Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-02T19:56:10Z No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-06T00:09:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T00:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaLauraOliveiraDeSaLeitao_DISSERT.pdf: 2567835 bytes, checksum: 8d09f5d4c4935ef58bb6215cd5a73b5f (MD5) Previous issue date: 2017-02-08 / Com o desenvolvimento da ind?stria biotecnol?gica, ? crescente o interesse por ant?genos recombinantes purificados para obten??o de vacinas. Por?m, para essa aplica??o esses ant?genos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso ? de grande relev?ncia o desenvolvimento de t?cnicas que permitam a redu??o do n?mero de opera??es unit?rias necess?rias ao processo de purifica??o, permitindo ainda uma elevada recupera??o e proporcionando uma maior economia na obten??o dos bioprodutos. A Adsor??o em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa prop?cia para o downstream processing, pois ? uma t?cnica cromatogr?fica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarifica??o, concentra??o, purifica??o em uma ?nica opera??o. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os m?todos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacar?deos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor m?todo de rompimento celular para obten??o da prote?na intracelular. As estrat?gias estudadas utilizando lisozima, p?rolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas atrav?s de quatro planejamentos experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsor??o em batelada, utilizando-se cinco ?ons met?licos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor adsor??o do ant?geno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade m?nima de tensoativo Triton X-114 necess?ria na etapa de lavagem da ALE para remo??o do LPS, a fim de obter-se o ant?geno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados ensaios de ALE visando recuperar e purificar a prote?na de interesse. Para os ensaios usando ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avalia??o do rompimento celular, observou-se que maiores quantidades de prote?nas totais e do ant?geno 503 liberadas foram obtidas para o m?todo da ureia e que o ?nico fator significativo para esse planejamento foi a concentra??o, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do ?on met?lico, o cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsor??o do ant?geno 503, apresentando valores de capacidade de adsor??o de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente para as concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as tr?s condi??es analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o percentual de remo??o de LPS foi elevado e que a concentra??o m?nima utilizada (0,01 %) j? foi suficiente para a remo??o de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando elui??o isocr?tica (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recupera??o (3,0 %) do ant?geno 503. Avaliou-se ent?o a elui??o em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Por?m, esta estrat?gia ainda n?o foi eficiente para recuperar a prote?na de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de tr?s passos de elui??o, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse ?ltimo teste mostrou uma recupera??o de 15,0 % da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a t?cnica cromatogr?fica de afinidade por ?ons met?licos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 a partir do homogeneizado de E. coli n?o clarificado. / Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides (endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme, glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump. The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of 503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove 99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized E. coli unclarified.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-03-22T19:38:42Z No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T19:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FranciscoCanindeDeSousaJunior_TESE.pdf: 1665223 bytes, checksum: a3c9c1fa573d5e42243d0808e537d798 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / O crescente interesse e aplica??es dos produtos biotecnol?gicos v?m aumentando o desenvolvimento de novos processos de recupera??o e purifica??o de prote?nas. A adsor??o em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma t?cnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma ?nica opera??o as etapas de clarifica??o, concentra??o e purifica??o da prote?na alvo, reduzindo assim tempo e custos de opera??o. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remo??o de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para definir as condi??es ?timas de adsor??o e elui??o do ant?geno na resina Streamline chelating. Nos ensaios de adsor??o usando o leito na forma expandida empregou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remo??o de endotoxina durante o processo de recupera??o do ant?geno, empregando o tensoativo n?oi?nico triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se elaborar um modelo matem?tico capaz de prever as curvas de ruptura do ant?geno 503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental para adsor??o do ant?geno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentra??o de NaCl de 2,4 M como melhores condi??es de adsor??o. No segundo planejamento, o ?nico fator significativo para elui??o foi a concentra??o de imidazol, definida em 600 mM. A isoterma de adsor??o do ant?geno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade m?xima de adsor??o) e Kd (constante de equil?brio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Atrav?s dos testes de purifica??o diretamente do homogeneizado n?o clarificado obteve-se uma recupera??o de 59,2% da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de 6,0. A adi??o do tensoativo n?o-i?nico Triton X-114 ? etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores (>99%) de remo??o do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condi??es estudadas. O modelo matem?tico obtido para descrever a curva de ruptura do ant?geno 503 na resina Streamline Chelanting em leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa de estimativa de par?metros quanto para de valida??o. O modelo validado foi utilizado na otimiza??o das efici?ncias, obtendo-se os valores m?ximos de efici?ncia do processo e efici?ncia da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto, ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o da prote?na-alvo e remo??o de endotoxina a partir de um extrato de E. coli n?o clarificado em apenas uma etapa. / The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.