As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

Resumo: Substâncias perigosas são freqüentemente utilizadas em laboratórios de ensino e pesquisa das Universidades. Até pouco tempo não existia preocupação com o destino destas substâncias após o uso. Tinha-se a falsa idéia de que como a Universidade utiliza poucas quantidades, de diferentes produtos, seu efeito ao ambiente era irrelevante. Felizmente atualmente este cenário é outro e as Universidades estão implementando programas de gerenciamento e em alguns poucos casos, de tratamento de resíduos. Diferentemente de agentes biológicos, substâncias químicas não possuem um procedimento de degradação que seja eficaz às diferentes classes e é necessário o desenvolvimento de diferentes métodos para diferentes produtos. Este trabalho adaptou métodos degradativos apresentados na literatura à três substâncias, escolhidas por sua toxicidade e pelo volume gerado anualmente das mesmas: brometo de etídeo (BE), formaldeído e fenol. A degradação do BE foi monitorada por fluorescência e pela concentração de Carbono Orgânico Total (COT), como BE é mutagênico seu produto de degradação foi submetido ao teste de mutação gênica com Salmonella thiphimurium (teste de Ames) utilizando as linhagens TA97a, TA98 e TA100, para avaliar se havia perdido esta característica. Observou-se que embora todos os tratamentos apresentassem a mesma resposta quanto a fluorescência, o ensaio mutagênico mostrou que apenas dois procedimentos poderiam ser realmente empregados. Os demais resíduos (fenol e formaldeído) tiveram seus produtos de degradação avaliados por COT e segundo as premissas da legislação estadual para efluentes em ambos os casos os resíduos apresentaram uma boa redução da carga orgânica. A toxicidade dos produtos formados foi avaliada por testes ecotoxicológicos (Daphna magna) e como todo formaldeído e fenol foram oxidados essa propriedade foi efetivamente eliminada. / Abstract: Hazardous substances often have been used in university teaching and researching laboratories as well. Few years ago there was not the concern about the destiny of these substances after their application. There was the wrong concept as the university use a few quantities of different kind of products, the behavior of these products in the environment were insignificant. Fortunately, nowadays the context has changed and the universities have established management programs of waste treatment. Distinctly of biological agents, chemicals substances do not have a model is better (or pattern) of destruction efficient to so many categories or types. So it is necessary the development of different methods for different products. This present work adjusted degradative methods presented on the literature for three different substances, chosen by their toxicity and quantity yearly storage: ethidium bromide (EB); formaldehyde and phenol. The degradation of EB was observed by fluorescence and by total carbon organic concentration, as BE is mutagenic, its degradation product was submitted to mutagenicity test with Salmonella thiphimurium (Ames test) using TA97a, TA98 and TA100, for evaluate original characteristics. The obtained data shown that although all of treatments presented the same answer for the fluorescence, the mutagenic assay has shown that just two methods could be efficiently used. The another products (phenol and formaldehyde) have had yours degradatives products evaluated by TOC according the supposition from the state legislation for wastewater, in both cases the results data shown reduction organic The toxicity of products in this case were evaluated by ecotoxicological tests (Daphnia magna), as all formaldehyde and phenol have been oxidized the toxicity was banished. Even tough the results obtained shown that methods are simple and could be applied for own creators in situ, just follow the methods shown in these work. / Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi / Coorientador: Raquel Fernandes Pupo Nogueira / Banca: Mary Rosa Rodrigues de Marchi / Banca: Maria Lucia Ribeiro / Banca: Valdir Schalch / Banca: Pedro Sergio Fadini / Banca: Messias Borges Silva / Doutor

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-19Bitstream added on 2014-06-13T20:26:03Z : No. of bitstreams: 1 fonseca_jcl_dr_araiq.pdf: 990419 bytes, checksum: e085f09b617e177af79386bb8d35d879 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Substâncias perigosas são freqüentemente utilizadas em laboratórios de ensino e pesquisa das Universidades. Até pouco tempo não existia preocupação com o destino destas substâncias após o uso. Tinha-se a falsa idéia de que como a Universidade utiliza poucas quantidades, de diferentes produtos, seu efeito ao ambiente era irrelevante. Felizmente atualmente este cenário é outro e as Universidades estão implementando programas de gerenciamento e em alguns poucos casos, de tratamento de resíduos. Diferentemente de agentes biológicos, substâncias químicas não possuem um procedimento de degradação que seja eficaz às diferentes classes e é necessário o desenvolvimento de diferentes métodos