Diversos genes expressos durante a diferenciação das células germinativas atuam no desenvolvimento ovariano. A diferenciação das células somáticas ovarianas depende do número de células germinativas pré-meióticas que migram para a fenda gonadal. A expressão espaço-temporal de genes envolvidos na diferenciação dessas células e a posterior sobrevivência dos oócitos meióticos são de interesse no estudo dos distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XX. Entre os genes envolvidos nesses processos estão o NANOS3, BMP15 e STRA8. O NANOS3, uma molécula de ligação ao RNA que bloqueia a via apoptótica, assegura a sobrevivência das células germinativas durante sua migração para o interior da gônada. O STRA8 atua no início da meiose das células germinativas na gônada de embriões XX, sendo o primeiro sinal de dimorfismo gonadal. Por outro lado a subseqüente sobrevivência dos oócitos é controlada por fatores de transformação e crescimento como o BMP15, que promove a diferenciação das células da granulosa que por sua vez participam indiretamente da diferenciação dos oócitos e das células da teca. Neste trabalho pesquisamos a presença de mutações inativadoras nos genes NANOS3 e BMP15 em 45 pacientes com disgenesia gonadal (DG) 46,XX (10 casos familiais) e 40 pacientes com amenorréia secundária sem mutação nos genes FSHR e SF1. Também pesquisamos mutações nas regiões promotora proximal e codificadora do gene STRA8 de 45 pacientes com DG 46,XX, 16 pacientes com DDS ovotesticular 46,XX e 5 pacientes com DDS testicular 46,XX todos SRY negativo nos quais foram afastados defeitos moleculares nos genes DAX1, WNT4 e SOX9. No NANOS3 identificamos a mutação p.E120K em homozigose, a primeira associada ao fenótipo de DG 46,XX. Esta mutação missense foi identificada em duas irmãs com DG 46, XX e está localizada no domínio de ligação do tipo dedo de zinco da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No BMP15, uma nova mutação nonsense p.Q115X foi identificada em homozigose em duas irmãs com DG 46XX e em heterozigose em uma paciente com amenorréia secundária não familial. O códon de parada prematuro está localizado na região do pré-peptídeo da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No gene STRA8, um único polimorfismo previamente descrito na literatura (rs7805859) foi identificado na região codificadora e nenhuma alteração na região promotora proximal foi identificada. Em conclusão, identificamos pela primeira vez uma mutação no gene NANOS3 associado á DG 46,XX e confirmamos a participação do BMP15 neste fenótipo. Distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XX podem ser causados por mutações em genes envolvidos tanto na diferenciação quanto manutenção das células germinativas ovarianas. / Several genes expressing during the germ cell differentiation act in ovary development. The differentiation of somatic ovary cells depends of a pool of pre meiotic germ cells migration into the gonad. The space and temporal expression pattern of some genes involved with germ cell differentiation and the subsequently oocyte survival should be investigated in the disorders of sexual development (DSD) 46,XX. Some key genes involved with these processes are: NANOS3, BMP15 and STRA8. The NANOS3, a RNA binding molecule that blocks the apoptotic pathway, ensures the survival during migration into genital ridge. The STRA8 acts in the bigining of germ cells meioses in XX embryos and mark the first sexual gonadal dimorphism. In other hand the subsequently oocyte survival is controlled through transforming growth factor member BMP15, that guarantees granulose cells differentiation that acts indirectly in meiotic oocyte and theca cells differentiation. In this work we searched for the presence of inactivating mutations in NANOS3 and BMP15 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis (10 familial cases) and 40 patients with secondary amenorrhea without FSHR and SF1 mutation. We also searched for inactivating mutations in coding and proximal promoter region of STRA8 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis, 16 ovotesticular disorder of sex development (DSD) patients and five 46XX testicular DSD patients all SRY negative and molecular defects in DAX1, WNT4 and SOX9 gene. In NANOS3 we identified the mutation p.E120K in homozygous state, the first associated with DG 46,XX phenotype. This missense mutation was identified in two sisters with 46XX GD and affects a zinc finger domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In BMP15, a new nonsense mutation p.Q115X was identified two sisters in homozygous state and in one sporadic case of secondary amenorrhea in heterozygous state. The premature codon STOP affects the pro-peptide domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In STRA8, only a previously described polymorphism (rs7805859) was identified without any other variation in coding or proximal promoter region. In conclusion, we identified for the fist time mutation in NANOS3 associated with DG 46XX and corroborate the role of BMP15 in this phenotype. Disorders of gonadal development 46,XX may be involved with differentiation and maintenance of ovarian germ cells.

