A radiação ultravioleta (RUV) causa efeitos deletérios em ecossistemas aquáticos e terrestres. Um dos mecanismos de defesa criados pelos organismos para evitar estes danos é o acúmulo de compostos que absorvem RUV, dentre os quais os aminoácidos tipo micosporina (MAAs, do inglês mycosporine-like amino acids) representam uma classe importante. As MAAs são substâncias solúveis em água caracterizadas pela presença de uma unidade ciclo-hexenona ou ciclo-hexenimina conjugada com nitrogênio substituído por um aminoácido, aminoálcool ou grupo amino, apresentando absorção máxima entre 308 e 362 nm e altos coeficientes de absortividade molar. Dado o importante papel desempenhado pelas MAAs na fisiologia e bioquímica celular de algas, seja atuando como protetoras de RUV ou como antioxidantes, o objetivo desta tese foi expandir o corpo de conhecimentos disponíveis sobre a ocorrência e distribuição destes compostos em macroalgas brasileiras. Para atingir tal meta, foi necessário desenvolver procedimentos analíticos de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (high procedure liquid chromatography, HPLC), de modo a gerar padrões que pudessem ser utilizados para a qualificação e quantificação de MAAs em extratos de algas. Foi necessário também desenvolver dois novos métodos de análise por HPLC acoplada a espectrometria de massas (HPLC-MS) - sendo um utilizado como método diagnóstico, capaz de indicar se há MAAs presentes em determinada amostra, e outro utilizado como método para quantificação. Todos os métodos trouxeram bons resultados, e os métodos por HPLC-MS foram utilizados para o estudo de diversas macroalgas coletadas na região intertidal de praias do litoral Sul do estado do Espírito Santo - Brasil. Apesar da localização restrita, é o maior estudo desta natureza realizado até então com algas do litoral brasileiro. Além disso, 11 dos 32 gêneros e 34 das 45 espécies presentes nesta tese nunca haviam sido alvo de nenhum estudo relacionado a MAAs. Nessas amostras, foi possível encontrar oito MAAs: chinorina, palitina, porphyra-334, asterina-330, palitinol, micosporina-2-glicina, o par cis/trans usujireno/paliteno e uma molécula desconhecida com relação massa-carga de 317 m/z ([M+H]+). Dentre elas, as três primeiras foram quantificadas de forma absoluta, e pôde-se perceber que as rodófitas apresentam níveis de MAAs sensivelmente maiores que as clorófitas e feófitas. Em relação à variedade, foi possível notar que, dentre as amostras que possuem dados do conteúdo de MAAs na literatura (seja para a espécie ou para o gênero), praticamente todas apresentam maior variedade de MAAs do que o anteriormente descrito. Foi encontrada a maior variedade de MAAs já descrita para uma alga parda: seis MAAs diferentes nas espécies Dictyopteris delicatula e Padina gymnospora coletadas na praia de Castelhanos - ES. Pôde-se detectar, pela primeira vez, a presença de MAAs em 32 espécies de macroalgas. Algumas espécies mostram-se fontes muito interessantes de MAAs para diferentes usos pela indústria, seja para a obtenção de compostos puros ou para a utilização de seus extratos como ingredientes de formulações de filtros solares. A molécula desconhecida, cujo íon quasimolecular [M+H]+ apresenta m/z 317, foi tentativamente identificada como sendo a micosporina-glicina-alanina. Este é o primeiro trabalho a descrever a ocorrência desta molécula in natura. / Ultraviolet radiation (UVR) exerts deleterious effects on aquatic and terrestrial ecosystems. One defense mechanism created by organisms to avoid this damage is the accumulation of UV-absorbing compounds, among which the mycosporine-like amino acids (MAAs) represent an important class. MAAs are water-soluble compounds characterized by the presence of a cyclohexenone or cyclohexenimine ring conjugated with amino acids, amino alcohols or other amino groups, presenting absorption maxima ranging from 309 nm to 362 nm and high molar extinction coefficients. Given their important role in algae physiology and cellular biochemistry, as photoprotective compounds or antioxidants, the objective of this thesis is to expand the available knowledge on the occurrence and distribution of MAAs in Brazilian macroalgae. To achieve this goal, it was necessary to develop an isolation methodology by high procedure liquid chromatography (HPLC), so as to generate standards for qualifying and quantifying MAAs in macroalgae extracts. It was also necessary to develop two new analysis methods by HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS) - one utilized as a diagnosis method, capable of indicating if there are MAAs in a given sample; and the other utilized as quantification method. All methods gave good results, and the ones relying on HPLC-MS were used to study several macroalgae collected at the intertidal region of beaches located in the south coast of Espírito Santo State - Brazil. This is the biggest study of this nature ever done with Brazilian macroalgae; besides that, 11 out of 32 genera and 34 out of 45 species herein tested had never had their content of MAA