para diferentes produtos. Este trabalho adaptou métodos degradativos apresentados na literatura à três substâncias, escolhidas por sua toxicidade e pelo volume gerado anualmente das mesmas: brometo de etídeo (BE), formaldeído e fenol. A degradação do BE foi monitorada por fluorescência e pela concentração de Carbono Orgânico Total (COT), como BE é mutagênico seu produto de degradação foi submetido ao teste de mutação gênica com Salmonella thiphimurium (teste de Ames) utilizando as linhagens TA97a, TA98 e TA100, para avaliar se havia perdido esta característica. Observou-se que embora todos os tratamentos apresentassem a mesma resposta quanto a fluorescência, o ensaio mutagênico mostrou que apenas dois procedimentos poderiam ser realmente empregados. Os demais resíduos (fenol e formaldeído) tiveram seus produtos de degradação avaliados por COT e segundo as premissas da legislação estadual para efluentes em ambos os casos os resíduos apresentaram uma boa redução da carga orgânica. A toxicidade dos produtos formados foi avaliada por testes ecotoxicológicos (Daphna magna) e como todo formaldeído e fenol foram oxidados essa propriedade foi efetivamente eliminada. / Hazardous substances often have been used in university teaching and researching laboratories as well. Few years ago there was not the concern about the destiny of these substances after their application. There was the wrong concept as the university use a few quantities of different kind of products, the behavior of these products in the environment were insignificant. Fortunately, nowadays the context has changed and the universities have established management programs of waste treatment. Distinctly of biological agents, chemicals substances do not have a model is better (or pattern) of destruction efficient to so many categories or types. So it is necessary the development of different methods for different products. This present work adjusted degradative methods presented on the literature for three different substances, chosen by their toxicity and quantity yearly storage: ethidium bromide (EB); formaldehyde and phenol. The degradation of EB was observed by fluorescence and by total carbon organic concentration, as BE is mutagenic, its degradation product was submitted to mutagenicity test with Salmonella thiphimurium (Ames test) using TA97a, TA98 and TA100, for evaluate original characteristics. The obtained data shown that although all of treatments presented the same answer for the fluorescence, the mutagenic assay has shown that just two methods could be efficiently used. The another products (phenol and formaldehyde) have had yours degradatives products evaluated by TOC according the supposition from the state legislation for wastewater, in both cases the results data shown reduction organic The toxicity of products in this case were evaluated by ecotoxicological tests (Daphnia magna), as all formaldehyde and phenol have been oxidized the toxicity was banished. Even tough the results obtained shown that methods are simple and could be applied for own creators in situ, just follow the methods shown in these work.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

Brain stem remyelination following demyelination induced by ethidium bromide (EB) is carried out by oligodendrocytes and Schwann cells that invade the central nervous system when astrocytes are lost. Although oligodendrocyte remyelination is detected from 13 days onward within the lesions, the origin of the remyelinating cells is not known. To clarify oligodendrocyte origin as well as to observe astrocytic behaviour in normal (n=22) as well as immunosuppressed animals (n=22) adult Wistar rats were injected with EB in the basal cisterna. Wistar rats had an EB injection while treated with cyclophosphamide (astrocyte investigation, n=12) or cyclosporine A (oligodendrocyte study, n=10). Control animals had a single injection of 10 μl of 0.9% saline (n=16). For the investigation on astrocytes, the rats were killed at 1, 2, 3, 7, 14 and 21 days a.i. GFAP labelled astrocytes were conspicuous within the lesions and isomorphic gliosis was detected, more marked in those rats immunosuppressed with CY. Nonetheless a significant difference among the groups could not be established because of the mean deviations detected by the image studies. For the oligodendrocyte investigation the rats were killed at 15, 21 and 31 days a.i. Lesions of EB injected in normal and cyclosporine A-treated Wistar rats labelled positive for OSP (oligodendrocytes specific protein). This result points to mature oligodendrocytes as a source of remyelinating cells to restore the lost myelin sheaths after EB injection. The EB model of demyelination allowed the observation of the neuroglia in lesions where remyelination is made up by mature cells of the oligodendroglial lineage and where astrocytes respond selectively to immunosuppressive drugs that modify the inflammatory reaction induced by EB / Remielinização após desmielinização com brometo de etídio (BE) no tronco encefálico de ratos é realizada por oligodendrócitos e células de