Diversos genes expressos durante a diferenciação das células germinativas atuam no desenvolvimento ovariano. A diferenciação das células somáticas ovarianas depende do número de células germinativas pré-meióticas que migram para a fenda gonadal. A expressão espaço-temporal de genes envolvidos na diferenciação dessas células e a posterior sobrevivência dos oócitos meióticos são de interesse no estudo dos distúrbios do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XX. Entre os genes envolvidos nesses processos estão o NANOS3, BMP15 e STRA8. O NANOS3, uma molécula de ligação ao RNA que bloqueia a via apoptótica, assegura a sobrevivência das células germinativas durante sua migração para o interior da gônada. O STRA8 atua no início da meiose das células germinativas na gônada de embriões XX, sendo o primeiro sinal de dimorfismo gonadal. Por outro lado a subseqüente sobrevivência dos oócitos é controlada por fatores de transformação e crescimento como o BMP15, que promove a diferenciação das células da granulosa que por sua vez participam indiretamente da diferenciação dos oócitos e das células da teca. Neste trabalho pesquisamos a presença de mutações inativadoras nos genes NANOS3 e BMP15 em 45 pacientes com disgenesia gonadal (DG) 46,XX (10 casos familiais) e 40 pacientes com amenorréia secundária sem mutação nos genes FSHR e SF1. Também pesquisamos mutações nas regiões promotora proximal e codificadora do gene STRA8 de 45 pacientes com DG 46,XX, 16 pacientes com DDS ovotesticular 46,XX e 5 pacientes com DDS testicular 46,XX todos SRY negativo nos quais foram afastados defeitos moleculares nos genes DAX1, WNT4 e SOX9. No NANOS3 identificamos a mutação p.E120K em homozigose, a primeira associada ao fenótipo de DG 46,XX. Esta mutação missense foi identificada em duas irmãs com DG 46, XX e está localizada no domínio de ligação do tipo dedo de zinco da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No BMP15, uma nova mutação nonsense p.Q115X foi identificada em homozigose em duas irmãs com DG 46XX e em heterozigose em uma paciente com amenorréia secundária não familial. O códon de parada prematuro está localizado na região do pré-peptídeo da proteína. A nova mutação não foi identificada em 200 alelos controles pesquisados. No gene STRA8, um único polimorfismo previamente descrito na literatura (rs7805859) foi identificado na região codificadora e nenhuma alteração na região promotora proximal foi identificada. Em conclusão, identificamos pela primeira vez uma mutação no gene NANOS3 associado á DG 46,XX e confirmamos a participação do BMP15 neste fenótipo. Distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XX podem ser causados por mutações em genes envolvidos tanto na diferenciação quanto manutenção das células germinativas ovarianas. / Several genes expressing during the germ cell differentiation act in ovary development. The differentiation of somatic ovary cells depends of a pool of pre meiotic germ cells migration into the gonad. The space and temporal expression pattern of some genes involved with germ cell differentiation and the subsequently oocyte survival should be investigated in the disorders of sexual development (DSD) 46,XX. Some key genes involved with these processes are: NANOS3, BMP15 and STRA8. The NANOS3, a RNA binding molecule that blocks the apoptotic pathway, ensures the survival during migration into genital ridge. The STRA8 acts in the bigining of germ cells meioses in XX embryos and mark the first sexual gonadal dimorphism. In other hand the subsequently oocyte survival is controlled through transforming growth factor member BMP15, that guarantees granulose cells differentiation that acts indirectly in meiotic oocyte and theca cells differentiation. In this work we searched for the presence of inactivating mutations in NANOS3 and BMP15 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis (10 familial cases) and 40 patients with secondary amenorrhea without FSHR and SF1 mutation. We also searched for inactivating mutations in coding and proximal promoter region of STRA8 in 45 patients with 46XX gonadal dysgenesis, 16 ovotesticular disorder of sex development (DSD) patients and five 46XX testicular DSD patients all SRY negative and molecular defects in DAX1, WNT4 and SOX9 gene. In NANOS3 we identified the mutation p.E120K in homozygous state, the first associated with DG 46,XX phenotype. This missense mutation was identified in two sisters with 46XX GD and affects a zinc finger domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In BMP15, a new nonsense mutation p.Q115X was identified two sisters in homozygous state and in one sporadic case of secondary amenorrhea in heterozygous state. The premature codon STOP affects the pro-peptide domain of the protein. The new variant was absent in 200 control alleles. In STRA8, only a previously described polymorphism (rs7805859) was identified without any other variation in coding or proximal promoter region. In conclusion, we identified for the fist time mutation in NANOS3 associated with DG 46XX and corroborate the role of BMP15 in this phenotype. Disorders of gonadal development 46,XX may be involved with differentiation and maintenance of ovarian germ cells.

