La presentación de una segunda neoplasia es considerada una complicación tardía, cuya incidencia a nivel internacional está dentro del 2-5 % de los casos oncológicos. Actualmente en nuestro medio, no se cuenta con trabajos sobre la incidencia de ellas, así como de la relación que pueda existir ante el uso de determinados tratamientos, en especial el uso de agentes alquilantes previos. Siendo estos, los más utilizados en nuestro medio para diversos esquemas de tratamiento, se realizó el presente estudio, buscando determinar dicha relación para modificar la dosis administradas y disminuir el riesgo, manteniendo iguales niveles de efectividad terapéutica. El estudio se realizó en el periodo de Enero 1998-Diciembre 2000, en el HNGAI evaluándose 7,205 pacientes oncológicos, de los cuales se encontró 117 casos de segunda neoplasia (el cual representa el 1.62 %) y 9 casos con tres neoplasias. La edad de los pacientes varía de 9 a 89 años, con una mediana de 57 años, siendo 78 mujeres y 39 varones. En relación a la primera neoplasia, se presento en estadíos tempranos I-II (73 %), siendo los sitios primarios más frecuentes: mama en 24 casos, ginecológicos 19 casos y cabeza y cuello 18 casos. La anatomía patológica más frecuente fue carcinomas con 68 casos, t el relación al tratamiento,33 pacientes recibieron quimioterapia de los cuales 26 fueron por agentes alquilantes (ciclofosfamida e ifosfamida en frecuencia), cuya dosis total por superficie corporal promedio fue 3243 mg/ m2. Cabe resaltar que dichos pacientes fueron en su mayoría estadío clínico III-IV. En relación a la segunda neoplasia, se presento en estadíos clínicos tardíos III-IV (48%), siendo los sitios más frecuentes: TGI en 22 casos, Pie en 21 casos, y Ginecológicos en 18 casos. La anatomía patológica fue Carcinomas con 53 pacientes. El periodo intergenésico entre ambas neoplasias fue de 53 meses y su periodo libre de enfermedad fue de 74.6 meses. Si relacionamos ambas neoplasias, se aprecia relación por anatomía patológica más no sucede así en los sitios de localización. Se concluye que si existe relación entre la aparición de una segunda neoplasia y el uso de quimioterápicos con agentes alquilantes, pero se necesita que ello sea reportado para su mejor detección y manejo.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Química / Los radicales libres son por esencia especies reactivas que se encuentran involucradas en sistemas biológicos y químicos. Los radicales libres se encuentran presentes en la mayoría de las patologías existentes, ya sea como causantes o como indicadores de alguna anomalía en sistemas vivos. Se clasifican actualmente como especies reactivas de oxígeno (EROs) y especies reactivas de nitrógeno (ERNs). La gran dificultad para el estudio de los radicales libres radica en sus cortos tiempos de vida que van en el orden de milisegundos a nanosegundos lo cual hace difícil su caracterización. Sin embargo, en este último tiempo se ha desarrollado una nueva técnica denominada “atrapamiento de espín” (Spin Trapping) en conjunto con la espectroscopia de Resonancia de Espín Electrónico (REE) que ha permitido la detección de estas especies. Esta técnica implica la reacción de una molécula atrapadora de radicales denominada atrapador de espín (Spin Trap) la cual reacciona con el radical libre formando una especie radicalaria más estable denominada aducto de espín (Spin Aduct). Existen dos grandes familias de atrapadores de radicales libres utilizados, los nitroso compuestos que se han dejado de usar por una serie de inconvenientes que presentaban y las nitronas que son de gran uso comercial hoy en día. Las nitronas forman un grupo estructural bastante utilizado para atrapar radicales libres, sin embargo las existentes en el mercado (principalmente las nitronas más usadas son 5,5–dimetil–1– pirrolina N–óxido (DMPO) y α–fenil–N–tert–butilnitrona (PBN) además de algunos derivados de este último) presentan aun problemas de solubilidad en medios acuosos, de selectividad y de biodisponibilidad. En esta tesis, se estudiaron cuatro series de nitronas con diferentes modificaciones estructurales: la serie I de nitronas derivadas de N–óxido furazano, la serie II y la serie III derivadas de 1,4–di–N–óxido quinoxalina y la serie 0 que se utilizó como blanco para las series II y III. Estas nitronas permitieron un atrapamiento eficiente de especies radicalarias activas de corta vida. Esta variedad estructural permitió evaluar su capacidad como atrapadores de radicales libres. El principal objetivo de este estudio es evaluar fisicoquímicamente nuevas series de nitronas haciendo un estudio experimental y teórico. Se usarán principalmente dos grupos de metodologías asociadas con los diferentes estudios a realizar, la primera metodología comprende el uso de la espectroscopia de resonancia de espín electrónico (REE) para la caracterización de los atrapadores de radicales libres. La segunda metodología comprende el uso de herramientas de la química computacional que permitan una mejor comprensión y racionalización de los resultados experimentales, basados en la química cuántica y de las simulaciones de cinéticas y de espectros de REE/RMN. Los resultados obtenidos muestran que aquellas nitronas solubles en general son mejores atrapadores de radicales libres que 5,5–dimetil–1–pirrolina N–óxido (DMPO) y α–fenil–N–tert–butilnitrona (PBN). En comparación a DMPO, las nitronas estudiadas resultaron ser entre 3,5 a 5,0 veces más rápidos que este último. Además, mostraron ser buenos atrapadores de radicales libres en medios biológicos. Los estudios cinéticos permitieron obtener las constantes de atrapamiento de estas nitronas al