Schwann que invadem o tecido após a morte dos astrócitos. Embora a remielinização por oligodendrócitos seja detectada a partir dos 13 dias pós-intoxicação, a origem das células remielinizantes não é conhecida. Para esclarecer essa origem bem como o comportamento astrocitário em lesões induzidas pelo BE em ratos adultos normais (n=22) ou sob terapia imunomoduladora (n=22), ratos Wistar adultos receberam uma injeção de 10 μl de BE na cisterna basal. Ratos Wistar receberam a injeção de BE enquanto sob terapia imunossupressora com ciclofosfamida (estudo astrocitário) (n=12) ou ciclosporina-A (n=10) (estudo da oligodendróglia). Os animais controle receberam uma injeção de 10 μl 0.9% de solução salina (n=16). Para o estudo astrocitário, os animais foram sacrificados aos 1, 2, 3, 7, 14 e 21 dias pós-injeção de BE. Astrócitos foram marcados com GFAP (proteína glial fibrilar ácida) e foi detectada gliose isomórfica nas lesões, mais marcada naqueles animais tratados com ciclofosfamida (CY). Embora existisse diferença entre a marcação por GFAP nos ratos que receberam somente BE e os que receberam BE e CY, os desvios das médias obtidas através da análise de imagem, não permitiram uma conclusão sobre a significância dessa diferença. Os ratos do experimento sobre a oligodendróglia foram sacrificados aos 15, 21 e 31 dias p.i. do BE. Tecidos de ratos normais injetados com BE e ratos injetados e tratados com ciclosporina foram marcados com imunofluorescência (IF) para OSP (proteína específica do oligodendrócito) que marca células maduras da linhagem oligodendroglial. O resultado foi a marcação de células maduras que remielinizavam em áreas próximas ao tecido normal, mostrando oligodendrócitos maduros como fonte celular na reparação das bainhas perdidas. O modelo de desmielinização do BE permitiu estudar a atividade da neuróglia em lesões que foram remielinizadas por oligodendrócitos maduros e nas que os astrócitos responderam seletivamente a imunossupressores que interferem com a reação inflamatória dentro do tecido

The Epstein Barr virus (EBV) is studied in this project to establish a latency compared with the infected organism and to a number of pathophysiologies. Its oncogenic potential associated with serological evidence of the presence of the viral agent for cancer and also for autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and lupus erythematosus. Detection processes are necessary and have attracted scientific interest in recent decades, and they are important analytical tools used for clinical diagnosis, disease control, physiological changes, among others. Through the above two genosensors were developed to the specific recognition of EBV by electrochemistry. The peak oxidation of ethidium bromide (EB) in graphite electrodes modified with poly (4-ATP) and the peak tetramethylbenzindine (TMB) reduction, as a new indicator of hybridization oligonucleides, in graphite electrodes modified with poly (AP-4) were designed and evaluated these platforms. Analysis of Surface Plasmon Resonance (SPR) and Atomic Force Microscopy (AFM) were used to complement the study to theoretical and practical application. The prospect of this project is the application in the diagnosis of infection caused by the Epstein-Barr virus (in serum samples, saliva and urine) non-invasively in rapid tests evaluating their sensitivity, selectivity, specificity, speed and low cost. / O vírus Epstein Barr (EBV) é estudado neste projeto por estabelecer uma relação de latência com o organismo infectado e a uma série de fisiopatologias. Seu potencial oncogênico está relacionado às evidências sorológicas da presença do agente viral em neoplasias e também às doenças autoimunes como a Artrite Reumatoide e o Lúpus Eritematoso. Processos de detecção são necessários e têm despertado interesse científico nas últimas décadas, sendo importantes ferramentas analíticas usadas para diagnóstico clínico, controle de doenças, alterações fisiológicas, dentre outras. Mediante o exposto, dois genossensores foram desenvolvidos visando o reconhecimento específico do EBV pela eletroquímica. O pico de oxidação do brometo de etídio nos eletrodos de grafite modificados com poli(4-ATF) e o pico de redução de tetrametilbenzindina, como novo indicador de hibridização de oligonucleotídeos, nos eletrodos de grafite modificados com poli(4-AF) foram projetados e avaliados nestas plataformas. Análises de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) e Microscopia de Força Atômica (AFM) foram utilizadas para complementar o estudo a fim de fundamentação teórica e prática. A perspectiva deste projeto é a aplicação no diagnóstico da infecção causada pelo vírus Epstein-Barr (em amostras de soro, saliva e urina) de forma não invasiva em testes rápidos avaliando sua sensibilidade, seletividade, especificidade, rapidez e de baixo custo. / Doutor em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Light and ultraestructural changes of central and peripheral nervous system lesions in mice KO for connexin-32 and submitted to the ethidium bromide gliotoxic demyelinating model are