (89 KDa), β-lactoglobulin (18,3 KDa) e α-lactoalbumin (14 KDa), as well as the dimer of beta-lactoglobulin. The combined system compound for the elution of Streamline DEAE applied to the Streamline SP showed the best purification of whey proteins, mainly of the α-lactoalbumina / A adsor??o em leito expandido vem se destacando como uma t?cnica promissora dentro do downstream processing por ser de f?cil manuseio, baixo custo, diminuir etapas de processamento e utilizar o material particulado no seu estado natural. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo recuperar e purificar prote?nas presentes no soro de queijo tipo coalho, atrav?s da t?cnica de adsor??o em leito expandido, utilizando resinas de troca ani?nica Streamline DEAE e troca cati?nica Streamline SP e intera??o hidrof?bica Streamline Phenyl,. Foi utilizada uma coluna de 2,6 cm de di?metro interno por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Para o estudo do sistema foram realizados testes de hidrodin?mica e corridas de adsor??o, com as tr?s resinas, na presen?a de tamp?es Tris-HCl nas concentra??es 30, 50 e 70 mM, com pHs ajustados usando HCl para 7,0; 7,5 e 8,0. Para os testes hidrodin?micos foram estudados a expans?o do leito e a Distribui??o do Tempo de Resid?ncia (DTR). Na etapa de recupera??o e purifica??o, uma amostra de solu??o de soro de 200 mL foi aplicada, a temperatura ambiente, a uma coluna contendo resina (25 mL) previamente equilibrada em tamp?o Tris/HCl (50 mM e pH 7,0), ap?s lavagem efetuou-se a elui??o de acordo com o tipo de t?cnica utilizada. Dessa forma, para adsor??o com troca i?nica a elui??o ocorria com adi??o do eluente 100 mL Tris/HCl (50 mM, pH 7,0 em NaCl 1M). No caso de intera??o hidrof?bica, o eluente consistia de Tris/HCl (50 mM e pH 7,0). Os ensaios de adsor??o foram realizados com as resinas Streamline DEAE, Streamline SP e Streamline Phenyl e suas combina??es. Os resultados mostraram que para as condi??es em que foram realizados os ensaios fluidodin?micos e para o tipo de coluna utilizada, houve uma tend?ncia a linearidade, o coeficiente de correla??o (R2) foi da ordem de 0,9 e que a resina Streamline Phenyl obteve um maior grau de expans?o que as outras resinas, chegando a uma rela??o H0/H de 2,2. A porosidade do leito usando as resinas DEAE e SP foi de 0,70 e da resina Phenyl foi um pouco maior, em torno de 0,75. O n?mero de pratos te?ricos foi 109, 41,5 e 17,8 e o coeficiente de dispers?o axial (Daxial) foi de 0,5, 1,4 e 3,7 x 10-6 m2/s, para as resinas Streamline DEAE, Streamline SP e Streamline Phenyl, respectivamente. As prote?nas do soro s?o adsorvidas nas tr?s resinas e a concentra??o de prote?na em solu??o diminui rapidamente nos primeiros instantes do processo de adsor??o, sendo o equil?brio alcan?ado nos primeiros 10 minutos. Ao se aplicar o soro bruto sem tratamento para as tr?s resinas at? a satura??o (ruptura), embora exista adsor??o das prote?nas para essas resinas, perde-se grande parte dessas prote?nas nas etapas de passante e lavagem. Essas perdas somam 84, 77 e 96%, para as resinas Streamline DEAE, Streamline SP e Strealine Phenyl, respectivamente. Entretanto, pode-se recuperar 16, 23 e 4%, respectivamente, para as tr?s resinas. As tr?s resinas estudadas apresentaram picos de prote?nas na elui??o. De acordo com esses picos, foram identificadas 6 bandas de prote?nas. Provavelmente essas prote?nas sejam: albumina (69 KDa), lactoferrina (76 KDa) e lactoperoxidase (89 KDa), β-lactoglobulina (18,3 KDa) e α-lactoalbumina (14 KDa), d?mero da β -lactoglobulina. Portanto, as resinas estudadas s?o compat?veis para serem utilizadas em leito expandido. O sistema formado pela elui??o da Streamline DEAE quando foi aplicada na resina Streamline SP, tende a uma melhor purifica??o das prote?nas do soro, principalmente da α-lactoalbumina

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosEAP_DISSERT.pdf: 1904684 bytes, checksum: 4fd2147b17a381ad69d921436b5c83de (MD5) Previous issue date: 2013-12-18 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Expanded Bed Adsorption (EBA) is an integrative process that combines concepts of chromatography and fluidization of solids. The many parameters involved and their synergistic effects complicate the optimization of the process. Fortunately, some mathematical tools have been developed in order to guide the investigation of the EBA system. In this work the application of experimental design, phenomenological modeling and artificial neural networks (ANN) in understanding chitosanases adsorption on ion exchange resin Streamline? DEAE have been investigated. The strain Paenibacillus ehimensis NRRL B-23118 was used for chitosanase production. EBA experiments were carried out using a