atrapar al radical hidroxilo, además de constantes relativas para otros radicales libres. Se determinó la constante de decaimiento de los aductos de espín y su correspondiente tiempo de vida media. La racionalización de los resultados experimentales mediante el uso de los cálculos computacionales, permitieron proponer un mecanismo de reacción general para estos atrapadores y comprender que fenómenos de tipo electrónicos influyen en la estabilización del correspondiente aducto de espín formado. / Free radicals are essentially reactive species involved in biological and chemical systems. Free radicals are present in several diseases either as originators or as indicators of abnormalities in living systems, being currently classified as reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). The major difficulty in their study lies in their short lifetimes which range from milliseconds to nanoseconds, making it difficult to characterize them. The “Spin Trapping” technique has been developed which in conjunction with Electron Spin Resonance Spectroscopy (ESR) allow the detection of these radical species. This technique involves the reaction of a radical trapping molecule called Spin–Trap, which reacts with a free radical molecule forming a more stable radical species called Spin–Adduct. Nowadays the use of Nitrone (DMPO) as a Spin–Trap, a successful commercial compound has revealed several problems, mainly due to the short lifetime of the spin adduct formed. Also, another spin trap called PBN, displayed a shorter lifetime of it’s adduct compared to DMPO. Moreover, the search for improved spin traps is plenty of new issues like their diminished solubility or simply lack of selective which do not allow for the proper identification of the trapped species. In this thesis, we have studied four new families of nitrones with different structural modifications. The first series denominated as Series I of nitrones are derived from N–oxide furazane, the Series II and III are derived from 1,4–di–N–oxide quinoxaline and the last series called Series 0 were used as a structural blank for the Series II and III. These nitrones allowed the efficient trap of free radical species with short lifetime. The structural diversity of these nitrones has allowed the assessment of their ability as spin traps. Two methodologies were used to evaluate these compounds as spin traps. The first methodology involves the use of Electron Spin Resonance Spectroscopy (ESR) for the characterization of these nitrones as spin traps. The second methodology involves the use of computational chemistry tools to enable a better understanding so as the rationalization of the experimental results, based on quantum chemical and kinetic and spectra simulations of ESR/NMR. The results show that soluble nitrones are generally better spin traps than DMPO and PBN. Our results indicated that studied nitrones are between 3.5 and 5.0 times faster spin traps in comparison to DMPO. The above mentioned nitrones also show to be efficient spin traps in biological media. The rationalization of the experimental results using computer calculations allowed us to propose a general reaction mechanism for the trapping process in order to understand how the electronic structure of these nitrones have an influence on the stabilization of the trapped free radical species and the consequent formation of the spin adducts.

La presentación de una segunda neoplasia es considerada una complicación tardía, cuya incidencia a nivel internacional está dentro del 2-5 % de los casos oncológicos. Actualmente en nuestro medio, no se cuenta con trabajos sobre la incidencia de ellas, así como de la relación que pueda existir ante el uso de determinados tratamientos, en especial el uso de agentes alquilantes previos. Siendo estos, los más utilizados en nuestro medio para diversos esquemas de tratamiento, se realizó el presente estudio, buscando determinar dicha relación para modificar la dosis administradas y disminuir el riesgo, manteniendo iguales niveles de efectividad terapéutica. El estudio se realizó en el periodo de Enero 1998-Diciembre 2000, en el HNGAI evaluándose 7,205 pacientes oncológicos, de los cuales se encontró 117 casos de segunda neoplasia (el cual representa el 1.62 %) y 9 casos con tres neoplasias. La edad de los pacientes varía de 9 a 89 años, con una mediana de 57 años, siendo 78 mujeres y 39 varones. En relación a la primera neoplasia, se presento en estadíos tempranos I-II (73 %), siendo los sitios primarios más frecuentes: mama en 24 casos, ginecológicos 19 casos y cabeza y cuello 18 casos. La anatomía patológica más frecuente fue carcinomas con 68 casos, t el relación al tratamiento,33 pacientes recibieron quimioterapia de los cuales 26 fueron por agentes alquilantes (ciclofosfamida e ifosfamida en frecuencia), cuya dosis total por superficie corporal promedio fue 3243 mg/ m2. Cabe resaltar que dichos pacientes fueron en su mayoría estadío clínico III-IV. En relación a la segunda neoplasia, se presento en estadíos clínicos tardíos III-IV (48%), siendo los sitios más frecuentes: TGI en 22 casos, Pie en 21 casos, y Ginecológicos en 18 casos. La anatomía patológica fue Carcinomas con 53 pacientes. El periodo intergenésico entre ambas neoplasias fue de 53 meses y su periodo libre de enfermedad fue de 74.6 meses. Si relacionamos ambas neoplasias, se aprecia relación por anatomía patológica más no sucede así en los sitios de localización. Se concluye que si existe relación entre la aparición de una segunda neoplasia y el uso de quimioterápicos con agentes alquilantes, pero se necesita que ello sea reportado para su mejor detección y manejo.

