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la bioluminescence de l'aequorine en réponse au calcium In vitro et dans le Cortex cerebralTricoire, Ludovic 06 October 2006 (has links) (PDF)
Mon travail de doctorat a consisté à étudier in vitro la bioluminescence calciumdépendante de la photoprotéine aequorine puis d'utiliser cette bioluminescence afin deréaliser l'imagerie des activités du réseau néocortical. En effet, cette protéine peut être<br />exprimée dans des types cellulaires spécifiques et sa bioluminescence présente un rapportsignal/bruit très élevé et pas de toxicité.Dans un premier temps, j'ai recherché des mutations modifiant les propriétés debioluminescence de l'aequorine par une approche de mutagenèse aléatoire et d'évolution in vitro<br />J'ai ainsi obtenu des mutants dont la stabilité, la sensibilité calcique et/ou la cinétique debioluminescence étaient modifiées. L'étude de ces mutants a permis de mettre en évidence les relations étroites entre la cinétique d'émission de la bioluminescence et la<br />sensibilité calcique de l'aequorine. Ces travaux ont permis de mieux comprendre comment laliaison du calcium induit l'émission d'un photon par l'aequorine.Dans un second temps, j'ai développé une approche d'imagerie des activitésd'ensembles neuronaux grâce à une chimère GFP-aequorine exprimée en tranches denéocortex à l'aide d'un virus Sindbis recombinant. J'ai utilisé cette approche pour étudier lamodulation cholinergique de l'activité corticale évoquée par stimulation électrique. J'ai pumontrer que les agonistes muscariniques augmentent l'extension spatiale et la durée desréponses du réseau néocortical aux stimulations électriques.
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De nouveaux senseurs bioluminescents pour l'observation de l'activité cérébrale in toto chez la souris / New bioluminescent sensors for murine brain activity imaging in totoPicaud, Sandrine 24 September 2014 (has links)
Le suivi des flux calciques dans le cerveau de l’animal en mouvement nécessite de nouvellessondes. Nous utilisons la bioluminescence observée chez la méduse Aequorea victoria etimpliquant la protéine aequorine. Une fusion entre l’aequorine et la protéine fluorescente GFP(GA) permet d’obtenir un senseur calcique bioluminescent dont la stabilité et les propriétésspectrales sont adéquates pour de nombreuses applications. L’émission de bioluminescencepermet de suivre la propagation de l’information nerveuse de cellule en cellule, en temps réeldans des réseaux de neurones.Nous avons tout d’abord montré au moyen de construction de lignées transgéniques murinesque la protéine chimère GA peut être exprimée dans des microdomaines cellulaires pouranalyser l’activité neuronale. Nos résultats montrent pour la première fois qu’il est possibled’enregistrer in vivo et de manière non invasive dans l’animal en mouvement deschangements dans la concentration de calcium mitochondrial. Nous avons ensuite réalisé unciblage post synaptique du senseur par fusion à la protéine PSD95. Ce ciblage permet dedétecter l'entrée de calcium au niveau du récepteur NMDA.Parallèlement, nous avons cherché à améliorer les propriétés du senseur GA pour détécterl’activité calcique dans l’animal in toto. Nous identifié un nouvel analogue de lacoelenterazine conduisant à un décalage du spectre de bioluminescence de l’aequorine vers lerouge. Et par ailleurs, nous avons testé l’activité de l’aequorine en fusion avec diversesprotéines fluorescentes. Nous disposons avec ce travail de nouveaux senseurs bioluminescentspour le suivi de l’activité cérébrales dans des études comportementales. / Monitoring calcium fluxes in the brain of freely moving animals requires the development ofnew probes. We use the bioluminescence of the protein aequorin observed in the jellyfishAequorea victoria. A fusion between aequorin and GFP fluorescent protein (GA) provides abioluminescent calcium sensor whose stability and spectral properties are adequate for manyapplications. The emission of bioluminescence is suitable to track in real-time the propagationof nervous impulses from cell to cell in neural networks.We first showed by transgenic murine lines construction that the chimeric protein GA can beexpressed in cell microdomains to analyze neuronal activity. Our results show for the firsttime it is possible to record in vivo and non-invasively in the moving animal, changes in theconcentration of mitochondrial calcium. We then performed a post synaptic targeting of thesensor by fusion with the protein PSD95. This permits to detect the entry of calcium next tothe NMDA receptor.Meanwhile, we tried to improve the properties of the GA sensor to detect calcium activity inthe animal in toto and mor specifically through the skull. We identified a new analogue ofcoelenterazine leading to a shift in the spectrum of aequorin bioluminescence to red. We thentested the activity of aequorin fused with different fluorescent proteins. This leads to newbioluminescent sensors for monitoring the brain activity in behavioral studies.
