Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-13T13:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1444484 bytes, checksum: b30acd53edaeef546b799098f956c6a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1444484 bytes, checksum: b30acd53edaeef546b799098f956c6a4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Chlamydomonas reinhardtii (filo Chlorophyta) é um organismo modelo amplamente utilizado para estudos de carência de nitrogênio (N), no intuito de avaliar a acumulação de lipídeos, alterações na bioenergética e a regulação da fotossíntese. As clorófitas podem incorporar N inorgânico e orgânico, e a fonte de N utilizada influencia no padrão de acúmulo de lipídeos. As fontes inorgânicas mais frequentemente disponíveis são amônio (NH 4+ ), nitrato (NO 3- ) e nitrito (NO 2- ); enquanto as fontes orgânicas mais comuns são purinas, ureia e aminoácidos. O uso de ureia por outras clorófitas usualmente promove melhoras no crescimento, na produção de lipídeos e biomassa quando comparado ao NH 4+ . Contudo, para C. reinhardtii faltam informações mais específicas de como o seu metabolismo responde à assimilação de ureia. Assim, neste trabalho estudou-se o metabolismo e o crescimento de C. reinhardtii CC125 em ureia como única fonte nitrogenada, bem como diferentes proporções de ureia combinada com NH 4+ . Alíquotas de C. reinhardtii CC125 foram mantidas em crescimento mixotrófico em meio TAP (Tris- Acetato-Fosfato), sob temperatura de 24±2 ° C, fotoperíodo de 16:8 h (luz: escuro), 90 μmol fótons m -2 s -1 e constante agitação a 110 rpm. Cinco tratamentos foram testados: (i) 100% NH 4+ (0,4 g L -1 NH 4 Cl); (ii) 25% ureia (0,3 g L -1 NH 4 Cl e 0,11 g L -1 ureia); (iii) 50% ureia (0,2 g L -1 NH 4 Cl e 0,21 g L -1 ureia); (iv) 75% ureia (0,1 g L -1 NH 4 Cl e 0,32 g L -1 ureia); e (v) 100% ureia (0,42 g L -1 ureia). Os tratamentos foram avaliados na fase logarítmica (LOG) após 50 h de cultivo e na fase estacionária (STA), após 240 h de crescimento. O número de células, área celular, biomassa livre de cinzas, os conteúdos de clorofila a e b, aminoácidos, amido, proteínas, carboidratos e lipídeos foram determinados nas fases LOG e STA. O perfil metabólico e de ácidos graxos foram determinados na fase STA. O crescimento observado nos meios com ureia foi similar ao 100% NH 4+ , quando comparadas as curvas e os parâmetros de crescimento. O número de células foi superior nos tratamentos com menos ureia, tanto na fase LOG quanto STA. Na fase LOG não houve diferença nos totais de clorofila a e b, aminoácidos e proteínas. Na fase STA os níveis de clorofila total bem como clorofila a foram maiores nos tratamentos 75% e 100% ureia. Os totais de clorofila b e proteínas solúveis totais aumentaram com o aumento de ureia. Os níveis de carboidratos, na fase LOG, foram maiores no tratamento 100% ureia. Na fase STA, os maiores valores obtidos foram dos tratamentos 100% ureia e 100% NH 4+ . O tratamento 100% ureia produziu maior quantidade de lipídeos nas duas fases de crescimento analisadas. A quantificação de açúcares indicou que alguns dissacarídeos aumentaram nos tratamentos com mais de 75% de ureia. Dos 14 ácidos orgânicos quantificados, 11 diminuíram no tratamento com 25% de ureia, assim como muitos aminoácidos. Quatro intermediários do ciclo TCA (citrato, isocitrato, succinato e malato) aumentaram no tratamento 100% ureia. O perfil de ácidos graxos foi modificado pelas concentrações de NH 4+ e ureia em C. reinhardtii: O total de ácidos graxos saturados (ΣSFA) aumentou com o aumento de ureia, porém o total de ácidos graxos monoinsaturados diminuiu com o aumento de ureia. O ácido graxo mais abundante foi o ácido palmítico (C16:0) e apresentou uma tendência ao aumento com o aumento de ureia no meio. A porcentagem de ácido oleico (C18:1 w8) decresceu com o amento de ureia, enquanto as porcentagens do ácido linoleico (C18:2 w6) dobrou nos tratamentos que continha ureia. Logo, nossos dados indicam que quanto maior a disponibilidade de ureia, maiores são as mudanças no metabolismo de Carbono (C) e N, sem, contudo, promover drásticas