Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs en anglais) représentent la famille de récepteurs intégrales de membrane plus vaste dans la majorité des cellules eucaryotes. Ils jouent un rôle clé dans la transduction de signal, ainsi que la compréhension de leur mécanisme de signalisation représente une des questions principales dans la biologie d'aujourd'hui. Dans la caractérisation du paysage énergétique de ces récepteurs à l'échelle atomique, les structures cristallographiques publiées pendant la décennie dernière par cristallographie aux rayons X représentent la percée scientifique majeure et donnent une contribution fondamentale dans la biologie structurelle de GPCRS. Ces structures représentent un point de départ précieux dans la compréhension du mécanisme de transduction de signal, en plaçant des structures dans l'ensemble conformationnel de ces récepteurs le long du processus d'activation. Pour compléter ce cadre de structures statiques qui correspondent aux états à basse l'énergie et fortement peuplés, une caractérisation de l'ensemble conformationnel et des barrières cinétiques qui sont associées est un point nécessaire et fondamentale. À ce but nous proposons une approche innovant avec la finalité d'observer le paysage conformationnel dynamique des GPCR et étudier la modulation de ces récepteurs par des ligands et des lipides, qui sont connus pour jouer un rôle clé dans la structure et les fonctions des protéines de membrane (e.g.). Un des outilles le plus approprié pour explorer les barrières cinétiques de GPCR c'est la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. Pour tirer profit au mieux de cette technique, nous avons utilisé des sondes marqués 13CH3 immergées dans un environnement perdeuteré, qui constitue le marquage isotopique le plus approprié en RMN pour examiner les paysages conformationnels des protéines de grosses dimensionnes ou des complexes de protéines. Nous avons choisi Escherichia coli comme système d'expression pour sa capacité de pousser dans des conditions très hostiles comme des solutions 100%-D2O. Pour surmonter les difficultés habituellement rencontrées lors de l'expression des GPCRs, nous avons appliqué un protocole innovant qui cible l'expression de GPCRs directement aux corps d'inclusion. Ceci permet la production des bonnes quantités de protéines (jusqu’à 6 mg/litres de culture de pur 13CH3-u-2H-GPCRs). Une fois purifié, le récepteur est foldé en amphipols et transféré ensuite à une double couche lipidique appelée nanometric lipid bilayer ou nanodisc (NLB). De façon très important, les mesures pharmacologiques quantitatives indiquent que les récepteurs incorporés dans des NLBs après ce protocole sont stables et entièrement actifs dans les conditions des expériences de NMR.Les investigations par RMN conduites sur le GPCR en NLB ont donné lieu à une résolution jamais obtenue dans le domaine, grâce à la biochimie finement accordée et à la perdeuteration du récepteur. Selon les données obtenues, notre récepteur modèle, le récepteur 2 pour le leukotriene B4 (BLT2), est capable d'explorer plusieurs conformations différentes, même dans l'état pas lié aux ligands, y compris l'état actif. Ce paysage conformationnel est également modulé par des ligands et des lipides. Dans le cas spécifiques, nous avons observé que un incrément dans le contenu de stérol dans la membrane modifie la distribution des différents états conformationnels du récepteur, en favorisant l'état actif, qui indique une régulation allosteric positif du stérol sur l'activation de ce récepteur, comme confirmé aussi par les mesures de liaison du GTP à la protéine G. Cette propriété du stérol est probablement importante pour le contrôle de mécanisme de signalisation de GPCRs. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of integral membrane protein receptors present in most eukaryotic cells. They play a key role in signal transduction and understanding their signalling mechanism represents one of the main issues in biology today. In the characterization of the energy landscape of these receptors, at the atomic scale, X-ray crystal atomic structures published during the last decade represent the major breakthrough and contribution in the structural biology of GPCRs. They represent a precious starting point in the understanding of the mechanism of signal transduction by placing structures in the conformational ensemble of these receptors along the activation pathway. To complete these static snapshots that correspond to low energy and highly populated states, a characterization of the whole conformational ensemble and associated kinetic barriers is fundamental to complete the picture. To this aim we proposed an innovative approach to observe GPCRs dynamic conformational landscape and how it is modulated by ligands and lipids, that are known to play a key role in membrane protein structures and functions (e.g.). One of the most appropriate tool to explore GPCR kinetic barriers is solution state NMR. To do so, we used 13CH3 probes immersed in a perdeuterated environment, the most appropriate isotope-labelling scheme to investigate conformational landscapes of large proteins or protein complexes with this spectroscopy. We chose Escherichia coli as expression system for its ability to grow in very hostile conditions like 100%-D2O solutions. In order to overcome the usual expression issues concerning GPCRs, we applied an innovative protocol which targets the expression directly to inclusion bodies. This allows the production of high amounts of proteins (up to 6 mg/litre of culture of pure 13CH3-u-2H-GPCRs). Once purified, receptors are folded in amphipols and then transferred to nanometric lipid bilayers or nanodiscs. Importantly quantitative pharmacological measurements indicate that receptors embedded in NLBs following this protocol are stable and fully active