Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-03T12:48:10Z No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-26T17:53:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T17:53:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_EduardoFerreiraPereira.pdf: 3187364 bytes, checksum: 50b7a71b45f3b71d8af9c22fc9653768 (MD5) / O Brometo de Etídio (BE) é um composto fluorescente que tem seu rendimento quântico muito aumentado quando intercalado à moléculas de DNA e RNA e, por isto, é usado para detecção destas espécies em procedimentos de eletroferese em gel. Devido a estas características, esta substância é considerada perigosa, pois pode causar danos ao material genético humano sendo classificado como um agente mutagênico /tóxico. Para realização do seu descarte é necessário um processo de inertização, sendo um dos mais aplicados o proposto por Lunn e Sansone em que são utilizados o ácido hipofosfórico e o nitríto de sódio para oxidação da substância. Porém, esta é uma reação de longa duração e a sua finalização deve ser atestada com o uso da detecção por fluorescência. Considerando este aspecto, o principal objetivo do trabalho foi construir e avaliar um sistema automatizado de baixo custo com detecção fluorimétrica, empregando-se um LED (máximo de emissão em 535 nm) para monitorar a degradação do BE. Este instrumento é controlado por microcontroladores (PIC 16F877A e PIC 16F628) que são responsáveis pelos controles dos processos de fluxo das amostras e do fluido carreador e por adquirir e processar o sinal do sistema de detecção, composto de dois fotodiodos e como filtros para, emissão do BE, foram utilizados plásticos de coloração alaranjada. O Fluorímetro proposto foi avaliado tanto em batelada quanto em um sistema de fluxo e apresentou limites de detecção de 0,33 mg L-1 no sistema de fluxo com abordagem stoped-flow e 0,04 mg L-1 em batelada (utilizando cubeta). As medidas realizadas com o instrumento foram comparadas ao de um fluorímetro comercial de bancada e em todas as comparações não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95% de confiança. Foram realizados testes para verificar se o sistema de decisão do instrumento proposto era confiável para indicar automaticamente o final da degradação sendo observada uma taxa de 100% de acerto para as amostras testadas com concentrações acima do limite máximo permitido e abaixo deste limite (5 mg L-1). Alternativamente, avaliou-se a possibilidade de uso de um sistema de detecção de BE utilizando um LED como fonte de excitação e medidas das componentes RGB de imagens a partir de um aplicativo e da câmera de um aparelho celular. Para esta abordagem foi encontrado um limite de detecção de 0,91 mg L-1 utilizando apenas componente R. Comparando-se os resultados obtidos para amostras fortificadas com BE realizadas com o fluorímetro proposto e com a detecção via celular com os resultados obtidos com um espectrofluorímetro comercial, não foram observadas diferenças significativas ao nível de 95 % de confiança. O Fluorímetro de LED proposto se mostrou eficiente e teve um rendimento satisfatório a um baixo custo (cerca de US$ 200) podendo ser aplicado para a detecção de BE no procedimento de descarte ou na detecção destes em amostras residuais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ethidium Bromide (BE) is a fluorescent compound which has a significant enhancement of quantum yield when intercalated with RNA and DNA molecules and, due to such effect, it is applied for detection of these species in gel electrophoresis. For that reason, BE is considered dangerous, producing damages to human genetic material and classified as a mutagenic/toxic agent. In order to discard BE residues, is necessary a prior process to turn the substance inert and one of the most applied protocols is the proposed by Lunn and Sansone, where hipofosforic acid and sodium nitrite are used to oxidize the BE. However, this reaction requires a long time period and its finalization must be attested by fluorescence measurements. Considering this, the main objective of this work was to fabricate and evaluate a low cost automated system with fluorometric detection, using a LED (maximum emission in 535 nm) to to monitor BE degradation. The proposed instrument is controlled by microcontrollers (PIC 16F877A and PIC 16F628) that controls the sample and carrier flows and performs the acquisition and processing of the analytical signal from the detector, comprising two photodiodes covered by two pieces of transparent orange plastic. The proposed fluorometer was tested with the use of batch or flow based strategies. Using a stopped-flow system, the limit of detection of 0.33 mg L-1 was achieved and for the batch determination the detection limit was 0.04 mg L-1. The determinations performed with the proposed LED fluorometer were compared to the determinations performed with a commercial spectrofluorometer with no significant differences at 95 % confidence level. Tests were also conducted to verify if the decision system of the proposed instrument was reliable to automatically indicate