Introdução: O termo distúrbios do desenvolvimento gonadal (DDG) inclui condições congênitas nas quais o desenvolvimento gonadal é atípico. Estudos feitos em camundongos observaram que alguns genes como o Cbx2 e o Tcf21 interferem na fase inicial do desenvolvimento gonadal, afetando tanto gônadas XX quanto XY. O gene Dhh, por sua vez, codifica o fator de transcrição Dhh, produzido pelas células de Sertoli, que é fundamental para a diferenciação das células de Leydig em gônadas XY. Nos ovários, o gene FOXL2 atua na foliculogênese, sendo fundamental para a formação dos ovários. Objetivos: Analisar clinicamente e pesquisar anormalidades nos genes CBX2, TCF21, DHH e FOXL2 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XY e 46, XX. Material e Métodos: Foram estudados 60 pacientes (41 com DDG 46, XY e 19 com DDG 46, XX). A análise molecular foi realizada a partir da amplificação gênica por PCR e sequenciamento direto. Resultados: Várias alterações alélicas foram encontradas nos quatro genes, algumas ainda não descritas na literatura. Uma alteração intrônica no gene DHH foi encontrada em um paciente com DDG 46, XY e não foi encontrada em nenhum dos 360 alelos normais estudados (g.IVS2 +29G>A). Estudamos essa variante através da extração do RNA do testículo do paciente afetado, mas não encontramos alteração no RNA; portanto ela parece não ser uma mutação. No gene TCF21, a variante encontrada foi identificada em controles normais. No gene CBX2, das treze alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais, e há troca de aminoácidos (p.C132R / g.394 T>C). Trata-se de uma variante que pode ter relação com o fenótipo do paciente, portador de DDG 46, XY. No gene FOXL2, das três alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais; contudo, não há troca de aminoácidos (p.A181A / g.543 C>T). Conclusão: Esse estudo sugere que mutações nos genes CBX2, TCF21, FOXL2 e DHH são causas raras de distúrbios do desenvolvimento gonadal. / Introduction: Congenital disorders of gonadal development (DGD) include conditions whose gonadal development is atypical. Studies in mice found that some genes such as Cbx2 and Tcf21 interfere in the initial phase of gonadal development, affecting both XX and XY gonads. Dhh gene, in turn, encodes the transcription factor Dhh, produced by Sertoli cells, which is essential for the differentiation of Leydig cells in XY gonads. In the ovaries, genes as FOXL2 act in folliculogenesis, fundamental to the development of the ovaries. Objectives: To analyze patients with disorders of gonadal development (DGD) 46, XY and 46, XX and research mutations in CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes. Methods: We analyzed 60 patients (41 DGD 46, XY patients and 19 DGD 46, XX patients). The whole coding region of CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes were amplified by PCR and direct sequenced. Results: Several allelic variations have been found in the four genes, some not even described by literature. One intronic variation in DHH was described in one patient with 46, XY DGD and it wasnt found in any of the 360 normal control alleles studied (g.IVS2 +29G>A). We studied this variant through RNA extraction from the affected patients testes, but we didnt find any alteration in the RNA, so it doesnt seem to be a mutation. In TCF21 gene, the single variant that was found was identified in normal controls. In CBX2 gene, among the 13 alterations described, one wasnt identified in 206 normal control alleles, and there is aminoacid change (p.C132R / g.394 T>C). This is a variant that may be a mutation, causing the patients phenotype that had 46, XY DGD. In FOXL2, among the 3 variations described, one wasnt indentified in 206 normal control alleles, but there wasnt amino acid change (p.A181A / g.543 C>T).Conclusion: This study suggests that mutations in CBX2, TCF21, FOXL2 and DHH genes are rarely causes of disorders of gonadal development.