Os novos agentes alquilantes Zalypsis e o Tryptamicidin são moléculas estruturalmente relacionadas à trabectedina e possuem a habilidade de ligarem-se à volta menor do DNA. Por apresentarem potente atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo, estes agentes estão atualmente sendo avaliados em ensaios clínicos I e II para o tratamento de diferentes tipos de tumores sólidos e hematológicos. Por outro lado, o 3’3-ditrifluometildifenil disseneleto (DFDD) é um composto orgânico de selênio que demonstra interessantes atividades antioxidantes em modelos biológicos in vitro e in vivo e está em fase inicial de desenvolvimento. No presente trabalho, buscou-se avaliar os mecanismos de ação dos três novos agentes principalmente em relação à maquinaria macromolecular. Dentre os principais resultados encontrados, destaca-se a potente atividade citotóxica do Zalypsis e Tryptamicidin em diferentes linhagens tumorais e a capacidade de indução de quebras duplas no DNA (DSB) de maneira dependente de replicação por esses agentes. Além disso, a utilização de linhagens celulares deficientes em genes que codificam proteínas envolvidas nos sistemas de reparação por recombinação homóloga (HRR) e não-homóloga (NHEJ), permitiu a identificação do sistema HRR como a principal via implicada na reparação das lesões induzidas pelo Zalypsis e Tryptamicidin. Por outro lado, embora o NER não seja capaz de reparar as lesões induzidas pelo Tryptamicidin, este agente mostrou interferir na maquinaria do NER, impedindo a reparação de lesões induzidas pelo UV, como verificado pelo teste UDS. Considerando que linhagens tumorais resistentes a agentes platinados possuem uma alta atividade das enzimas do NER, buscou-se investigar a ação do Tryptamicidin nestas células. Como esperado, o Tryptamicidin, assim como a trabectedina, demonstrou potente atividade citotóxica nestas linhagens e ainda mostrou efeito sinérgico quando associado à cisplatina em linhagens resistentes a este agente platinado. Adicionalmente, usando linhagens celulares tumorais e extratos de ovos de Xenopus laevis, foi verificado que o Zalypsis, mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de tratamento, também é capaz de bloquear a replicação sem causar, no entanto, parada no ciclo celular e ativação das vias clássicas de sinalização de danos no DNA (DNA damage response). Adicionalmente, foi observado pela primeira vez que o DFDD foi capaz de proteger o DNA contra os efeitos genotóxicos e mutagênicos do peróxido de hidrogênio (H2O2) em diferentes modelos biológicos. Estes resultados reforçam as atividades antioxidantes deste composto de selênio que parecem estar relacionadas à ação direta do DFDD na molécula do H2O2. Os dados apresentados nesta tese elucidaram aspectos importantes dos mecanismos de ação dos novos agentes Zalypsis, Tryptamicidin e DFDD, ressaltando a importância dessas moléculas que, como agentes únicos ou em associação, poderão contribuir para a melhoria da terapia antitumoral. / Zalypsis and Tryptamicidin are new covalent minor groove binders structurally related to trabectedin. Both compounds have shown potent antitumoral activities in vitro and in vivo tumor models and are currently under clinical phase I and II in patients with different haematological and solid tumors. 3’3- ditrifluoromethyldyphenil diselenide (DFDD) is an organic selenium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo and is under early phase of development. The aim of this work was evaluate the mechanism of action of these new products focusing on the macromolecular machinery. Interestingly, Zalypsis and Tryptamicidin display strong cytotoxic activities in different tumor cell lines and these drugs are able to induce replication-dependent double strand breaks (DSB). Using homologous recombination repair (HRR) and nonhomologous end-joining repair (NHEJ) deficient and proficient cell lines, it was found that the HRR is the principal pathway implicated in the repair of the DNA lesions induced by Zalypsis and Tryptamicidin. Our results also demonstrate that although Tryptamicidin is not repaired by NER, this compound is able to interfere with the NER machinery thereby attenuating the repair of specific NER substrates, as verified by UDS test. Importantly, Tryptamicidin and trabectedin show unchanged or even enhanced activity towards all four cisplatin- and oxaliplatin-resistant cell lines and combinations of these drugs and cisplatin were mostly synergistic toward both parental and cisplatin-resistant ovarian carcinoma cells. We also demonstrate for the first time that Zalypsis, even in low doses and short treatment periods, was able to block the replication in tumor cell lines and Xenopus laevis egg extracts. Interestingly, this blockage did not trigger cell cycle arrest or DNA damage response and, as a result, leads to early cell death. On the other hand, DFDD is able to protect the DNA against the genotoxicity and mutagenicity induced by hydrogen peroxide in bacteria, yeast and cultured mammalian cells. Using in vitro tests, we also illustrated that DFDD directly acts on H2O2 molecule mimicking catalase-like activity. Indeed, these results reinforce the antioxidant property of DFDD that probably play a fundamental role in the DNA protection showed by this selenium compound. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the new agents Zalypsis, Tryptamicidin and DFDD, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumoral therapy.

Los lodos provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales, por sus características, pueden ser reutilizados en la agricultura, como mejoradores de suelos o reemplazo parcial de fertilizantes. Se caracterizan por tener un elevado porcentaje de materia orgánica, la cual puede interaccionar con una serie de compuestos orgánicos tóxicos a niveles traza, como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), plaguicidas, bifenilos policlorados (PCBs), dioxinas y furanos (PCDD/F), compuestos orgánicos volátiles (VOCs), compuestos alifáticos halogenados, fenoles y detergentes. Dentro del grupo de los detergentes, se ha puesto énfasis especialmente en los etoxilatos de nonilfenol y octilfenol, y sus metabolitos, ya que son compuestos disruptores del sistema endocrino. Para su extracción se han propuesto varios métodos modernos alternativos al método tradicional de extracción Soxhlet, como la extracción por agitación ultrasónica (USE), extracción con fluidos supercríticos (SFE), extracción con disolventes acelerada (ASE) y extracción asistida por microondas (MAE o MASE), entre otras que han demostrado tener recuperaciones similares o mejores que la extracción Soxhlet. Estas metodologías tienen grandes ventajas comparativas con respecto a la extracción Soxhlet, como la rapidez en completar la extracción, y la menor cantidad de disolvente extractante y de muestra que son necesarios. En este estudio se propone el desarrollo de un método de determinación de etoxilatos de alquilfenoles y sus derivados