the end of degradation, being checked 100 % of accuracy for the tested samples with BE concentrations beyond and below the limit of concentration of 5 mg L-1. Alternatively, the detection of BE using a green LED as excitation source and measurements of RGB pattern from photographic images acquired by a cell phone was evaluated. For this approach, the detection limit of 0.91 mg L-1 was stimated using only the Red component of RGB. By comparing the results acquired with the proposed fluorometer/cell phone detection with the data obtained with a commercial spectrofluorometer for BE fortified samples, no significant differences were observed at the 95 % confidence level. The proposed LED Fluorometer was efficient and had a satisfactory performance at a low cost (US$ 200) and can be applied to the detection of BE in the disposal procedure or detecting in residual samples.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-05-05T14:06:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2977630 bytes, checksum: ddac172d74744a5a2de8d5b5899928fa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-05T14:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2977630 bytes, checksum: ddac172d74744a5a2de8d5b5899928fa (MD5) Previous issue date: 2014-07-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O brometo de etídio é um composto comumente utilizado em laboratórios de biologia molecular como marcador para visualização de DNA. Apresenta riscos potenciais de toxicidade e mutagenicidade, sendo necessário o tratamento dos seus resíduos antes do descarte. Na tentativa de evitar riscos de contaminação ambiental, a ozonização tem se mostrado uma técnica promissora devido o seu elevado potencial oxidante. Embora o uso de ozônio para degradação de compostos orgânicos venha se tornando cada vez mais comum, ainda pouco se sabe sobre os intermediários de reação e produtos formados durante a ozonização de efluentes. Dessa forma, é preciso garantir que esses produtos de degradação não sejam tóxicos. Para tanto se faz necessária aplicação de estudos toxicológicos. Esse trabalho estudou a cinética de degradação do brometo de etídio e a eficiência de degradação do corante em solução aquosa na presença e ausência dos catalisadores ZnO, Al 2O3 e resina XAD- 7, além de identificar o caráter tóxico dos produtos de degradação. Na aplicação da ozonização, observou-se que a cinética de degradação do composto é favorecida em meio ácido, sendo dependente também da concentração de ozônio. A eficiência de degradação é dependente do pH do meio e apresenta melhores resultados em meio básico, com cerca de 96% de remoção do corante. Nessa técnica, os produtos de degradação, tanto para meio ácido, quanto para meio básico, apresentaram toxicidade. A ozonização catalítica apresentou aumento da eficiência de degradação do brometo de etídio na presença do catalisador ZnO em meio ácido, em uma dosagem de 0,5 g L-1, aumentando o percentual de degradação de 75,3% para 95,5%, nessa condição. O Al2O3 e a XAD-7 não apresentaram atividade catalítica significativa. Os testes de toxicidade realizados para os produtos de degradação via ozonização catalítica se apresentaram atóxicos quando comparados aos resultados da ozonização sem a presença de catalisadores. / Ethidium bromide is a compound commonly used in molecular biology laboratories as a marker for visualization of DNA. Presents potential risks of toxicity and mutagenicity, the treatment of their waste before disposal is required. In an attempt to prevent environmental contamination, ozonation has shown a promising technique due to its high oxidizing potential. Although the use of ozone for degradation of organic compounds come becoming increasingly common, little is known about the reaction intermediates and products formed during the ozonation of wastewater. Thus, it must ensure that these degradation products are not toxic. So is necessary the application of toxicological studies. This study investigated the kinetics of degradation of ethidium bromide and the efficiency degradation of the dye in aqueous solution in the presence and absence of catalysts ZnO, Al 2O3 and XAD -7 resin and identify the nature of toxic degradation products. In the application of ozonization, it was observed that the degradation of the compound is favored in acidic environment, which also depends on the concentration of ozone. The efficiency of degradation is dependent on the pH and the best results are in basic medium, with approximately 95% removal of the dye. In this technique, the degradation products in acidic and basic medium showed toxicity. The catalytic ozonation showed an increase in the degradation efficiency of ethidium bromide in the presence of ZnO catalyst in acid medium, at a dosage of 0.5 g L-1 , increasing the rate of degradation of 75.3% to 95.5 %, in that condition. The Al 2O3 and XAD-7 showed no significant catalytic activity . The toxicity tests performed for degradation products via catalytic ozonation presented nontoxic when compared to the results of ozonization without the presence of catalysts.

