’impact de plusieurs éléments traces métalliques (ETMs) (plomb, zinc, cuivre ou cadmium) sur la croissance de deux espèces phytoplanctoniques marines, la diatomée Skeletonema costatum et le dinoflagellé toxique Alexandrium catenella, a été étudié à partir de cultures réalisées en conditions physiologiques et en conditions contaminantes. Les résultats obtenus ont révélé des perturbations de croissance chez S. costatum et chez A. catenella, lorsque ces espèces étaient exposées à de fortes concentrations métalliques. Les effets létaux se manifestaient par une forte mortalité cellulaire, accompagnée, chez A. catenella, par la conversion d’un certain nombre de cellules végétatives en kystes de résistance. Puis, l’exsudation de la matière organique dissoute (MOD) par S. costatum et par A. catenella en réponse aux stress métalliques, a été caractérisée. L’exsudation du carbone organique dissous (COD) variait en fonction de la phase de croissance, et était associée au niveau de contamination métallique, et à la nature du métal testé. Les valeurs maximales de COD exsudé par cellule étaient mesurées en réponse à la contamination par le cuivre 16 µM pendant la phase d’adaptation, et en réponse à la contamination par le cadmium 200 µM pendant la phase exponentielle de la croissance. Plus spécifiquement, la matière organique dissoute fluorescente (FDOM) exsudée par S. costatum et par A. catenella a été analysée par spectroscopie de fluorescence 3D associée à l’algorithme PARAFAC. Les traitements PARAFAC révélaient quatre composantes, lesquelles étaient attribuées à deux contributions principales, l’une liée à l’activité biologique de l’espèce, l’autre liée à la décomposition de la matière organique. Les composantes C1 et C2 étaient combinées à des pics tryptophaniques et à des substances humiques, tandis que les composantes C3 et C4 étaient associées à la production de matière organique marine. Par ailleurs, le glucose et le galactose étaient prédominants parmi les aldoses constituant les polysaccharides exsudés dans la MOD. De plus, des modifications protéomiques étaient observées dans les protéomes d’A. catenella, en réponse aux divers stress métalliques. Les protéines de stress exprimées par A. catenella étaient mises en évidence par comparaison des profils d’expression protéiques (PEPs) obtenus par électrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D), en conditions physiologiques et en conditions contaminantes. Les protéines de stress étaient impliquées dans de nombreuses catégories fonctionnelles : réponse au stress oxydatif (superoxyde dismutase, sous – unités du protéasome), photosynthèse (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase, complexe péridinine chlorophylle – protéine, ferrédoxine-NADP réductase), métabolisme des carbohydrates (triosephosphate isomérase, ribose 5-phosphate isomérase, malate déshydrogénase, photorespiration et métabolisme du phosphore (phosphoglycolate phosphatase), métabolisme énergétique (ATP – synthase), signal cellulaire (calmoduline), activité chaperonne (HSP 70, HSP 90) et bioluminescence d’A. catenella (luciférine – binding protéine). La sur – expression de la phosphoglycolate phosphatase (PGP) et celle de l’ATP – synthase, observées en réponse à la contamination par le plomb, pourraient participer à une stratégie de défense mise en place par A. catenella afin (i) de se protéger du stress oxydatif lié à la contamination métallique, la PGP étant impliquée dans la dissipation de l’excès d’énergie (ii) de produire davantage de réserves énergétiques (ATP) et ainsi de répondre à des besoins accrus en raison du stress métallique, dans le but de s’y adapter. / Mpact of several trace metals (lead, zinc, copper or cadmium) on the growth of two marine phytoplankton species: the diatom Skeletonema costatum and the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella, has been studied from cultures grown under physiological and contaminated conditions. The results obtained revealed growth perturbations in S. costatum and in A. catenella, when these species were exposed to high metal concentrations. The lethal effects appeared through a strong cell death, coming, in A. catenella, with the conversion of vegetative cells into resistance cysts. Then, exudation of dissolved organic matter (DOM) by S. costatum and by A. catenella in response to metal stress has been characterized. Exudation of dissolved organic carbon (DOC) varied according to the growth phase, and was associated with the level of metal contamination