en muestras de biosólidos, que incremente la eficiencia y rapidez en las etapas de preparación de la muestra,respecto de un sistema de extracción Soxhlet, incorpore energía adicional (temperatura-presión del disolvente), que asista el proceso de extracción. Asimismo, se busca la optimización de las variables para la extracción de etoxilatos de alquilfenol y sus metabolitos, nonilfenol y octilfenol, desde biosólidos, y desde suelos enmendados con biosólidos, mediante el empleo de modelos de diseño estadístico, a través del análisis multivariado. De esta forma, se integrarán las ventajas y posibilidades que ofrecen las metodologías innovadoras de preparación de muestra y la detección por GC–MS en sus diferentes modalidades, permitiendo de este modo la obtención de métodos analíticos de preparación de muestra más ventajosos, respecto de métodos más tradicionales, en términos de exactitud, precisión y rapidez. La metodología de extracción con disolventes presurizados en batch (ASE), fue la que presentó mejores recuperaciones. Las condiciones óptimas para esta metodología fueron: 129 ºC, 34 minutos por ciclo, en dos ciclos, y disolvente de extracción, acetona. Comparativamente con la extracción Soxhlet, esta metodología optimizada resultó ser más eficiente, en cuanto al tiempo de extracción y cantidad de disolvente. La extracción de los analitos en estudio, por ambas metodologías fue: en el caso de 4-t-OP, 1,2±0,1 mg·kg-1 y 1,22±0,04 mg·kg-1; 4-NP, 204±20 mg·kg-1 y 298±7 mg·kg-1; 4-n-OP, 54±4 mg·kg-1 y 6,4±0,4 mg·kg-1; 4-OPE 16±1 mg·kg-1 y 0,3±0,1 mg·kg-1; y 4-NPE, 1053±23 mg·kg-1 y 621±18 mg·kg-1, para los sistemas ASE y Soxhlet, respectivamente. La metodología ASE optimizada tuvo mejores recuperaciones en el caso de 4-n-OP, 4-OPE y 4-NPE, mientras que la extracción Soxhlet fue mejor en el caso de 4-NP. En el caso de 4-t-OP, ambas metodologías son comparables.Una vez optimizado el método de determinación de 4-NP y 4-NPE, se aplicó en ensayos de movilidad en columnas de lixiviación y de biodisponibilidad con plantas de trigo. Se encontró que la movilidad de 4-NP y 4-NPE mostró ser relativamente moderada. De esta forma, tanto 4-NP, como 4-NPE, presentes en el biosólido, estarían disponibles para ser absorbidos por las plantas. La biodisponibilidad de los analitos seleccionados fue determinada mediante la extracción exhaustiva en muestras de trigo cultivado en suelo, con diferentes dosis de biosólido (B) y biosólido enriquecido (BE) con 4-NP. Los analitos encontrados en mayor concentración en el trigo son 4-NP y 4-NPE. En particular la concentración de 4-NP en trigo, varía entre 3 mg·kg-1 y 33 mg·kg-1, y la de 4- NPE entre 1,6 mg·kg-1 y 9,5 mg·kg-1. Es posible afirmar que estos analitos estarían significativamente biodisponibles para el trigo, cultivado en suelo tratado con biosólido. La correlación entre el contenido de 4-NP en las plantas y fracción móvil determinada a través de columnas de lixiviación, mostró correlaciones satisfactorias, tanto para la parte radicular, como para la parte aérea de la planta.

Os novos agentes alquilantes Zalypsis e o Tryptamicidin são moléculas estruturalmente relacionadas à trabectedina e possuem a habilidade de ligarem-se à volta menor do DNA. Por apresentarem potente atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo, estes agentes estão atualmente sendo avaliados em ensaios clínicos I e II para o tratamento de diferentes tipos de tumores sólidos e hematológicos. Por outro lado, o 3’3-ditrifluometildifenil disseneleto (DFDD) é um composto orgânico de selênio que demonstra interessantes atividades antioxidantes em modelos biológicos in vitro e in vivo e está em fase inicial de desenvolvimento. No presente trabalho, buscou-se avaliar os mecanismos de ação dos três novos agentes principalmente em relação à maquinaria macromolecular. Dentre os principais resultados encontrados, destaca-se a potente atividade citotóxica do Zalypsis e Tryptamicidin em diferentes linhagens tumorais e a capacidade de indução de quebras duplas no DNA (DSB) de maneira dependente de replicação por esses agentes. Além disso, a utilização de linhagens celulares deficientes em genes que codificam proteínas envolvidas nos sistemas de reparação por recombinação homóloga (HRR) e não-homóloga (NHEJ), permitiu a identificação do sistema HRR como a principal via implicada na reparação das lesões induzidas pelo Zalypsis e Tryptamicidin. Por outro lado, embora o NER não seja capaz de reparar as lesões induzidas pelo Tryptamicidin, este agente mostrou interferir na maquinaria do NER, impedindo a reparação de lesões induzidas pelo UV, como verificado pelo teste UDS. Considerando que linhagens tumorais resistentes a agentes platinados possuem uma alta atividade das enzimas do NER, buscou-se investigar a ação do Tryptamicidin nestas células. Como esperado, o Tryptamicidin, assim como a trabectedina, demonstrou potente atividade citotóxica nestas linhagens e ainda mostrou efeito sinérgico quando associado à cisplatina em linhagens resistentes a este agente platinado. Adicionalmente, usando linhagens celulares tumorais e extratos de ovos de Xenopus laevis, foi verificado que o Zalypsis, mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de tratamento, também é capaz de bloquear a replicação sem causar, no entanto, parada no ciclo celular e ativação das vias clássicas de sinalização de danos no DNA (DNA damage response). Adicionalmente, foi observado pela primeira vez que o DFDD foi capaz de proteger o DNA contra os efeitos genotóxicos e mutagênicos do peróxido de hidrogênio (H2O2) em diferentes modelos biológicos. Estes resultados reforçam as atividades antioxidantes deste composto de selênio que parecem estar relacionadas à ação direta do DFDD na molécula do H2O2. Os dados apresentados nesta tese elucidaram aspectos importantes dos mecanismos de ação dos novos agentes Zalypsis, Tryptamicidin e DFDD, ressaltando a importância dessas moléculas que, como agentes únicos ou em associação, poderão contribuir para a melhoria da terapia antitumoral. / Zalypsis and Tryptamicidin are new covalent minor groove binders structurally related to trabectedin. Both compounds have shown potent antitumoral activities in vitro and in vivo tumor models and are currently under clinical phase I and II in patients with different haematological and solid tumors. 