Une caractéristique essentielle du mécanisme catalytique des ALDH est l'importance de la flexibilité et de la dynamique conformationnelle dans le site actif, incluant les chaînes latérales de résidus, le substrat, et le cofacteur. Ma thèse a permis d'identifier des bases responsables de la reconnaissance du rétinal contrôlant la biosynthèse de l'acide rétinoïque dans les RALDH. J'ai ensuite pu suivre le basculement du cofacteur réduit en utilisant le FRET, ce qui m'a permis d'établir un modèle cinétique pour déterminer la constante de vitesse associée à cette étape. Enfin, les résultats obtenus pour identifier les bases moléculaires responsables de la dissociation tardive ou précoce du cofacteur réduit ont montré que le mode de stabilisation du cofacteur est à l'origine de cette différence entre ces deux familles d'enzymes / An essential feature of the catalytic mechanism of ALDH is the importance of flexibility and conformational dynamics in the active site, including the side chains of residues, substrate and cofactor. My thesis has identified bases responsible for the recognition of retinal controlling biosynthesis of retinoic acid in RALDH. I was then able to follow the flip of the cofactor reduced by using FRET, which allowed me to develop a kinetic model to determine the rate constant associated. Finally, the results obtained to identify the molecular basis responsible for late or early dissociation of the reduced cofactor showed that the mode of stabilization of the cofactor is the origin of this difference between these two families of enzymes

Deux familles d'aldéhyde déshydrogénases (ALDH) phylogénétiquement et structuralement distinctes catalysent l'oxydation des aldéhydes : les ALDH phosphorylantes et les ALDH non phosphorylantes. Ces enzymes jouent un rôle essentiel au niveau cellulaire en intervenant au niveau du métabolisme et dans des processus de détoxication. En 2003, la résolution de la structure tridimensionnelle de l'enzyme bifonctionnelle 4-hydroxy-2-cétovalérate aldolase/acétaldéhyde déshydrogénase (DmpFG) de Pseudomonas sp. CF600 a permis l'identification d'une nouvelle famille d'ALDH : la sous-unité DmpF étant structuralement apparentée aux ALDH phosphorylantes alors qu'elle présente une activité de type non phosphorylante CoA-dépendante. Par la caractérisation enzymatique et structurale des orthologues MhpEF issus d'Escherichia coli et de Thermomonospora curvata, nos travaux montrent que les paramètres cinétiques de MhpF ne dépendent pas de son état oligomérique, ce qui est cas unique pour les ALDH. De plus, la résolution des structures cristallographiques de l'enzyme complexée avec du NAD+ ou du CoA, couplée à la structure en solution de la forme apoenzyme obtenue par SAXS montrent que le Rossmann fold s'accomode de la présence des cofacteurs par un vaste changement conformationnel. Enfin, l'étude du mécanisme catalytique et la résolution de la structure thioacylenzyme permettent d'identifierla MhpF comme étant un hybride des deux familles d'ALDH caractérisées jusqu'à présent / Two phylogenetically and structurally unrelated families of NAD(P)-dependent aldehyde dehydrogenases (ALDH) catalyze the oxidation of aldehydes into activated or non-activated acids. These enzymes are known to be involved in many biological functions such as cellular differentiation, central metabolism, or detoxification pathways. The crystal structure of the bifunctional enzyme, 4-hydroxy-2-ketovalerate aldolase (DmpG)/acetaldehyde dehydrogenase (DpmF) from Pseudomonas sp. CF600, leads to the identification of a new ALDH family. The DmpF subunit exhibits a non-phosphorylating CoA-dependent aldehyde dehydrogenase activity while its structure belongs to the phosphorylating ALDH superfamily. The kinetics of the MhpEF orthologs from Escherichia coli and Thermomonospora curvata show that the kinetic parameters of MhpF do not depend of its oligomeric state, which is unique for an ALDH. In addition, the crystal structures of the enzyme with NAD+ or CoA, as well as the solution structure of the apoenzyme using SAXS, reveal the dynamics of the overall Rossmann fold between apo or cofactors-bound conformers, which is necessary to carry on the catalytic cycle. Finally, the catalytic mechanism and the structure of the thioacylenzyme intermediates indicate that MhpF is a hybrid between both ALDH families characterized to date

