Thesis (doctoral)--Lund University, 1995. / Added t.p. with thesis inserted.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1995. / Added t.p. with thesis inserted.

Affibody molecules are small (7 kDa) affinity proteins of non-immunoglobulin origin that have been generated to specifically interact with a large number of clinically important molecular targets. In this thesis, Affibody molecules have been employed as tracers for radionuclide molecular imaging of HER2- and IGF-1R-expressing tumors, paper I-IV, and for surface knock-down of EGFR, paper V. In paper I, a tag with the amino acid sequence HEHEHE was fused to the N-terminus of a HER2-specific Affibody molecule, (ZHER2), and was shown to enable facile IMAC purification and efficient tri-carbonyl 99mTc-labeling. In vivo evaluation of radioactivity uptake in different organs showed an improved biodistribution, including a 10-fold lower radioactivity uptake in liver, compared to the same construct with a H6-tag. In paper II, it was further shown that an N-terminally placed HEHEHE-tag on ZHER2 provided lower unspecific uptake of radioactivity in liver compared to its H6-tagged counterpart even when radiolabeling was at the C-terminus using alternative chemistries to attach 99mTc, 111In or 125I. In paper III, the H6-tag’s composition and position was varied with regards to charge, hydrophobicity and its C- or N-terminal placement on ZHER2. Among the ten variants investigated, it was found that an N-terminal HEHEHE-tag provided the most favorable overall biodistribution profile and that introduction of hydrophobic and positively charged amino acids provoked liver uptake of radioactivity. In paper IV, the HEHEHE-tag was shown to enable IMAC purification and tri-carbonyl 99mTc-labeling of an IGF-1R-specific Affibody molecule and improved its overall biodistribution when compared to the same construct with a H6-tag. In paper V, the aim was to develop an intracellular receptor-entrapment system to reduce the surface levels of EGFR. An EGFR-specific Affibody molecule was expressed as a fusion to different mutants of an intracellular transport protein in SKOV-3 cells, resulting in a collection of cell lines with 50%, 60%, 80% and 96% reduced surface level of EGFR. Analysis of the proliferation rate of these cell lines showed that a modest reduction (15%) in proliferation occurs between 60% and 80% reduction of the surface level of EGFR. / <p>QC 20130129</p>

Antibodies, as forerunners in the field of biological drugs, are originally an organism’s answer to the invasion of different pathogens. Today, antibodies are a common treatment for many chronic diseases such as the immune-mediated inflammatory diseases rheumatoid arthritis or psoriasis. It is suspected that the cytokines interleukin 17a (IL17a) and interleukin 17c (IL17c) are involved in those diseases and are commonly treated with antibodies that inhibit the cytokines. Even though antibodies have been a huge success as biological drugs they also have downsides when it comes to their production, size and stability. In quest of finding alternatives to antibodies in diagnostics and therapy, a novel class of biologics has been developed. So-called alternative scaffold proteins are small polypeptide chains that can be engineered to show affinity towards different biomarkers. ABD-Derived Affinity ProTeins or ADAPTs are one example of these alternative scaffolds that can be modified to bind a biomarker as target and keep their affinity to Human Serum Albumin (HSA) at the same time, making them bispecific. In this project, twenty-four previously selected ADAPT binder candidates that have shown good prospects towards IL17a and IL17c in previous experiments were cloned, produced, purified and characterized to determine if they show potential as tools in diagnostics or therapy of autoimmune diseases. The proteins were produced in E. coli, purified by affinity chromatography and characterized using Surface Plasmon Resonance (SPR), Circular Dichroism (CD) and Size Exclusion Chromatography (SEC). All candidates were successfully cloned into E. coli and out of these, 10 could be produced and 5 showed affinity towards their target using SPR. Examination by SEC and CD showed that the protein variants did not seem to be structurally stable and hints of impurities in the samples could be detected. This and a low yield could be further confirmed via SDS-PAGE. In conclusion, binders were produced that could theoretically be promising candidates as tools in diagnostics or therapy of chronic diseases were IL17a and/or IL17c are important. Nevertheless, in order to support these claims further investigations and developments are necessary. / Antikroppar, som föregångare inom området biologiska läkemedel, är ursprungligen en organisms svar på invasionen av olika patogen. Idag är antikroppar en vanlig behandling för många kroniska sjukdomar, såsom de immunmedierade inflammatoriska sjukdomarna reumatoid artrit eller psoriasis. Cytokinerna interleukin 17a (IL17a) och interleukin 17c (IL17c) tros vara involverade i dessa sjukdomar och behandlas vanligtvis med antikroppar som hämmar cytokinerna. Trots att antikroppar har varit en stor framgång som biologiska läkemedel har de också nackdelar när det gäller deras produktion, storlek och stabilitet. För att hitta alternativ till antikroppar inom diagnostik och terapi har en ny klass av biologiska läkemedel utvecklats. Så kallade alternative scaffold proteins är små polypeptidkedjor som kan manipuleras för att visa affinitet gentemot olika biomarkörer. ABD-Derived Affinity ProTeins eller ADAPTs är ett exempel på dessa alternative scaffolds som kan modifieras för att binda en biomarkör som mål utan att påverka affiniteten till Humant Serum Albumin (HSA), vilket gör dem bispecifika. I detta projekt klonades, producerades, renades och karakteriserades tjugofyra tidigare utvalda ADAPT-bindarkandidater som har visat goda förutsättningar gentemot IL17a och IL17c i tidigare experiment. Proteinerna producerades i E. coli, renades genom affinitetskromatografi och karakteriserades med användning av Surface Plasmon Resonance (SPR), Circular Dichroism (CD) och Size Exclusion Chromatography (SEC). Alla kandidater klonades framgångsrikt i E. coli och av dessa kunde 10 produceras. Fem bindare visade affinitet till deras mål med SPR. Undersökning med SEC och CD visade dock att proteinvarianterna inte var strukturellt stabila och antydan till föroreningar kunde detekteras i proverna. Detta och ett lågt utbyte kunde ytterligare bekräftas via SDS-PAGE. Sammanfattningsvis kunde bindare producerades och dessa kan teoretiskt vara lovande kandidater till diagnostik eller terapi av kroniska sjukdomar där IL17a och/eller IL17c är viktiga. För att stödja dessa påståenden krävs dock ytterligare experiment och utveckling av bindarna.