3’3- ditrifluoromethyldyphenil diselenide (DFDD) is an organic selenium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo and is under early phase of development. The aim of this work was evaluate the mechanism of action of these new products focusing on the macromolecular machinery. Interestingly, Zalypsis and Tryptamicidin display strong cytotoxic activities in different tumor cell lines and these drugs are able to induce replication-dependent double strand breaks (DSB). Using homologous recombination repair (HRR) and nonhomologous end-joining repair (NHEJ) deficient and proficient cell lines, it was found that the HRR is the principal pathway implicated in the repair of the DNA lesions induced by Zalypsis and Tryptamicidin. Our results also demonstrate that although Tryptamicidin is not repaired by NER, this compound is able to interfere with the NER machinery thereby attenuating the repair of specific NER substrates, as verified by UDS test. Importantly, Tryptamicidin and trabectedin show unchanged or even enhanced activity towards all four cisplatin- and oxaliplatin-resistant cell lines and combinations of these drugs and cisplatin were mostly synergistic toward both parental and cisplatin-resistant ovarian carcinoma cells. We also demonstrate for the first time that Zalypsis, even in low doses and short treatment periods, was able to block the replication in tumor cell lines and Xenopus laevis egg extracts. Interestingly, this blockage did not trigger cell cycle arrest or DNA damage response and, as a result, leads to early cell death. On the other hand, DFDD is able to protect the DNA against the genotoxicity and mutagenicity induced by hydrogen peroxide in bacteria, yeast and cultured mammalian cells. Using in vitro tests, we also illustrated that DFDD directly acts on H2O2 molecule mimicking catalase-like activity. Indeed, these results reinforce the antioxidant property of DFDD that probably play a fundamental role in the DNA protection showed by this selenium compound. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the new agents Zalypsis, Tryptamicidin and DFDD, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumoral therapy.

Os novos agentes alquilantes Zalypsis e o Tryptamicidin são moléculas estruturalmente relacionadas à trabectedina e possuem a habilidade de ligarem-se à volta menor do DNA. Por apresentarem potente atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo, estes agentes estão atualmente sendo avaliados em ensaios clínicos I e II para o tratamento de diferentes tipos de tumores sólidos e hematológicos. Por outro lado, o 3’3-ditrifluometildifenil disseneleto (DFDD) é um composto orgânico de selênio que demonstra interessantes atividades antioxidantes em modelos biológicos in vitro e in vivo e está em fase inicial de desenvolvimento. No presente trabalho, buscou-se avaliar os mecanismos de ação dos três novos agentes principalmente em relação à maquinaria macromolecular. Dentre os principais resultados encontrados, destaca-se a potente atividade citotóxica do Zalypsis e Tryptamicidin em diferentes linhagens tumorais e a capacidade de indução de quebras duplas no DNA (DSB) de maneira dependente de replicação por esses agentes. Além disso, a utilização de linhagens celulares deficientes em genes que codificam proteínas envolvidas nos sistemas de reparação por recombinação homóloga (HRR) e não-homóloga (NHEJ), permitiu a identificação do sistema HRR como a principal via implicada na reparação das lesões induzidas pelo Zalypsis e Tryptamicidin. Por outro lado, embora o NER não seja capaz de reparar as lesões induzidas pelo Tryptamicidin, este agente mostrou interferir na maquinaria do NER, impedindo a reparação de lesões induzidas pelo UV, como verificado pelo teste UDS. Considerando que linhagens tumorais resistentes a agentes platinados possuem uma alta atividade das enzimas do NER, buscou-se investigar a ação do Tryptamicidin nestas células. Como esperado, o Tryptamicidin, assim como a trabectedina, demonstrou potente atividade citotóxica nestas linhagens e ainda mostrou efeito sinérgico quando associado à cisplatina em linhagens resistentes a este agente platinado. Adicionalmente, usando linhagens celulares tumorais e extratos de ovos de Xenopus laevis, foi verificado que o Zalypsis, mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de tratamento, também é capaz de bloquear a replicação sem causar, no entanto, parada no ciclo celular e ativação das vias clássicas de sinalização de danos no DNA (DNA damage response). Adicionalmente, foi observado pela primeira vez que o DFDD foi capaz de proteger o DNA contra os efeitos genotóxicos e mutagênicos do peróxido de hidrogênio (H2O2) em diferentes modelos biológicos. Estes resultados reforçam as atividades antioxidantes deste composto de selênio que parecem estar relacionadas à ação direta do DFDD na molécula do H2O2. Os dados apresentados nesta tese elucidaram aspectos importantes dos mecanismos de ação dos novos agentes Zalypsis, Tryptamicidin e DFDD, ressaltando a importância dessas moléculas que, como agentes únicos ou em associação, poderão contribuir para a melhoria da terapia antitumoral. / Zalypsis and Tryptamicidin are new covalent minor groove binders structurally related to trabectedin. Both compounds have shown potent antitumoral activities in vitro and in vivo tumor models and are currently under clinical phase I and II in patients with different haematological and solid tumors. 3’3- ditrifluoromethyldyphenil diselenide (DFDD) is an organic selenium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo and is under early phase of development. The aim of this work was evaluate the mechanism of action of these new products focusing on the macromolecular machinery. Interestingly, Zalypsis and Tryptamicidin display strong cytotoxic activities in different tumor cell lines and these drugs are able to induce replication-dependent double strand breaks (DSB). Using homologous recombination repair (HRR) and nonhomologous end-joining repair (NHEJ) deficient and proficient cell lines, it was found that the HRR is the principal pathway implicated in the repair of the DNA lesions induced by Zalypsis and Tryptamicidin. Our results also demonstrate that although Tryptamicidin is not repaired by NER, this compound is able to interfere with the NER machinery thereby attenuating the repair of specific NER substrates, as verified by UDS test. Importantly, Tryptamicidin and trabectedin show unchanged or even enhanced activity towards all four cisplatin- and oxaliplatin-resistant cell lines and combinations of these drugs and cisplatin were mostly synergistic toward both parental and cisplatin-resistant ovarian carcinoma cells. We also demonstrate for the first time that Zalypsis, even in low doses and short treatment periods, was able to block the replication in tumor cell lines and Xenopus laevis egg extracts. Interestingly, this blockage did not trigger cell cycle arrest or DNA damage response and, as a result, leads to early cell death. On the other hand, DFDD is able to protect the DNA against the genotoxicity and mutagenicity induced by hydrogen peroxide in bacteria, yeast and cultured mammalian cells. Using in vitro tests, we also illustrated that DFDD directly acts on H2O2 molecule mimicking catalase-like activity. Indeed, these results reinforce the antioxidant property of DFDD that probably play a fundamental role in the DNA protection showed by this selenium compound. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the new agents Zalypsis, Tryptamicidin and DFDD, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumoral therapy.