assessed. In these samples, it was possible to find eight MAAs: shinorine, palythine, porphyra- 334, asterina-330, palythinol, mycosporine-2-glycine, the cis/trans pair usujirene/palythene and an unknown molecule with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+). Among them, absolute quantification was performed for the first three ones, and it was possible to notice that red algae have higher MAA levels than green and brown algae. In terms of variety, it could be seen that, amongst the samples that have MAA data available in the literature (either for the species or for the genus), nearly all present a higher MAA variety than the previously described one. The highest variety ever recorded from brown algae is presented in this work: six different MAAs in Dictyopteris delicatula and Padina gymnospora, both collected at Castelhanos Beach - ES. For the first time, it was possible to detect MAAs in 32 species of macroalgae. Some species seem to be very interesting sources of MAAs for industrial purposes, either for obtaining pure compounds or for utilizing their extracts as ingredients of sunscreen formulas. The unknown molecule, with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+), was tentatively identified as mycosporine-glycine-alanine. This is the first work to describe the occurrence of this molecule in natura.

A radiação ultravioleta (RUV) causa efeitos deletérios em ecossistemas aquáticos e terrestres. Um dos mecanismos de defesa criados pelos organismos para evitar estes danos é o acúmulo de compostos que absorvem RUV, dentre os quais os aminoácidos tipo micosporina (MAAs, do inglês mycosporine-like amino acids) representam uma classe importante. As MAAs são substâncias solúveis em água caracterizadas pela presença de uma unidade ciclo-hexenona ou ciclo-hexenimina conjugada com nitrogênio substituído por um aminoácido, aminoálcool ou grupo amino, apresentando absorção máxima entre 308 e 362 nm e altos coeficientes de absortividade molar. Dado o importante papel desempenhado pelas MAAs na fisiologia e bioquímica celular de algas, seja atuando como protetoras de RUV ou como antioxidantes, o objetivo desta tese foi expandir o corpo de conhecimentos disponíveis sobre a ocorrência e distribuição destes compostos em macroalgas brasileiras. Para atingir tal meta, foi necessário desenvolver procedimentos analíticos de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (high procedure liquid chromatography, HPLC), de modo a gerar padrões que pudessem ser utilizados para a qualificação e quantificação de MAAs em extratos de algas. Foi necessário também desenvolver dois novos métodos de análise por HPLC acoplada a espectrometria de massas (HPLC-MS) - sendo um utilizado como método diagnóstico, capaz de indicar se há MAAs presentes em determinada amostra, e outro utilizado como método para quantificação. Todos os métodos trouxeram bons resultados, e os métodos por HPLC-MS foram utilizados para o estudo de diversas macroalgas coletadas na região intertidal de praias do litoral Sul do estado do Espírito Santo - Brasil. Apesar da localização restrita, é o maior estudo desta natureza realizado até então com algas do litoral brasileiro. Além disso, 11 dos 32 gêneros e 34 das 45 espécies presentes nesta tese nunca haviam sido alvo de nenhum estudo relacionado a MAAs. Nessas amostras, foi possível encontrar oito MAAs: chinorina, palitina, porphyra-334, asterina-330, palitinol, micosporina-2-glicina, o par cis/trans usujireno/paliteno e uma molécula desconhecida com relação massa-carga de 317 m/z ([M+H]+). Dentre elas, as três primeiras foram quantificadas de forma absoluta, e pôde-se perceber que as rodófitas apresentam níveis de MAAs sensivelmente maiores que as clorófitas e feófitas. Em relação à variedade, foi possível notar que, dentre as amostras que possuem dados do conteúdo de MAAs na literatura (seja para a espécie ou para o gênero), praticamente todas apresentam maior variedade de MAAs do que o anteriormente descrito. Foi encontrada a maior variedade de MAAs já descrita para uma alga parda: seis MAAs diferentes nas espécies Dictyopteris delicatula e Padina gymnospora coletadas na praia de Castelhanos - ES. Pôde-se detectar, pela primeira vez, a presença de MAAs em 32 espécies de macroalgas. Algumas espécies mostram-se fontes muito interessantes de MAAs para diferentes usos pela indústria, seja para a obtenção de compostos puros ou para a utilização de seus extratos como ingredientes de formulações de filtros solares. A molécula desconhecida, cujo íon quasimolecular [M+H]+ apresenta m/z 317, foi tentativamente identificada como sendo a micosporina-glicina-alanina. Este é o primeiro trabalho a descrever a ocorrência desta molécula in natura. / Ultraviolet radiation (UVR) exerts deleterious effects on aquatic and terrestrial ecosystems. One defense mechanism created by organisms to avoid this damage is the accumulation of UV-absorbing compounds, among which the mycosporine-like amino acids (MAAs) represent an important class. MAAs are water-soluble compounds characterized