and the nature of the tested metal. The maximal values ​​of DOC exudated per cell were measured in response to contamination by copper 16 µM during the adaptation phase, and in response to contamination by cadmium 200 µM during the exponential phase of growth. More specifically, the fluorescent dissolved organic matter (FDOM) exudated by S. costatum and by A. catenella has been analyzed by 3D fluorescence spectroscopy combined with PARAFAC algorithm. The PARAFAC treatments revealed four components, which were attributed to two main contributions, one related to the biological activity of the species, and the other related to the decomposition of organic matter. The C1 and C2 components were combined with tryptophan peaks and with humic substances, while the C3 and C4 components were generally associated with the production of marine organic matter. Moreover, glucose and galactose were the main aldoses among the polysaccharides exudated in the DOM. Proteomic changes occurred in the proteomes of A. catenella in response to the various metal stresses. Stress proteins expressed by A. catenella were obtained by comparison of the protein expression profiles (PEPs) achieved by two-dimensional electrophoresis (2D - electrophoresis) under physiological and contaminated conditions. Stress proteins are involved in many functional categories: response to oxidative stress (superoxide dismutase, proteasome sub - units), photosynthesis (ribulose 1,5- bisphosphate carboxylase, peridinin chlorophyll protein complex, ferredoxin -NADP reductase), carbohydrate metabolism (triosephosphate isomerase, ribose 5-phosphate isomerase, malate dehydrogenase), photorespiration and phosphorus metabolism (phosphoglycolate phosphatase), energy metabolism (ATP - synthase), cell signalling (calmodulin), chaperone activity (HSP 70, HSP 90) and bioluminescence of A. catenella (luciferin - binding protein). Over - expression of phosphoglycolate phosphatase (PGP) and of ATP – synthase, occurring in response to metal contamination by lead, could represent a strategy of defence set up by A. catenella (i) to protect itself from the oxidative stress due to metal contamination, PGP being involved in the dissipation of excess energy (ii) to produce more reserves of energy (ATP) so as to satisfy the increased requirements resulting from the metal stress, in order to adapt to it.

En France, les sites ostréicoles de la méditerranée sont confrontés régulièrement à de fortes mortalités de juvéniles de Crassostrea gigas mais également à des efflorescences récurrentes du dinoflagellé producteur de toxines paralysantes (PSTs), Alexandrium catenella. Parmi les pathogènes associés de manière récurrente à ces mortalités, on retrouve des souches de Vibrio appartenant au clade Splendidus. Nous nous intéressons ici aux interactions entre A. catenella et l’huître C. gigas confrontée à des vibrios pathogènes. Dans une première partie, nous avons montré qu'en conditions expérimentales contrôlées, A. catenella augmentait la sensibilité de l’huître C. gigas au pathogène Vibrio tasmaniensis LGP32. In situ, nous avons également constaté la coïncidence entre la mortalité des huîtres en 2014 et la présence des PSTs dans leurs tissus. Dans une seconde partie, nous avons étudié les interactions entre les PSTs produites par A. catenella et les cellules immunitaires de l’huître, les hémocytes. Un résultat important de cette thèse a été de montrer que la saxitoxine, une des toxines produites par A. catenella, se lie à des structures granulaires présentes dans le cytoplasme des hémocytes de C. gigas et induit une mort hémocytaire caspases-dépendante. Cette mort est indépendante de la production d’espèces réactives de l’oxygène. Nous avons également démontré que la toxine majoritaire des cellules d’A. catenella, la gonyautoxine 5, est la plus toxique sur les hémocytes de C. gigas. Parmi les populations hémocytaires touchées, les hyalinocytes sont très sensibles à ce stress toxique. Les hémocytes étant les cellules immunocompétentes de l’huître qui jouent le rôle central dans la défense contre les infections, nous supposons que leur mort cellulaire induite par les PSTs affecte négativement la défense des mollusques bivalves et explique l'augmentation de la susceptibilité des huîtres à l'infection par Vibrio tasmaniensis LGP32 quand elles sont exposées à A. catenella. / In France, oyster sites in the Mediterranean Sea are regularly confronted to high mortalities of Crassostrea gigas juveniles and to recurrent blooms of the