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Synthèse d’analogues de la coelentérazine pour l’imagerie in vivo dynamique des signaux calciques - Synthèse d’analogues du (-)-EGCG comme inhibiteurs de Dyrk1a dans la thérapie symptomatique de la trisomie 21 / Synthesis of coelenterazine analogs for dynamic in vivo imaging of calcium signaling -Synthesis of (-)-EGCG analogs as Dyrk1a inhibitors in the symptomatic therapy of Down syndromeGealageas, Ronan 01 December 2011 (has links)
Au cours de cette thèse, deux sujets distincts ont été étudiés : d’une part la synthèse d’analogues de la coelentérazine, substrat de différentes luciférases, pour une application en imagerie in vivo, et d’autre part la synthèse d’analogues du (-)-EGCG, inhibiteur de la kinase Dyrk1a, impliquée notamment dans les troubles cognitifs rencontrés dans la trisomie 21.La problématique du premier sujet consistait à obtenir des analogues de la coelentérazine conservant leur activité sur deux luciférases, la luciférase Renilla et l’aequorine, tout en induisant un déplacement vers le rouge de la bioluminescence produite par ces enzymes. L’aequorine, sensible au calcium, représentait la cible biologique principale du projet.Sept analogues dont six originaux ont été obtenues par des méthodes de synthèse classiques, et leurs activités ont pu être testées sur les deux luciférases choisies, avec des résultats probants : malgré des émissions de lumière moins intenses que celles obtenues avec la coelentérazine native, plusieurs molécules ont entrainé un déplacement vers le rouge de la longueur d’onde d’émission de lumière par bioluminescence allant jusqu’à 27 nm pour l’aequorine et plus de 120 nm pour la luciférase Renilla.Le second sujet, de chimie médicinale classique, a principalement consisté à la synthèse d’analogues du gallate d’épigallocatéchine (EGCG) au squelette simplifié, et au sein desquels le cycle pyranique caractéristique des catéchines a été remplacé par un carbocycle. Plusieurs molécules ont pu être synthétisées, dont deux présentant le motif hexaphénol. Leur activité inhibitrice de Dyrk1a a pu être testée in vitro et l’une d’entre elle s’est déjà révélée plus active que l’EGCG. / During this thesis, two distinct projects were studied: on the one hand, the synthesis of coelenterazine analogs, substrate of several luciferases, in the purpose of using them for in vivo imaging, and on the other, the synthesis of (-)-EGCG analogs, inhibitor of the Dyrk1a kinase, which interests us for the role it plays in the mental retardation existing in the Down Syndrome disease.The problematic of the first project consisted in obtaining coelenterazine analogs that would not only maintain their activity on two luciferases, the Renilla luciferase and aequorine, but they should also induce a red-shift of the bioluminescence produced by these enzymes. Because of its sensitivity to calcium, aequorine was the main biologic target of this project.Seven analogs, of which six had an original structure, were synthesized through usual synthetic methodologies and their activities on both aequorine and Renilla luciferase were tested in vitro, with interesting results: even if the intensities of light emission were weaker than those obtained with native coelenterazine, several molecules produced a red-shift of the emission wavelength of bioluminescence, up to 27nm for aequorine and more than 120nm for the Renilla luciferase. The second project, of classical medicinal chemistry, mainly consisted in the synthesis of epigallocatechin gallate analogs (EGCG) with a simplified backbone and in which the pyranic ring typical of catechins was replaced by a carbocycle. Several molecules were synthesized, two of them possessing the hexaphenol motif. Their inhibiting activity of Dyrk1a was tested in vitro and one already showed a better activity than natural EGCG.
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