Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1997. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [78]-85).

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.