Câncer de pulmão é o tipo de câncer mais comum e letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. Sozinho, ele é responsável por mais mortes que os outros três mais letais (mama, cólon e próstata) somados. Há registro de 160.000 mortes/ano nos Estados Unidos e 20.000 mortes/ano no Brasil devido a carcinoma de pulmão. O câncer de pulmão de não-pequenas células (NSCLC – do inglês nonsmall cell lung cancer) representa aproximadamente 85% dos casos. Apesar do conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumento muito, o prognóstico de NSCLS continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada a detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados com a doença apresenta estádios avançados, necessitando de tratamentos paliativos como a quimioterapia. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela inabilidade de aplicação de conhecimentos moleculares ao tratamento. A agressividade tumoral está relacionada, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Carcinomas de pulmão são de difícil cura devido à sua grande capacidade metastática, fenômeno que requer alta mobilidade celular. Uma das principais proteínas encarregadas deste fenômeno é a cofilina-1. Esta proteína atua aumentando a taxa de despolimerização dos filamentos de actina (F-actina). A alta atividade dessa proteína foi correlacionada in vitro com maior invasividade em câncer de mama. A quimioterapia com uso de cisplatina (em combinação ou não com outras drogas) – e análogos com menos efeitos colaterais, como a carboplatina – tem se mostrado a escolha mais eficaz para pacientes com NSCLC avançado. Estes agentes alquilantes são, portanto, as drogas de escolha para o tratamento clínico de NSCLC, justificando a escolha dessa drogas para o estudo. A ação antitumoral dos agentes alquilantes se dá por dano ao DNA, promovendo apoptose; entretanto, após algumas sessões é comum que este tratamento perca eficácia em alguns pacientes. Diversos fenômenos moleculares podem ser atribuídos à essa resistência: maior inativação da droga, menor influxo da droga, insensibilidade das rotas apoptóticas e maiores níveis de reparo de DNA. Estudos prévios do nosso grupo correlacionaram altos níveis de expressão de cofilina-1 a uma maior resistência a agentes alquilantes em linhagens humanas de NSCLC. Por isso, com este trabalho objetivamos corroborar e reforçar o papel da proteína cofilina-1 na resistência a agentes alquilantes, onde células A549 foram submetidas a 2 abordagens: uma seleção de células intrinsecamente resistentes a cisplatina, e outra usando biologia molecular para super-expressar a cofilina-1 e posteriormente verificar um aumento na resistência. Nossos resultados mostraram que um aumento na resistência possivelmente está relacionado a um aumento no imunoconteúdo de cofilina-1, e que aumento no imunoconteúdo dessa proteína está associado a um aumento na resistência à cisplatina. Por essa razão, a cofilina-1 surge como uma possível e forte candidata para ser um biomarcador em câncer de pulmão de não pequenas células, não somente ditando o prognóstico, como também o melhor tratamento a ser escolhido para o paciente. / Lung cancer is the most common and lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Alone, it is responsible for more deaths than the other three most lethal cancers (breast, colon and prostate) together. There are 160,000 registered deaths/year in the United States an 20,00 death/year in Brazil from lung carcinoma. Cancer represents approximately 85% of the cases. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors is well known, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an average of 9-11 months. One of the motives of this bad prognosis is the related difficulty of initial detection, because the symptoms of the majority of patients with the disease do not present until advanced stages, where palliative treatment is necessary like chemotherapy. The lack of clinical advance itself the can be given to the non-application of molecular knowledge to the treatment chosen. Tumoral aggression is related to the metastatic capacity and resistance to chemotherapy. Lung carcinomas are difficult to cure due to their great metastatic capacity, a phenomenon that requires highly cellular mobility. One of the principal proteins responsible for this phenomenon is cofilin-1. This protein acts by changing the cost of depolymerization of the actin filaments (F-actin). The high activity of this protein was correlated in vitro with more invasiveness in breast cancer. Chemotherapy with the use of cisplatin (in combination or not with other drugs)—and analogs with less collateral effects, like carboplatin—it has shown itself to be a more efficient choice for patients with advanced NSCLC. These alkylating agents are, therefore, the drugs of choice for the clinical treatment of NSCLC, justifying the choice of these drugs for the study. The anti-tumoral action of alkylating agents themselves causes DNA damage, promoting apoptosis; however, after some sessions it is common that this treatment lost efficacy in some patients. Diverse molecular phenomena can be attributed to that resistance: the more inactivation of the drug, the more drug efflux, insensibility to the apoptotic cycle and larger levels of DNA repair. Previous studies from our research group correlated high levels of expression of cofilin to a higher resistence to alkylating agents in human NSCLC cell lines. For this, with this work we try to corroborate and reinforce the role of the protein cofilin-1 on the resistance to alkylating agents. A549 cells were submitted via 2 approaches: the first was for the selection of cells intrinsically resistant to cisplatin, and the other used molecular biology to detect the overexpression of cofilin-,1 and after an increase in resistance was verified. Our data shows that the increase in resistance is possible correlated with an increase in the immunocontent of cofilin-1. A rise in the immunocontent of this protein was associated with an increase in resistance to cisplatin. Therefore, cofilin-1 becomes a possibly strong candidate as a biomarker in nonsmall cell lung cancer, not only predicting prognosis, but also helping to choose a better treatment for the patient.