mudanças no crescimento. Além disso, nossos resultados sugerem que a ureia pode fornecer C adicional para a biossíntese, alterando a razão C:N no meio e promovendo mudanças no total de lipídeos e no perfil de ácidos graxos produzidos. / Chlamydomonas reinhardtii (phylum Chlorophyta) as a model organism for nitrogen (N) starvation studies in order to evaluate lipid accumulation, changes in bioenergetics and the regulation of photosynthesis. Chlorophytes can incorporate N in inorganic or organic form and the source of N influences the accumulation of lipids. The most frequently available inorganic sources are Ammonium (NH 4+ ), Nitrate (NO 3- ) and Nitrite (NO 2- ) and the most common organic sources are purines, urea and amino acids. Use of urea in others chlorophytes usually promotes enhancement in both growth, lipid production and biomass when compared to NH 4+ . However, for C. reinhardtii there is a lack of more specific information on how their metabolism responds to the assimilation of N organic sources. Thus, in this work we studied the metabolism and growth of C. reinhardtii CC125 in urea as the only N source as well as combined with NH 4+ . Aliquots of C. reinhardtii CC125 were maintained in mixotrophic growth in TAP (Tris-Acetate-Phosphate) medium under temperature between 24±2 ° C, photoperiod of 16:8 h (light: dark), 90 μmol photons m -2 s -1 and constant shaking of 110 rpm. Five treatments were carried out: (i) 100% NH 4+ (0,4 g L -1 NH 4 Cl); (ii) 25% urea (0,3 g L -1 NH 4 Cl and 0,11 g L -1 urea); (iii) 50% urea (0,2 g L -1 NH 4 Cl and 0,21 g L -1 urea); (iv) 75% urea (0,1 g L -1 NH 4 Cl and 0,32 g L -1 urea); and (v) 100% urea (0,42 g L -1 urea). The treatments were evaluated in the logarithmic phase (LOG), after 50 hours of growth and in the stationary phase (STA), after 240 hours of growth. The number of cells, cell area, ash-free dry weight, chlorophyll a and b contents, amino acids, starch, proteins, total carbohydrates and lipids were determined at LOG and STA phases. The metabolic profile and fatty acids profile was determined at STA phase. The growth observed in medium with urea was similar to 100% NH 4+ by comparing growth curves and kinetic growth. The number of cells after in LOG and STA phase was higher in treatments with lower percentage of urea. Determination of total chlorophyll a and b, free amino acids and proteins showed no differences between treatments in the LOG phase. At STA phase level of total chlorophyll as well as chlorophyll a were higher in 75 and 100% urea. The levels of chlorophyll b and total soluble proteins increased with increasing urea. The levels of carbohydrates, in the LOG phase, were higher in 100% urea treatment. In the STA phase, the highest values were observed for 100% urea and 100% NH 4+ treatments. 100% urea treatment produced more lipids than other treatments in the two growth phases. Quantification of sugars indicated that disaccharides increased in treatments with more than 75% urea. Out of 14 quantified organic acids, 11 decreased in the treatment with 25% of urea as well many amino acids. Four intermediates of TCA cycle (citrate, isocitrate, succinate and malate) increased in the treatment with 100% urea. The FAMEs profile of C. reinhardtii was altered by concentration of NH 4+ and urea: Total saturated fatty acids (ΣSFA) increase with amount of urea; however, total monounsaturated fatty acids (ΣMUFA) decrease with amount of urea. The most abundant fatty acid observed was palmitic acid (C16:0) which there is a tendency to increased with the amount of urea in the medium. The percentage of oleic acid (C18:1 w8) decreased with amount of urea, while percentages of linoleic acid (C18:2 w6) doubled in treatments containing urea. Thus, our data indicate that higher the availability of urea, higher are the Carbon (C) and N metabolism changes, without, however, promoting drastic changes in growth. In addition, our results suggest that urea might also provide additional C, altering C:N ratio in medium and lead changes in lipids and total fatty acid production and profile.