Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-07-19T14:59:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ProspeccaoAminoacidosTipo.pdf: 1575316 bytes, checksum: 2121cfc071ab9524757f12dd88cb8efc (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-07-21T14:50:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ProspeccaoAminoacidosTipo.pdf: 1575316 bytes, checksum: 2121cfc071ab9524757f12dd88cb8efc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ProspeccaoAminoacidosTipo.pdf: 1575316 bytes, checksum: 2121cfc071ab9524757f12dd88cb8efc (MD5) Previous issue date: 2014-06-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos de baixa massa molecular solúveis em água, cuja biossíntese, pensava-se ocorrer pela via do ácido chiquímico em bactérias, fitoplâncton e macroalgas. Recentemente, evidências mostram sua biossíntese pela via das pentoses em uma cianobactéria. Devido seu alto coeficiente de extinção molar na região do UV, proporcionam proteção contra os efeitos deletérios da radiação ultravioleta tendo potencial para a utilização em protetores solares. Em trabalhos anteriores foi descrito um cluster biossintético para chinorina que consistia nas enzimas Dehidroquinato sintase, presente na via do chiquimato, O-metiltransferase, uma enzima assimiladora de ATP e um homólogo de NRPS. Foi verificado ainda que a enzima 2-epi-5-epi-valiolona sintase, enzima que interligaria a via das pentoses, poderia formar o intermediário cíclico 4-desoxigadusol, precursor dos MAAs. Neste trabalho foi feita uma abordagem genômica para a busca destes genes, de modo a investigar o potencial de produção de MAAs nas cianobactérias da Coleção Amazônia de Cianobactérias e Microalgas, CACIAM 14, CACIAM 53, CACIAM 54 e CACIAM 57, bem como uma análise por cromatografia líquida capilar acoplada a espectrometria de massas com fonte de ionização de Electrospray dos metabólitos em CACIAM 14. Os genes da Dehidroquinato sintase e da O-metiltransferase foram encontrados em todas as linhagens estudadas. Os genes da via das pentoses Ribulose-fosfato-3-epimerase e Transcetolase foram detectados nas linhagens CACIAM 14, CACIAM 53 e CACIAM 57, o que sugere que nestas linhagens os MAAs podem ser produzidos por ambas as vias enquanto que na linhagem CACIAM 54 que os MAAs podem ser produzidos apenas pela via do chiquimato. Na linhagem CACIAM 14, foram detectados os fragmentos de relação massa/carga 186 e 197 no mesmo tempo de retenção de um íon precursor de m/z 333, valor esse sugestivo da presença de chinorina. Dessa forma, as linhagens CACIAM 53, 54 e 57 são potencialmente produtoras de MAAs por possuírem os genes biossintéticos, e a linhagem CACIAM 14 é produtora de chinorina. / Mycosporine-like amino acids (MAAs) are low molecular weight water soluble compounds wuich biosynthesis was thought to occur via shikimate pathway in bacteria, phytoplankton and macroalgae. Recently evidences show its biosynthesis via the pentose pathway in a cyanobacterium. Due to its high extinction molar coefficient in UV region, they provide protection against the damaging effects of UV radiation and have potential for use in sunscreens. In previous works it was described a biosynthetic cluster for shinorine with the enzymes dehydroquinate synthase, present in the shikimate pathway, O-methyltransferase, and ATP-grasp and NRPS-like enzymes. It was observed that the enzyme 2-epi-5-epi-valiolone synthase, which link the pentose pathway with MAAs production would lead to formation of 4-deoxygadusol, precursor of MAAs. In this work a genomics approach was carried out so find these genes so that MAAs production potential in Amazonian cyanobacteria of the Coleção Amazônica de Cianobactérias e Microalgas, CACIAM 14, CACIAM 53, CACIAM 54 and CACIAM 57 strains was assessed, as well as an analysis through capillary chromatography coupled to electrospray mass spectrometryof the metabolites in CACIAM 14. The genes Dehydroquinate synthase and o-methyltransferase were found in all the strains studied. The genes of pentose pathway Ribulose-phosphate-3-epimerase and transketolase were detected in the strains CACIAM 14, CACIAM 53 and CACIAM 57, what may suggest that in these strains MAAs could be produced by both pathways while in CACIAM 57 MAAs could be produced by shikimate pathway only. In CACIAM 14 strain, fragments of mass to charge relationship 186 and 197 were found in the same retention time of a precursor ion of m/z 333, what could be related to shinorine. Therefore, the strains CACIAM 53, 54 and 57 are potentially producers of MAAs due to possessing biosynthetic genes and CACIAM 14 is shinorine producer.

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese de flavonóides em plantas superiores. Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas. Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa. Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie de regiões com menores irradiações. / Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants. In this work, studies related to this class of compounds were performed with algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at different temperature. The results showed that depending on the organism examined, both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs with good resolution. The structural characterization was made by mass spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different MAAs in some micro and macroalgae. In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial utilization for the extracts. The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime in their natural enviroment. The quantum yield of photosystem II suggested that the over production of MAAs by P. Minimum from Lisbon protects the photosynthetic apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in phytoplankton.

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese de flavonóides em plantas superiores. Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas. Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa. Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie de regiões com menores irradiações. / Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants. In this work, studies related to this class of compounds were performed with algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at different temperature. The results showed that depending on the organism examined, both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs with good resolution. The structural characterization was made by mass spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different MAAs in some micro and macroalgae. In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial utilization for the extracts. The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime in their natural enviroment. The quantum yield of photosystem II suggested that the over production of MAAs by P. Minimum from Lisbon protects the photosynthetic apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in phytoplankton.