Les cellules souches cancéreuses (CSC) représentent une sous-population de cellules tumorales à l’origine de l’hétérogénéité et de la croissance tumorale. Les CSC sont plus résistantes aux traitements, et à l’origine de la rechute et des métastases. L’identification des CSC constitue actuellement un enjeu majeur dans le développement de nouvelles thérapies ciblées pour inhiber la croissance tumorale et éradiquer le cancer. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier, caractériser, et cibler les CSC dans l’adénocarcinome gastrique. Des modèles murins de xénogreffe de tumeurs primaires de patients atteints d'adénocarcinome gastrique hors cardia de types intestinal et diffus ont été développés, ainsi qu’un modèle de tumorsphere in vitro afin d’évaluer les capacités tumorigéniques de sous-populations tumorales. Nous avons identifié CD44 et l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) comme marqueurs d’enrichissement des CSC dans les 2 types d’adénocarcinomes gastriques, l’ALDH représentant un marqueur plus spécifique que CD44. Nous avons ensuite étudié l'effet de l’acide rétinoïque tout trans (ATRA), et nous avons montré que l'ATRA inhibe la formation et la croissance des tumorspheres in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Cet effet de l’ATRA passe par l’inhibition de l’expression des marqueurs souches et des capacités d'auto-renouvèlement des CSC. En conclusion, CD44 et ALDH sont des marqueurs de CSC dans les adénocarcinomes gastriques hors cardia de types intestinal et diffus, et le traitement par l’ATRA constituerait une stratégie commune de traitement pour cibler spécifiquement les CSC et inhiber la croissance tumorale dans ces deux types de cancer gastrique. / Cancer stem cells (CSCs) are a subpopulation of tumor cells at the origin of the heterogeneity and growth of tumors. CSCs are more resistant to treatment, and are responsible for relapse and metastasis. The identification of CSCs is a major challenge for the development of new targeted therapies to inhibit tumor growth and eradicate cancer. In this work, we aimed to identify, characterize, and target CSCs in gastric adenocarcinoma. Mouse models of primary tumor xenografts from intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas from patients were developed, as well as an in vitro tumorsphere assay, to assess the tumorigenic capacity of subpopulations of tumor cells. We identified CD44 and aldehyde dehydrogenase (ALDH) as CSC enrichment markers in the two types of gastric adenocarcinoma, ALDH representing a more specific marker than CD44. We then studied the effect of All-trans retinoic acid (ATRA), and showed that it inhibited the formation and growth of tumorspheres in vitro and tumor growth in vivo. This effect of ATRA is due to the inhibition of stem marker expression and the self-renewal capacity of CSCs. In conclusion, CD44 and ALDH are effective CSC markers in intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas, and treatment with ATRA provides a common treatment strategy to specifically target CSCs and inhibit tumor growth in both subtypes of this gastric cancer.

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo. / SUMMARY Retinal dehydrogenases (RALDHs) catalyze the dehydrogenation of retinal into retinoic acids (RA) that are required for embryogenesis and tissue differentiation. This study sought to determine the detailed kinetic properties of 2 mouse RALDHs, namely RALDH3 and 4, for retinal isomer substrates, to better define their specificities in RA isomer synthesis. RALDH3 and 4 were expressed as His-tagged proteins and affinity-purified. RALDH3 oxidized all-trans retinal with high catalytic efficiency but did not show activity for either 9-cis or 13-cis retinal substrates. RALDH4 was inactive for all-trans retinal substrate, exhibited high activity for 9-cis retinal oxidation, and oxidized 13-cis retinal with lower catalytic efficiency. β-ionone, a potent inhibitor of RALDH4 activity, suppressed 9-cis and 13-cis retinal oxidation competitively, but had no effect on RALDH3 activity. The p-HMB inhibited the activity for both RALDH3 and RALDH4. The divalent cation MgCl2 activated 13-cis retinal oxidation by RALDH4 by 3-fold, slightly decreased 9-cis retinal oxidation, and did not significantly influence RALDH3 activity. These data extend the kinetic characterization of RALDH3 and 4, providing their specificities for retinal isomer substrates, which should help in determining their functions in the synthesis of RAs in specific tissues.

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo. / SUMMARY Retinal dehydrogenases (RALDHs) catalyze the dehydrogenation of retinal into retinoic acids (RA) that are required for embryogenesis and tissue differentiation. This study sought to determine the detailed kinetic properties of 2 mouse RALDHs, namely RALDH3 and 4, for retinal isomer substrates, to better define their specificities in RA isomer synthesis. RALDH3 and 4 were expressed as His-tagged proteins and affinity-purified. RALDH3 oxidized all-trans retinal with high catalytic efficiency but did not show activity for either 9-cis or 13-cis retinal substrates. RALDH4 was inactive for all-trans retinal substrate, exhibited high activity for 9-cis retinal oxidation, and oxidized 13-cis retinal with lower catalytic efficiency. β-ionone, a potent inhibitor of RALDH4 activity, suppressed 9-cis and 13-cis retinal oxidation competitively, but had no effect on RALDH3 activity. The p-HMB inhibited the activity for both RALDH3 and RALDH4. The divalent cation MgCl2 activated 13-cis retinal oxidation by RALDH4 by 3-fold, slightly decreased 9-cis retinal oxidation, and did not significantly influence RALDH3 activity. These data extend the kinetic characterization of RALDH3 and 4, providing their specificities for retinal isomer substrates, which should help in determining their functions in the synthesis of RAs in specific tissues.