dinoflagellate producer of Paralytic Shellfish Toxins (PSTs), Alexandrium catenella. Among the pathogens associated to these mortalities, we found Vibrio strains belonging to Splendidus clade. We here focus on the interactions between A. catenella and the oyster C. gigas challenged with pathogenic vibrios. In the first part of this work, we have shown that, in vivo, A. catenella increased the susceptibility of the oyster C. gigas to the pathogen Vibrio tasmaniensis LGP32. In situ, we also established the coincidence between oyster mortality in 2014 and the presence of PSTs in their tissues. In the second part of this work, we studied the interactions between the PSTs produced by A. catenella and oyster immune cells, the hemocytes. An important result of this thesis was that saxitoxin, a toxin produced by A. catenella, binds to granular structures in the cytoplasm of C. gigas hemocytes and induces their caspase-dependent cell death. This death is independent of the production of reactive oxygen species. We also demonstrated that the major toxin of A. catenella cells, the gonyautoxin 5, is the most toxic on C. gigas hemocytes. Among affected hemocyte populations, the hyalinocytes are very sensitive to this toxic stress. As hemocytes are oyster immunocompetent cells and therefore play the central role in the defense against infections, we can presume that their cell death induced by the PSTs negatively affects the defense of bivalve mollusks and explains the increased susceptibility of oysters to the infection by Vibrio tasmaniensis LGP32 when exposed to A. catenella.

Thesis: Ph. D., Massachusetts Institute of Technology, Department of Biology, 2017. / Thesis: Ph. D., Joint Program in Oceanography/Applied Ocean Science and Engineering (Massachusetts Institute of Technology, Department of Biology; and the Woods Hole Oceanographic Institution), 2017. / Cataloged from PDF version of thesis. / Includes bibliographical references. / Blooms of the dinoflagellate Alexandrium catenella cause paralytic shellfish poisoning syndrome and present an expanding public health threat. They are inoculated through the germination of benthic cysts, a process regulated by internal and environmental factors, most importantly temperature. Less understood is the effect of temperature conditioning on cyst dormancy cycling, which inhibits germination for long periods. This thesis characterizes the temperature-dependence of both dormancy and germination in natural A. catenella cyst populations from Nauset Marsh (Cape Cod, MA, USA), a small estuarine embayment, and relates these processes to the phenology of blooms there. Through laboratory germination assays, it is shown that dormant A. catenella cysts require a quantifiable amount of chilling to exit dormancy and attain quiescence (i.e. become germinable). A series of experiments compares germination rates of quiescent cysts across a range of temperatures through laboratory experiments and field incubations of raw sediment using plankton emergence traps (PETs). Emergence rates of A. catenella germlings measured by PETs increased linearly with temperature and were comparable to germination under constant laboratory conditions. Total emergence fluxes were much lower than expected, suggesting that germination occurs in a much shallower layer of sediments than typically assumed. The results are synthesized to develop a temperature-dependent model to examine the sensitivity of A. catenella bloom phenology to dormancy-breaking by winter chilling. Notably, the chilling-alleviated dormancy model accurately predicted the timing of quiescence (January) and the variable bloom phenology from multiple blooms in Nauset. Once cysts became quiescent and began to germinate, however, temperatures were typically too cold for growth to exceed losses so there was a several-week lag until bloom development. Years with warmer winters and springs had shorter lag periods and thus significantly earlier blooms. Ecologically, dormancy-breaking by a chilling threshold is advantageous because it prevents the mismatch between conditions that are favorable for germination but not for the formation of large blooms. Synchronized germination after winter chilling also promotes promotes efficient conversion from the cyst seedbed to the spring bloom inoculum. The dormancy mechanism characterized here may be present in other cyst-forming dinoflagellates, but there is likely plasticity that reflects the temperature regime of each habitat. / by Alexis Dal Fischer. / Ph. D.