described. Their KO condition was tested with PCR and a negative connexin-32 labelling was performed by immunofluorescence. The experimental animals were C57BL/6 normal mice and C57BL/6 KO for connexin-32. For all groups the animals were maintained in cages of 5 individuals within a temperature controlled room and had ration and filtered water ad libitum. A single local injection of either 0,1% ethidium bromide in normal saline (5 μl in the brainstem and 1 μl in the sciatic nerve) or normal saline was performed as described for Wistar rats. The injected mice were observed daily until euthanasia was performed at 24, 48 hours and 3, 7, 15, 21 and 30 days after injection. The mice were perfused through the heart with either neutral 10% formalin or 2,5% glutaraldehyde. Histochemical, immunohistochemical, immunofluorescence and transmission electron microscopic methods were used to analyze the development of the lesions after differentiated processing. Hematoxylin- eosine, luxol fast blue and toluidine blue methods and immunolabelling with anti-GFAP, anti-CNPase, anti-S100 protein and anti-OSP, anti Cx32 and anti Cx43 antibodies were used. Within the CNS the lesions showed an acute degenerative phase with disappearance of glial cells, and myelin sheaths were withdrawn by a scant number of macrophages. In KO mice some granulocytes were detected within the lesions in tight contact with decaying myelin sheaths. Remyelination was carried out by oligodendrocytes since no Schwann cells were seen during the regenerating process of KO mice. Occasional remyelinating Scwann cells were seen in normal mice. For the sciatic nerves, Schwann cells initially showed signs of intoxication and rejected their sheaths; after seven days, some thin newly formed myelin sheaths with uneven compaction and redundant loops (tomacula) were conspicuous. Mast cells degranulated or not were seen in all BE- induced lesions and after saline injection. It is concluded that the repair of the CNS demyelinated lesions differs from the observed in normal and immunosupressed rats because Schwann cells remyelination was absent; the absence of connexin-32 may have caused that absence. The regeneration of lost myelin sheaths within the PNS followed the pattern already reported for this model in other species. It is suggested that the absence of connexin-32 determined the different repair of the myelin sheaths within the CNS whereas for the PNS, the normal pattern of tissue response might be due to the early age of the injected mice. / São descritas as alterações de microscopia de luz e ultra-estruturais induzidas pelo brometo de etídio no sistema nervoso central e periférico de camundongos KO para conexina 32. O genótipo KO foi testado por PCR e confirmado por imunofluorescência negativa para conexina 32. Os animais dos experimentos foram camundongos C57BL-6 normais (controles) e KO para conexina 32. Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas de 5 indivíduos em sala climatizada e receberam ração e água à vontade. Uma única injeção de BE 0,1% em salina 0,9% ou de salina 0,9% (5 μl na cisterna basal e 1μl no nervo ciático) foi realizada como descrita em ratos Wistar. Os camundongos eram observados diariamente até ser realizada a eutanásia às 24 e 48 h, 3, 7, 15, 21 e 30 dias após a injeção. Os camundongos foram perfundidos através do coração; um grupo com glutaraldeído 2,5% visando o processamento para microscopia eletrônica; um outro grupo com solução salina com EDTA e posterior fixação em metacarn para inclusão em parafina. As amostras incluídas em parafina foram analisadas através dos métodos de hematoxilina e eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Foram realizadas imunoistoquímica e imunofluorescência visando a marcação de GFAP, CNPase, OSP, S100, e Cx43 e Cx32, respectivamente. As lesões do SNC eram discretas e tiveram uma fase ativa com desaparecimento das células gliais; os debris celulares e de mielina foram retirados por um reduzido número de fagócitos. Nos camundongos KO foram vistos granulócitos em estreito contato com bainhas de mielina em degradação. A remielinização dos axônios desmielinizados foi realizada exclusivamente por oligodendrócitos nos camundongos KO; nos camundongos normais, ocasionais células de Schwann podiam ser encontradas remielinizando axônios do SNC. No nervo ciático, as células de Schwann intoxicadas rejeitaram seus internodos de mielina; após sete dias, finas bainhas reparadas eram encontradas, com compactação irregular da mielina e alças redundantes (tomacula). Mastócitos, desgranulados ou não, eram vistos nas lesões do BE e após a injeção de solução salina. Conclui-se que o reparo das lesões do SNC difere do observado em ratos normais e imunossuprimidos devido à ausência de remielinização por células de Schwann; a falta de expressão da Cx 32 e o tamanho reduzido das lesões podem ter contribuído para essa ausência. A regeneração das bainhas perdidas no SNP obedeceu ao padrão descrito para esse modelo em outras espécies. Sugere-se que a ausência da Cx 32 não afetou o reparo do SNP devido à idade precoce dos animais.