Câncer de pulmão é o tipo de câncer mais comum e letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. Sozinho, ele é responsável por mais mortes que os outros três mais letais (mama, cólon e próstata) somados. Há registro de 160.000 mortes/ano nos Estados Unidos e 20.000 mortes/ano no Brasil devido a carcinoma de pulmão. O câncer de pulmão de não-pequenas células (NSCLC – do inglês nonsmall cell lung cancer) representa aproximadamente 85% dos casos. Apesar do conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumento muito, o prognóstico de NSCLS continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada a detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados com a doença apresenta estádios avançados, necessitando de tratamentos paliativos como a quimioterapia. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela inabilidade de aplicação de conhecimentos moleculares ao tratamento. A agressividade tumoral está relacionada, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Carcinomas de pulmão são de difícil cura devido à sua grande capacidade metastática, fenômeno que requer alta mobilidade celular. Uma das principais proteínas encarregadas deste fenômeno é a cofilina-1. Esta proteína atua aumentando a taxa de despolimerização dos filamentos de actina (F-actina). A alta atividade dessa proteína foi correlacionada in vitro com maior invasividade em câncer de mama. A quimioterapia com uso de cisplatina (em combinação ou não com outras drogas) – e análogos com menos efeitos colaterais, como a carboplatina – tem se mostrado a escolha mais eficaz para pacientes com NSCLC avançado. Estes agentes alquilantes são, portanto, as drogas de escolha para o tratamento clínico de NSCLC, justificando a escolha dessa drogas para o estudo. A ação antitumoral dos agentes alquilantes se dá por dano ao DNA, promovendo apoptose; entretanto, após algumas sessões é comum que este tratamento perca eficácia em alguns pacientes. Diversos fenômenos moleculares podem ser atribuídos à essa resistência: maior inativação da droga, menor influxo da droga, insensibilidade das rotas apoptóticas e maiores níveis de reparo de DNA. Estudos prévios do nosso grupo correlacionaram altos níveis de expressão de cofilina-1 a uma maior resistência a agentes alquilantes em linhagens humanas de NSCLC. Por isso, com este trabalho objetivamos corroborar e reforçar o papel da proteína cofilina-1 na resistência a agentes alquilantes, onde células A549 foram submetidas a 2 abordagens: uma seleção de células intrinsecamente resistentes a cisplatina, e outra usando biologia molecular para super-expressar a cofilina-1 e posteriormente verificar um aumento na resistência. Nossos resultados mostraram que um aumento na resistência possivelmente está relacionado a um aumento no imunoconteúdo de cofilina-1, e que aumento no imunoconteúdo dessa proteína está associado a um aumento na resistência à cisplatina. Por essa razão, a cofilina-1 surge como uma possível e forte candidata para ser um biomarcador em câncer de pulmão de não pequenas células, não somente ditando o prognóstico, como também o melhor tratamento a ser escolhido para o paciente. / Lung cancer is the most common and lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Alone, it is responsible for more deaths than the other three most lethal cancers (breast, colon and prostate) together. There are 160,000 registered deaths/year in the United States an 20,00 death/year in Brazil from lung carcinoma. Cancer represents approximately 85% of the cases. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors is well known, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an average of 9-11 months. One of the motives of this bad prognosis is the related difficulty of initial detection, because the symptoms of the majority of patients with the disease do not present until advanced stages, where palliative treatment is necessary like chemotherapy. The lack of clinical advance itself the can be given to the non-application of molecular knowledge to the treatment chosen. Tumoral aggression is related to the metastatic capacity and resistance to chemotherapy. Lung carcinomas are difficult to cure due to their great metastatic capacity, a phenomenon that requires highly cellular mobility. One of the principal proteins responsible for this phenomenon is cofilin-1. This protein acts by changing the cost of depolymerization of the actin filaments (F-actin). The high activity of this protein was correlated in vitro with more invasiveness in breast cancer. Chemotherapy with the use of cisplatin (in combination or not with other drugs)—and analogs with less collateral effects, like carboplatin—it has shown itself to be a more efficient choice for patients with advanced NSCLC. These alkylating agents are, therefore, the drugs of choice for the clinical treatment of NSCLC, justifying the choice of these drugs for the study. The anti-tumoral action of alkylating agents themselves causes DNA damage, promoting apoptosis; however, after some sessions it is common that this treatment lost efficacy in some patients. Diverse molecular phenomena can be attributed to that resistance: the more inactivation of the drug, the more drug efflux, insensibility to the apoptotic cycle and larger levels of DNA repair. Previous studies from our research group correlated high levels of expression of cofilin to a higher resistence to alkylating agents in human NSCLC cell lines. For this, with this work we try to corroborate and reinforce the role of the protein cofilin-1 on the resistance to alkylating agents. A549 cells were submitted via 2 approaches: the first was for the selection of cells intrinsically resistant to cisplatin, and the other used molecular biology to detect the overexpression of cofilin-,1 and after an increase in resistance was verified. Our data shows that the increase in resistance is possible correlated with an increase in the immunocontent of cofilin-1. A rise in the immunocontent of this protein was associated with an increase in resistance to cisplatin. Therefore, cofilin-1 becomes a possibly strong candidate as a biomarker in nonsmall cell lung cancer, not only predicting prognosis, but also helping to choose a better treatment for the patient.