in the conditions of the NMR experiments. NMR investigation of a GPCR in a NLB gave rise to a resolution never achieved in the field thanks to a fine tuned biochemistry and a perdeuteration of the receptor. According to our data, the prototypical receptor, the leukotriene B4 receptor (BLT2), is able to explore multiple different conformations, even in the unliganded state, including the active state. This conformational landscape is further modulated by ligands and lipids. In particular, we observed that an increment in the sterol content of the membrane modifies the distribution of the different conformational states of the receptor in favour of the active one, indicating a positive allosteric regulation of the sterol on the activation of this receptor, as confirmed by GTP-to-G protein binding measurements. This property of the sterol is likely important for the control of the signalling properties of GPCRs.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les amphipoles (APols) sont devenus des outils importants pour la stabilisation, le repliement, et les études structurales et fonctionnelles in vitro des protéines membranaires (MPs). Les MPs sont les unités fonctionnelles des biomembranes et représentent environ un tiers des protéines qui sont codées par le génome. La première partie de mon travail est dédiée à la cristallisation de MPs piégée par des APol. La cristallisation directe de protéines solubilisées en APol sera d'une grande importance pour la biologie structurale. Cependant, malgré des efforts considérables, il n'est pas certain que les complexes MP/APol peuvent être utilisés pour former des cristaux bien ordonnés utilisables en cristallographie des rayons X. Le premier objectif de cette thèse est de montrer que les MPs piégées par des APol peuvent être cristallisées in meso. Pour faire cela, nous avons utilisé des bicouches amphiliques interconnectées qui sont ajustables pour certaines MPs. Cette méthode a été récemment développée dans notre laboratoire. Nous avons utilisé la bactériorhodopsin (BR) piégée avec APol A8-35 comme système modèle pour nos études cristallographiques. Le premier cristal obtenu diffractait à 3 Å, alors qu'une nouvelle méthode de cristallisation en nanovolume, exploitant des précipitants secs, améliore les pics de diffraction aux rayons X observés jusqu'a 2 Å. La structure de BR a été résolue à 2 Å et s'est révélée identique aux autre structures obtenues précédemment à partir de protéine solubilisée en détergents. Nous suggérons que le protocole proposé, de cristallisation in meso, est applicable aux MPs solubilisées avec des APols.La deuxième partie est liée aux applications des APols pour les études de MPs à l'aide de spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS). La spectroscopie SERS a énormément évolué depuis sa découverte en 1970. C'est un outil analytique puissant pour sélectionner les molécules qui adsorbent sur des nanoparticules et des nanostructures à base de métaux nobles, possiblement au niveau de la molécule unique. Malheureusement les études de MPs sont loin de l'application courante du SERS à cause de la difficulté résultante de la nature amphiphilique des MPs. La capacité des APols à piéger les MPs et de les garder solubles, stables et fonctionnelles ouvre la voie pour des applications extrêmement intéressantes des études SERS, éventuellement au niveau de la molécule unique. De plus, le deuxième objectif de ce travail de thèse était de démontrer la faisabilité de l'utilisation de SERS avec des MPs piégées par des APols. Le même modèle (BR/A8-35) a été utilisé pour les études cristallographiques et pour les agrégats de NP d'argent. Cette tâche a été réalisée a un niveau suffisant pour commencer des études de MPs avec la méthode SERS.Le premier chapitre de cette thèse commence avec des informations générales à propos de l'importance des études de MPs et les problèmes inhérents à leur manipulation. Plus loin dans le chapitre, un bref résumé des APols, de leurs propriétés et leurs applications est présenté. La majeure partie de l'introduction est dédiée aux points importants des différentes approches de cristallisation de MPs et de spectroscopie Raman, en particulier SERS spectroscopie, et leurs applications aux protéines. La fin de la partie “Introduction” présente les conclusions à propos des applications des APols pour les études de cristallographie aux rayons X et pour les études de spectroscopie SERS sur les MPs, définissant les objectifs principaux pour ce travail. Le chapitre “Materials and methods” consiste en une description détaillée des matériels et des protocoles utilisés dans cette étude. Le résultat des études de cristallisation et de SERS et leurs interprétations sont présentés comme deux différentes parties dans le dernier chapitre “Results and discussions”. Le chapitre “Conclusions and perspectives est présent dans chaque partie. / Amphipols (APols) have become important tools for the stabilization, folding, and in vitro structural and functional studies of membrane proteins (MPs). MPs are the main functional units of biomembranes and represent roughly one-third of the proteins encoded in the genome. The first part of my work was dedicated to crystallization of a MP trapped by APol. Direct crystallization of MPs solubilized in APols would be of high importance for structural biology. However, despite considerable efforts, it is still not clear whether MP/APol complexes can be used to form well-ordered crystals suitable for X-ray crystallography. The first major goal of this PhD thesis work was to show that APol-trapped MP can be crystallized in meso. To perform it we utilized special, flexibly adjustable for a certain MP, interconnected amphiphilic bilayers (IAB) approach which has been recently developed in our laboratory. We used bacteriorhodopsin (BR) trapped with APol A8-35 as a model