column of 2.6 cm inner diameter with 30.0 cm in height that was coupled to a peristaltic pump. At the bottom of the column there was a distributor of glass beads having a height of 3.0 cm. Assays for residence time distribution (RTD) revelead a high degree of mixing, however, the Richardson-Zaki coefficients showed that the column was on the threshold of stability. Isotherm models fitted the adsorption equilibrium data in the presence of lyotropic salts. The results of experiment design indicated that the ionic strength and superficial velocity are important to the recovery and purity of chitosanases. The molecular mass of the two chitosanases were approximately 23 kDa and 52 kDa as estimated by SDS-PAGE. The phenomenological modeling was aimed to describe the operations in batch and column chromatography. The simulations were performed in Microsoft Visual Studio. The kinetic rate constant model set to kinetic curves efficiently under conditions of initial enzyme activity 0.232, 0.142 e 0.079 UA/mL. The simulated breakthrough curves showed some differences with experimental data, especially regarding the slope. Sensitivity tests of the model on the surface velocity, axial dispersion and initial concentration showed agreement with the literature. The neural network was constructed in MATLAB and Neural Network Toolbox. The cross-validation was used to improve the ability of generalization. The parameters of ANN were improved to obtain the settings 6-6 (enzyme activity) and 9-6 (total protein), as well as tansig transfer function and Levenberg-Marquardt training algorithm. The neural Carlos Eduardo de Ara?jo Padilha dezembro/2013 9 networks simulations, including all the steps of cycle, showed good agreement with experimental data, with a correlation coefficient of approximately 0.974. The effects of input variables on profiles of the stages of loading, washing and elution were consistent with the literature / A adsor??o em leito expandido (ALE) ? uma t?cnica integrativa que alia conceitos de cromatografia e fluidiza??o de s?lidos. A diversidade de par?metros envolvidos e seus efeitos sinerg?ticos dificultam a tarefa de otimiza??o da opera??o. Felizmente, algumas ferramentas matem?ticas foram desenvolvidas de modo a direcionar as investiga??es do sistema ALE. Assim, o presente trabalho prop?e a aplica??o do planejamento experimental, modelagem fenomenol?gica e redes neurais artificiais (RNAs) na compreens?o da adsor??o de quitosanases na resina de troca i?nica Streamline? DEAE. A cepa Paenibacillus ehimensis NRRL B-23118 foi respons?vel pela produ??o das quitosanases. Nos ensaios de adsor??o usando o leito na forma expandida foi utilizada uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Na base da coluna existia um distribuidor de microesferas de vidro com altura de 3,0 cm. Os ensaios de determina??o de tempo de resid?ncia (DTR) revelaram elevado grau de mistura, entretanto, os coeficientes de Richardson-Zaki mostraram que a coluna estava no limiar da estabilidade. Pelas regress?es das isotermas puderam-se ajustar os dados de equil?brio de adsor??o, na presen?a de diferentes sais da escala liotr?pica. O resultado do planejamento apontou que a for?a i?nica e a velocidade influenciam a recupera??o e pureza das quitosanases. As massas moleculares das duas esp?cies de quitosanases foram estimadas por SDS-PAGE, obtendo-se aproximadamente 23 kDa e 52 kDa. A modelagem fenomenol?gica foi direcionada para descrever as opera??es em batelada e na coluna cromatogr?fica. As simula??es foram executadas no Microsoft Visual Studio, usando a linguagem Fortran. O modelo de taxa constante ajustou-se ?s curvas cin?ticas com excel?ncia, nas condi??es de atividade iniciais 0,232, 0,142 e 0,079 UA/mL. As curvas de ruptura simuladas apresentaram algumas disparidades com os dados experimentais, principalmente quanto ? inclina??o. Os testes de sensibilidade do modelo sobre a velocidade superficial, dispers?o axial e concentra??o inicial mostraram conformidade com artigos publicados. A rede neural foi constru?da no ambiente MATLAB, por meio da Neural Network Toolbox. A valida??o cruzada foi usada para melhorar a capacidade de generaliza??o. Carlos Eduardo de Ara?jo Padilha dezembro/2013 6 Aperfei?oaram-se os par?metros da RNA at? se obter as configura??es 6-6 (atividade enzim?tica) e 9-6 (prote?nas totais), fun??o de ativa??o tansig e algoritmo de treinamento Levenberg-Marquardt. As simula??es da rede neural, incluindo todo o ciclo da opera??o, mostraram boa concord?ncia com os dados experimentais, com coeficiente de correla??o da ordem de 0,974. Os efeitos das vari?veis de entrada sobre os perfis das etapas de carga, lavagem e elui??o foram compat?veis com a literatura