Introdução: O termo distúrbios do desenvolvimento gonadal (DDG) inclui condições congênitas nas quais o desenvolvimento gonadal é atípico. Estudos feitos em camundongos observaram que alguns genes como o Cbx2 e o Tcf21 interferem na fase inicial do desenvolvimento gonadal, afetando tanto gônadas XX quanto XY. O gene Dhh, por sua vez, codifica o fator de transcrição Dhh, produzido pelas células de Sertoli, que é fundamental para a diferenciação das células de Leydig em gônadas XY. Nos ovários, o gene FOXL2 atua na foliculogênese, sendo fundamental para a formação dos ovários. Objetivos: Analisar clinicamente e pesquisar anormalidades nos genes CBX2, TCF21, DHH e FOXL2 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XY e 46, XX. Material e Métodos: Foram estudados 60 pacientes (41 com DDG 46, XY e 19 com DDG 46, XX). A análise molecular foi realizada a partir da amplificação gênica por PCR e sequenciamento direto. Resultados: Várias alterações alélicas foram encontradas nos quatro genes, algumas ainda não descritas na literatura. Uma alteração intrônica no gene DHH foi encontrada em um paciente com DDG 46, XY e não foi encontrada em nenhum dos 360 alelos normais estudados (g.IVS2 +29G>A). Estudamos essa variante através da extração do RNA do testículo do paciente afetado, mas não encontramos alteração no RNA; portanto ela parece não ser uma mutação. No gene TCF21, a variante encontrada foi identificada em controles normais. No gene CBX2, das treze alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais, e há troca de aminoácidos (p.C132R / g.394 T>C). Trata-se de uma variante que pode ter relação com o fenótipo do paciente, portador de DDG 46, XY. No gene FOXL2, das três alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais; contudo, não há troca de aminoácidos (p.A181A / g.543 C>T). Conclusão: Esse estudo sugere que mutações nos genes CBX2, TCF21, FOXL2 e DHH são causas raras de distúrbios do desenvolvimento gonadal. / Introduction: Congenital disorders of gonadal development (DGD) include conditions whose gonadal development is atypical. Studies in mice found that some genes such as Cbx2 and Tcf21 interfere in the initial phase of gonadal development, affecting both XX and XY gonads. Dhh gene, in turn, encodes the transcription factor Dhh, produced by Sertoli cells, which is essential for the differentiation of Leydig cells in XY gonads. In the ovaries, genes as FOXL2 act in folliculogenesis, fundamental to the development of the ovaries. Objectives: To analyze patients with disorders of gonadal development (DGD) 46, XY and 46, XX and research mutations in CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes. Methods: We analyzed 60 patients (41 DGD 46, XY patients and 19 DGD 46, XX patients). The whole coding region of CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes were amplified by PCR and direct sequenced. Results: Several allelic variations have been found in the four genes, some not even described by literature. One intronic variation in DHH was described in one patient with 46, XY DGD and it wasnt found in any of the 360 normal control alleles studied (g.IVS2 +29G>A). We studied this variant through RNA extraction from the affected patients testes, but we didnt find any alteration in the RNA, so it doesnt seem to be a mutation. In TCF21 gene, the single variant that was found was identified in normal controls. In CBX2 gene, among the 13 alterations described, one wasnt identified in 206 normal control alleles, and there is aminoacid change (p.C132R / g.394 T>C). This is a variant that may be a mutation, causing the patients phenotype that had 46, XY DGD. In FOXL2, among the 3 variations described, one wasnt indentified in 206 normal control alleles, but there wasnt amino acid change (p.A181A / g.543 C>T).Conclusion: This study suggests that mutations in CBX2, TCF21, FOXL2 and DHH genes are rarely causes of disorders of gonadal development.