Marknaden för proteinbaserade läkemedel, de så kallade biologiska läkemedlen, är idag en industri som omsätter miljarder. Ett vanligt sätt att utveckla dessa läkemedel på är med hjälp av monoklonala antikroppar då de kan binda till sitt mål med hög specificitet. Däremot begränsas denna teknik av en lång och dyr produktion som dessutom kräver däggdjursbaserade uttrycksystem. En alternativ teknik till de monoklonala antikropparna är att använda små proteiner som enkelt kan produceras i bakterier till en låg kostnad. Dock begränsas denna metod av de små proteinernas korta cirkuleringstid i blodet. I ett tidigare projekt, har ett litet protein vid namnet ABDderived affinity ProTein (ADAPT) på cirka 7 kDa, utvecklats för att kunna binda till både humant serumalbumin (HSA) för att förlänga cirkulationstiden i blodet och Interleukin 17c (IL17c) som är ett pro-inflammatorisk cytokin. Studien visade dock att ADAPT proteinet inte samtidigt kunde binda till de båda molekylerna tillräckligt effektivt. Syftet med denna uppsats är därför att undersöka om det nämnda proteinet kan optimeras genom så kallad multimering och/eller manipulering av bindningssätet för HSA i syfte att åstadkomma en effektiv och mer långvarig cirkulationstid i blodet samtidigt som det binder sig till sitt mål, IL17c. Tio nya versioner av ADAPT proteinet har utvecklats genom att klona och transformera proteiner till en högt producerande Escherichia coli (E. coli) stam. Proteinerna har sedan producerats och renats fram. Det kunde observeras att proteinerna hade den önskade renheten för att kunna karaktäriseras. Vidare var det möjligt att se att proteinerna hade sin önskade molekylvikt och erhöll sin förväntade struktur som en alfahelix. Proteinernas smältpunkter hade förbättrats eller var liknande jämfört med det ursprungliga proteinet. Dessutom kunde alla proteiner återgå till sin ursprungliga struktur efter upphettning. Utvärderingen av proteinernas bindningskapacitet, med original proteinet som referens, visade på en ökad affinitet till sitt mål, IL17c, för två dimerer och trimeren samt en jämförbar affinitet för två av monomererna med ett manipulerat bindingssäte till HSA. Interaktion till HSA var jämförbar med den ursprungliga ADAPT molekylen för alla nya varianter förutom monomererna med ett manipulerat bindingssäte och dimeren med två manipulerat bindingssäten till HSA. Evaluering av de nya proteinernas kapacitet att binda samtidigt till HSA och IL17c visade att det var gynnsamt med en dimereiserad molekyl då det skapade en distans mellan molekylerna och dess bindningssäten. Vidare kunde det också visas att ordningen som molekylerna interagerade med varandra påverkade proteinernas simultana bindning. / The market for protein-based drugs, or the so-called biopharmaceuticals, is a multibillion-dollar industry today. In the development of protein-based drugs it is common to use monoclonal antibodies (mAbs) due to their ability to bind to its target with high specificity. However, therapeutical development of mAbs is limited by its long and expensive production in mammalian expression system. An alternative to mAbs are the so-called alternative scaffolds which are small proteins that can be produced in bacteria at lower costs. Although a drawback with the latter proteins is their short serum half-life. A small scaffold protein, ABD-Derived Affinity ProTein (ADAPT) of approximate 7 kDa was earlier engineered to obtain bispecific affinity, to Human Serum Albumin (HSA), to extend its half-life, as well as to the pro-inflammatory cytokine, Interleukin 17c (IL17c). Unfortunately, it was shown that the simultaneous binding was not efficient enough for its desired purpose. The aim with this project was therefore to investigate if the previous mentioned binder could be optimized by multimerization and/or manipulation of the HSA binding site for an efficient half-life extension. By generating ten new designs of the ADAPT variants, it was observed that the new variants had stable alpha helical structures and an improved or similar melting temperature as the original variant. The evaluation of the target binding displayed an improved affinity to the target, IL17c, for two of the dimeric versions as well as for the trimer and a comparable affinity for two of the monomers with a manipulated HAS binding site. The interaction to HSA was comparable to the original ADAPT for all binders except from the monomers with impaired HSA binding and the dimer with two impaired HSA binding sites. The evaluation of the simultaneous binding showed that it was favored by dimerization when a distance between the two molecule and their binding surfaces was added. Moreover, it could also be seen that the order of binding events had an impact on the simultaneous binding.