Câncer de pulmão é o tipo de câncer mais comum e letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. Sozinho, ele é responsável por mais mortes que os outros três mais letais (mama, cólon e próstata) somados. Há registro de 160.000 mortes/ano nos Estados Unidos e 20.000 mortes/ano no Brasil devido a carcinoma de pulmão. O câncer de pulmão de não-pequenas células (NSCLC – do inglês nonsmall cell lung cancer) representa aproximadamente 85% dos casos. Apesar do conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumento muito, o prognóstico de NSCLS continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada a detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados com a doença apresenta estádios avançados, necessitando de tratamentos paliativos como a quimioterapia. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela inabilidade de aplicação de conhecimentos moleculares ao tratamento. A agressividade tumoral está relacionada, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Carcinomas de pulmão são de difícil cura devido à sua grande capacidade metastática, fenômeno que requer alta mobilidade celular. Uma das principais proteínas encarregadas deste fenômeno é a cofilina-1. Esta proteína atua aumentando a taxa de despolimerização dos filamentos de actina (F-actina). A alta atividade dessa proteína foi correlacionada in vitro com maior invasividade em câncer de mama. A quimioterapia com uso de cisplatina (em combinação ou não com outras drogas) – e análogos com menos efeitos colaterais, como a carboplatina – tem se mostrado a escolha mais eficaz para pacientes com NSCLC avançado. Estes agentes alquilantes são, portanto, as drogas de escolha para o tratamento clínico de NSCLC, justificando a escolha dessa drogas para o estudo. A ação antitumoral dos agentes alquilantes se dá por dano ao DNA, promovendo apoptose; entretanto, após algumas sessões é comum que este tratamento perca eficácia em alguns pacientes. Diversos fenômenos moleculares podem ser atribuídos à essa resistência: maior inativação da droga, menor influxo da droga, insensibilidade das rotas apoptóticas e maiores níveis de reparo de DNA. Estudos prévios do nosso grupo correlacionaram altos níveis de expressão de cofilina-1 a uma maior resistência a agentes alquilantes em linhagens humanas de NSCLC. Por isso, com este trabalho objetivamos corroborar e reforçar o papel da proteína cofilina-1 na resistência a agentes alquilantes, onde células A549 foram submetidas a 2 abordagens: uma seleção de células intrinsecamente resistentes a cisplatina, e outra usando biologia molecular para super-expressar a cofilina-1 e posteriormente verificar um aumento na resistência. Nossos resultados mostraram que um aumento na resistência possivelmente está relacionado a um aumento no imunoconteúdo de cofilina-1, e que aumento no imunoconteúdo dessa proteína está associado a um aumento na resistência à cisplatina. Por essa razão, a cofilina-1 surge como uma possível e forte candidata para ser um biomarcador em câncer de pulmão de não pequenas células, não somente ditando o prognóstico, como também o melhor tratamento a ser escolhido para o paciente. / Lung cancer is the most common and lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Alone, it is responsible for more deaths than the other three most lethal cancers (breast, colon and prostate) together. There are 160,000 registered deaths/year in the United States an 20,00 death/year in Brazil from lung carcinoma. Cancer represents approximately 85% of the cases. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors is well known, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an average of 9-11 months. One of the motives of this bad prognosis is the related difficulty of initial detection, because the symptoms of the majority of patients with the disease do not present until advanced stages, where palliative treatment is necessary like chemotherapy. The lack of clinical advance itself the can be given to the non-application of molecular knowledge to the treatment chosen. Tumoral aggression is related to the metastatic capacity and resistance to chemotherapy. Lung carcinomas are difficult to cure due to their great metastatic capacity, a phenomenon that requires highly cellular mobility. One of the principal proteins responsible for this phenomenon is cofilin-1. This protein acts by changing the cost of depolymerization of the actin filaments (F-actin). The high activity of this protein was correlated in vitro with more invasiveness in breast cancer. Chemotherapy with the use of cisplatin (in combination or not with other drugs)—and analogs with less collateral effects, like carboplatin—it has shown itself to be a more efficient choice for patients with advanced NSCLC. These alkylating agents are, therefore, the drugs of choice for the clinical treatment of NSCLC, justifying the choice of these drugs for the study. The anti-tumoral action of alkylating agents themselves causes DNA damage, promoting apoptosis; however, after some sessions it is common that this treatment lost efficacy in some patients. Diverse molecular phenomena can be attributed to that resistance: the more inactivation of the drug, the more drug efflux, insensibility to the apoptotic cycle and larger levels of DNA repair. Previous studies from our research group correlated high levels of expression of cofilin to a higher resistence to alkylating agents in human NSCLC cell lines. For this, with this work we try to corroborate and reinforce the role of the protein cofilin-1 on the resistance to alkylating agents. A549 cells were submitted via 2 approaches: the first was for the selection of cells intrinsically resistant to cisplatin, and the other used molecular biology to detect the overexpression of cofilin-,1 and after an increase in resistance was verified. Our data shows that the increase in resistance is possible correlated with an increase in the immunocontent of cofilin-1. A rise in the immunocontent of this protein was associated with an increase in resistance to cisplatin. Therefore, cofilin-1 becomes a possibly strong candidate as a biomarker in nonsmall cell lung cancer, not only predicting prognosis, but also helping to choose a better treatment for the patient.