by the presence of a cyclohexenone or cyclohexenimine ring conjugated with amino acids, amino alcohols or other amino groups, presenting absorption maxima ranging from 309 nm to 362 nm and high molar extinction coefficients. Given their important role in algae physiology and cellular biochemistry, as photoprotective compounds or antioxidants, the objective of this thesis is to expand the available knowledge on the occurrence and distribution of MAAs in Brazilian macroalgae. To achieve this goal, it was necessary to develop an isolation methodology by high procedure liquid chromatography (HPLC), so as to generate standards for qualifying and quantifying MAAs in macroalgae extracts. It was also necessary to develop two new analysis methods by HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS) - one utilized as a diagnosis method, capable of indicating if there are MAAs in a given sample; and the other utilized as quantification method. All methods gave good results, and the ones relying on HPLC-MS were used to study several macroalgae collected at the intertidal region of beaches located in the south coast of Espírito Santo State - Brazil. This is the biggest study of this nature ever done with Brazilian macroalgae; besides that, 11 out of 32 genera and 34 out of 45 species herein tested had never had their content of MAA assessed. In these samples, it was possible to find eight MAAs: shinorine, palythine, porphyra- 334, asterina-330, palythinol, mycosporine-2-glycine, the cis/trans pair usujirene/palythene and an unknown molecule with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+). Among them, absolute quantification was performed for the first three ones, and it was possible to notice that red algae have higher MAA levels than green and brown algae. In terms of variety, it could be seen that, amongst the samples that have MAA data available in the literature (either for the species or for the genus), nearly all present a higher MAA variety than the previously described one. The highest variety ever recorded from brown algae is presented in this work: six different MAAs in Dictyopteris delicatula and Padina gymnospora, both collected at Castelhanos Beach - ES. For the first time, it was possible to detect MAAs in 32 species of macroalgae. Some species seem to be very interesting sources of MAAs for industrial purposes, either for obtaining pure compounds or for utilizing their extracts as ingredients of sunscreen formulas. The unknown molecule, with mass-to-charge ratio of 317 m/z ([M+H]+), was tentatively identified as mycosporine-glycine-alanine. This is the first work to describe the occurrence of this molecule in natura.

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese de flavonóides em plantas superiores. Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas. Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa. Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie de regiões com menores irradiações. / Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants. In this work, studies related to this class of compounds were performed with algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at different temperature. The results showed that depending on the organism examined, both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs with good resolution. The structural characterization was made by mass spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different MAAs in some micro and macroalgae. In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial utilization for the extracts. The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime in their natural enviroment. The quantum yield of photosystem II suggested that the over production of MAAs by P. Minimum from Lisbon protects the photosynthetic apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in phytoplankton.

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese de flavonóides em plantas superiores. Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas. Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa. Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie de regiões com menores irradiações. / Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants. In this work, studies related to this class of compounds were performed with algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at different temperature. The results showed that depending on the organism examined, both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs with good resolution. The structural characterization was made by mass spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different MAAs in some micro and macroalgae. In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial utilization for the extracts. The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime in their natural enviroment. The quantum yield of photosystem II suggested that the over production of MAAs by P. Minimum from Lisbon protects the photosynthetic apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in phytoplankton.