'impact de plusieurs éléments traces métalliques (ETMs) (plomb, zinc, cuivre ou cadmium) sur la croissance de deux espèces phytoplanctoniques marines, la diatomée Skeletonema costatum et le dinoflagellé toxique Alexandrium catenella, a été étudié à partir de cultures réalisées en conditions physiologiques et en conditions contaminantes. Les résultats obtenus ont révélé des perturbations de croissance chez S. costatum et chez A. catenella, lorsque ces espèces étaient exposées à de fortes concentrations métalliques. Les effets létaux se manifestaient par une forte mortalité cellulaire, accompagnée, chez A. catenella, par la conversion d'un certain nombre de cellules végétatives en kystes de résistance. Puis, l'exsudation de la matière organique dissoute (MOD) par S. costatum et par A. catenella en réponse aux stress métalliques, a été caractérisée. L'exsudation du carbone organique dissous (COD) variait en fonction de la phase de croissance, et était associée au niveau de contamination métallique, et à la nature du métal testé. Les valeurs maximales de COD exsudé par cellule étaient mesurées en réponse à la contamination par le cuivre 16 µM pendant la phase d'adaptation, et en réponse à la contamination par le cadmium 200 µM pendant la phase exponentielle de la croissance. Plus spécifiquement, la matière organique dissoute fluorescente (FDOM) exsudée par S. costatum et par A. catenella a été analysée par spectroscopie de fluorescence 3D associée à l'algorithme PARAFAC. Les traitements PARAFAC révélaient quatre composantes, lesquelles étaient attribuées à deux contributions principales, l'une liée à l'activité biologique de l'espèce, l'autre liée à la décomposition de la matière organique. Les composantes C1 et C2 étaient combinées à des pics tryptophaniques et à des substances humiques, tandis que les composantes C3 et C4 étaient associées à la production de matière organique marine. Par ailleurs, le glucose et le galactose étaient prédominants parmi les aldoses constituant les polysaccharides exsudés dans la MOD. De plus, des modifications protéomiques étaient observées dans les protéomes d'A. catenella, en réponse aux divers stress métalliques. Les protéines de stress exprimées par A. catenella étaient mises en évidence par comparaison des profils d'expression protéiques (PEPs) obtenus par électrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D), en conditions physiologiques et en conditions contaminantes. Les protéines de stress étaient impliquées dans de nombreuses catégories fonctionnelles : réponse au stress oxydatif (superoxyde dismutase, sous - unités du protéasome), photosynthèse (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase, complexe péridinine chlorophylle - protéine, ferrédoxine-NADP réductase), métabolisme des carbohydrates (triosephosphate isomérase, ribose 5-phosphate isomérase, malate déshydrogénase, photorespiration et métabolisme du phosphore (phosphoglycolate phosphatase), métabolisme énergétique (ATP - synthase), signal cellulaire (calmoduline), activité chaperonne (HSP 70, HSP 90) et bioluminescence d'A. catenella (luciférine - binding protéine). La sur - expression de la phosphoglycolate phosphatase (PGP) et celle de l'ATP - synthase, observées en réponse à la contamination par le plomb, pourraient participer à une stratégie de défense mise en place par A. catenella afin (i) de se protéger du stress oxydatif lié à la contamination métallique, la PGP étant impliquée dans la dissipation de l'excès d'énergie (ii) de produire davantage de réserves énergétiques (ATP) et ainsi de répondre à des besoins accrus en raison du stress métallique, dans le but de s'y adapter.