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

Brain stem remyelination following demyelination induced by ethidium bromide (EB) is carried out by oligodendrocytes and Schwann cells that invade the central nervous system when astrocytes are lost. Although oligodendrocyte remyelination is detected from 13 days onward within the lesions, the origin of the remyelinating cells is not known. To clarify oligodendrocyte origin as well as to observe astrocytic behaviour in normal (n=22) as well as immunosuppressed animals (n=22) adult Wistar rats were injected with EB in the basal cisterna. Wistar rats had an EB injection while treated with cyclophosphamide (astrocyte investigation, n=12) or cyclosporine A (oligodendrocyte study, n=10). Control animals had a single injection of 10 μl of 0.9% saline (n=16). For the investigation on astrocytes, the rats were killed at 1, 2, 3, 7, 14 and 21 days a.i. GFAP labelled astrocytes were conspicuous within the lesions and isomorphic gliosis was detected, more marked in those rats immunosuppressed with CY. Nonetheless a significant difference among the groups could not be established because of the mean deviations detected by the image studies. For the oligodendrocyte investigation the rats were killed at 15, 21 and 31 days a.i. Lesions of EB injected in normal and cyclosporine A-treated Wistar rats labelled positive for OSP (oligodendrocytes specific protein). This result points to mature oligodendrocytes as a source of remyelinating cells to restore the lost myelin sheaths after EB injection. The EB model of demyelination allowed the observation of the neuroglia in lesions where remyelination is made up by mature cells of the oligodendroglial lineage and where astrocytes respond selectively to immunosuppressive drugs that modify the inflammatory reaction induced by EB / Remielinização após desmielinização com brometo de etídio (BE) no tronco encefálico de ratos é realizada por oligodendrócitos e células de Schwann que invadem o tecido após a morte dos astrócitos. Embora a remielinização por oligodendrócitos seja detectada a partir dos 13 dias pós-intoxicação, a origem das células remielinizantes não é conhecida. Para esclarecer essa origem bem como o comportamento astrocitário em lesões induzidas pelo BE em ratos adultos normais (n=22) ou sob terapia imunomoduladora (n=22), ratos Wistar adultos receberam uma injeção de 10 μl de BE na cisterna basal. Ratos Wistar receberam a injeção de BE enquanto sob terapia imunossupressora com ciclofosfamida (estudo astrocitário) (n=12) ou ciclosporina-A (n=10) (estudo da oligodendróglia). Os animais controle receberam uma injeção de 10 μl 0.9% de solução salina (n=16). Para o estudo astrocitário, os animais foram sacrificados aos 1, 2, 3, 7, 14 e 21 dias pós-injeção de BE. Astrócitos foram marcados com GFAP (proteína glial fibrilar ácida) e foi detectada gliose isomórfica nas lesões, mais marcada naqueles animais tratados com ciclofosfamida (CY). Embora existisse diferença entre a marcação por GFAP nos ratos que receberam somente BE e os que receberam BE e CY, os desvios das médias obtidas através da análise de imagem, não permitiram uma conclusão sobre a significância dessa diferença. Os ratos do experimento sobre a oligodendróglia foram sacrificados aos 15, 21 e 31 dias p.i. do BE. Tecidos de ratos normais injetados com BE e ratos injetados e tratados com ciclosporina foram marcados com imunofluorescência (IF) para OSP (proteína específica do oligodendrócito) que marca células maduras da linhagem oligodendroglial. O resultado foi a marcação de células maduras que remielinizavam em áreas próximas ao tecido normal, mostrando oligodendrócitos maduros como fonte celular na reparação das bainhas perdidas. O modelo de desmielinização do BE permitiu estudar a atividade da neuróglia em lesões que foram remielinizadas por oligodendrócitos maduros e nas que os astrócitos responderam seletivamente a imunossupressores que interferem com a reação inflamatória dentro do tecido

The Epstein Barr virus (EBV) is studied in this project to establish a latency compared with the infected organism and to a number of pathophysiologies. Its oncogenic potential associated with serological evidence of the presence of the viral agent for cancer and also for autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and lupus erythematosus. Detection processes are necessary and have attracted scientific interest in recent decades, and they are important analytical tools used for clinical diagnosis, disease control, physiological changes, among others. Through the above two genosensors were developed to the specific recognition of EBV by electrochemistry. The peak oxidation of ethidium bromide (EB) in graphite electrodes modified with poly (4-ATP) and the peak tetramethylbenzindine (TMB) reduction, as a new indicator of hybridization oligonucleides, in graphite electrodes modified with poly (AP-4) were designed and evaluated these platforms. Analysis of Surface Plasmon Resonance (SPR) and Atomic Force Microscopy (AFM) were used to complement the study to theoretical and practical application. The prospect of this project is the application in the diagnosis of infection caused by the Epstein-Barr virus (in serum samples, saliva and urine) non-invasively in rapid tests evaluating their sensitivity, selectivity, specificity, speed and low cost. / O vírus Epstein Barr (EBV) é estudado neste projeto por estabelecer uma relação de latência com o organismo infectado e a uma série de fisiopatologias. Seu potencial oncogênico está relacionado às evidências sorológicas da presença do agente viral em neoplasias e também às doenças autoimunes como a Artrite Reumatoide e o Lúpus Eritematoso. Processos de detecção são necessários e têm despertado interesse científico nas últimas décadas, sendo importantes ferramentas analíticas usadas para diagnóstico clínico, controle de doenças, alterações fisiológicas, dentre outras. Mediante o exposto, dois genossensores foram desenvolvidos visando o reconhecimento específico do EBV pela eletroquímica. O pico de oxidação do brometo de etídio nos eletrodos de grafite modificados com poli(4-ATF) e o pico de redução de tetrametilbenzindina, como novo indicador de hibridização de oligonucleotídeos, nos eletrodos de grafite modificados com poli(4-AF) foram projetados e avaliados nestas plataformas. Análises de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) e Microscopia de Força Atômica (AFM) foram utilizadas para complementar o estudo a fim de fundamentação teórica e prática. A perspectiva deste projeto é a aplicação no diagnóstico da infecção causada pelo vírus Epstein-Barr (em amostras de soro, saliva e urina) de forma não invasiva em testes rápidos avaliando sua sensibilidade, seletividade, especificidade, rapidez e de baixo custo. / Doutor em Genética e Bioquímica