system for our crystallization studies. The first obtained crystals diffracted to 3 Å, while a new developed type of high throughput nanovolume crystallization, exploiting dry precipitants, shifted the observed X ray diffraction peaks beyond 2 Å. The structure of BR was solved to 2 Å and found to be indistinguishable from previous structures obtained with a detergent-solubilized protein. We suggest that the proposed protocol of in meso crystallization is generally applicable to APol-trapped MPs.The second, to a certain extent, complementary part of the present work was related to application of APols to the surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of MPs. SERS spectroscopy has been developed dramatically since its discovery in the 1970s. It is a powerful analytical tool for selective sensing of molecules adsorbed onto noble metal nanoparticles (NPs) and nanostructures, including at the single molecule (SM) level. Unfortunately, MPs studies are far away from the main stream of SERS applications due to the great handling difficulties resulting from the amphiphilic nature of MPs. The ability of APols to trap MPs and keep them soluble, stable and functional opens the way for highly interesting applications of SERS studies, possibly at the SM level. Thus, the second goal of this PhD thesis work was to prove our concept of feasibility of SERS with MPs trapped by APols. Using the same as in the crystallization studies model BR/A8-35 complexes and silver NP aggregates, the task was fulfilled to a degree enough to start with the SERS studies of MPs.The first chapter of the PhD thesis begins with general information about the importance of MP studies and the problems with their handling. Further in this chapter, a brief overview of APols, their properties and applications is presented. The largest part of the “Introduction” is dedicated to main points of different MP crystallization approaches and Raman spectroscopy, in particular SERS spectroscopy, and their applications to proteins. The end of the “Introduction” part presents the conclusions about APol application for X-ray crystallography and SERS spectroscopy studies of MPs, setting the main goals for the present work. The “Materials and methods” chapter consists of detailed description of the materials and protocols used in this study. The results of crystallization and SERS studies and their interpretations are presented as two different parts in the last “Results and discussions” chapter. The “Conclusions and perspectives” sections accompany each of these parts.

Les récepteurs de chimiokines sont des régulateurs essentiels de la migration cellulaire dans le cadre de la surveillance immunitaire, et le développement. Les récepteurs CCR5 et CXCR4 sont de plus spécifiquement impliqués dans les métastases cancéreuses et l'infection par le VIH. Nous avons développé un système permettant de sur-exprimer ces deux RCPGs. Afin de s'affranchir des problèmes de toxicité inhérents à l'expression des protéines membranaires en bactérie notre approche de production consiste à adresser les protéines vers les corps d'inclusion d'E. coli grâce à une fusion protéique N-terminale permettant de hauts niveaux d'expression. Après purification en conditions dénaturantes, les protéines sont alors repliées en présence de surfactants originaux, les amphipoles. La validation de cette nouvelle approche pour les récepteurs des chimiokines représente un des objectifs principaux de ce travail. Afin de tester la fonctionnalité des protéines repliées, une série d'outils a été développée : des versions modifiées des chimiokines ont été produites (RANTES pour CCR5 et SDF 1a pour CXCR4). La fonctionnalité des chimiokines a été évaluée au niveau moléculaire et cellulaire. L'interaction entre le récepteur replié en amphipole et son ligand a été testé par résonance de plasmons de surface (SPR). Différents types de surfaces fonctionalisées avec le récepteur de chimiokine replié en amphipole ont été explorés au cours de ce travail. A la fin de ce projet, la production des chimiokines et de leur récepteur a été mise au point. L'accès à ces outils ouvre la voie à de futures études moléculaires telles que la compréhension de la dimérisation du récepteur ou la détermination de la stoechiométrie du complexe. / Chemokine receptors are critical regulators of cell migration in the context of immune surveillance, inflammation and development. The GPCRs (G protein-coupled receptors) CCR5 and CXCR4 are specifically implicated in cancer metastasis and HIV-1 infection. An expression system to over-express these two GPCRs was developed. To overcome the toxicity problem of membrane protein expression in bacterial system, the production approach consists in targeting the proteins towards E. coli inclusion bodies thanks to a N-terminal fusion allowing a high yield expression. After purification under denaturing conditions, these GPCRs were then folded using original polymeric surfactants: the amphipols. The validation of this new approach for the chemokine receptor production is one of the goals of this work. In order to assess the functionality of the folded proteins, series of tools have been developed: engineered chemokine ligands (RANTES for CCR5 and SDF1a for CXCR4) were produced. The functionality of chemokines was evaluated at cellular and molecular levels. Interaction between the receptor folded in amphipols and its ligand was evaluated using Surface Plasmon Resonance (SPR) technique. Several types of surfaces, functionalized with the chemokine receptor/amphipol complex have been explored in this work. At the end of this project the productions of chemokines and their receptors has been set up. These established tools open the way to future studies, at the molecular level, in order to, for instance, investigate receptor dimerization and complex stoichiometry.