Les chaperonines sont des machines moléculaires impliquées dans la protection des protéines contre le mauvais repliement et l’agrégation. Ces macromolécules de tailleimportante (environ 1 MDa) sont présentes dans tous les domaines du vivant et sontorganisées en deux anneaux concentriques et empilés l’un sur l’autre, possèdent chacun une cavité en leur centre. Les chaperonines sont particulièrement intéressantes car peu caractérisées par rapport aux autres chaperones, notamment dû à leur grande taille et à leur complexité intrinsèque. Leur mécanisme d’action reste donc assez flou.Ce travail de thèse est centré sur l’étude de PhCPN, la chaperonine de Pyrococcushorikoshii, et son interaction avec différentes protéines substrats, grâce à une combinaison d’outils biochimiques et biophysiques tels que la RMN. En effet, la spectroscopie RMN est un outil particulièrement adapté à l’étude des interactions moléculaires transitoires à l’échelle atomique. L’utilisation dans ce cadre du marquage isotopique spécifique des groupements méthyles permet d’étudier des ensembles protéiques de taille importante tels que PhCPN, tandis que la RMN plus classique reste limitée à des poidsmoléculaires inférieurs à 30 kDa. Afin d’étudier le repliement des protéines à l’intérieur des cavités de PhCPN, deux protéines substrats de taille hétérogène et d’activité différentes ont été sélectionnées.En particulier, l’un de ces deux substrats (laMalate Synthase G ou MSG), formedes agrégats amorphes lorsqu’elle elle chauffée tandis que la seconde (l’Amyline) est capable de s’auto associer de manière plus organisée, créant des fibres amyloïdes de haut poids moléculaire. J’ai observé lors de cette étude que PhCPN est capable d’empêcher l’agrégation de ces deux substrats.En effet, la Chaperonine PhCPN est capable de se lier de manière irreversible à laproteine MSG, dépliée par une augmentation de la temperature, dans un ratio stoechiométrique 1/1. Le complexMSG/PhCPN a été isolé et characterisé. En particulier, la surface d’interaction entre PhCPN et cette large protéine substrat a été déterminée grâce à la RMN et la mciroscopie électronique.De plus, l’inhibition de la formation de fibres amyloïdes issues de l’Amyline parla Chaperonine a été étudiée par RMN et fluorescence de la ThT. Il a été notammentmontré que la Chaperonine retarde l’apparition des fibres amyloïdes, quelque soit l’état oligomerique de PhCPN. Le rôle de la Chaperonine sur les méchanismes de nucléation et d’élongation des fibres amyloïdes de l’Amylin a également été étudié. / Chaperonins are molecular machineries involved in the prevention of protein misfolding. These large macromolecules (approximately 1 MDa) are present in all domains of life and globally organized in two stacked rings on top of one another, hosting a cavity in their respective centers. By hydrolyzing ATP within their cavities, these rings can switch between twomajor structural states, an open and a closed conformation, to trap and refold misfolded proteins. Among the different types of molecular chaperones, chaperonins are of particular interest because their mechanism of action is not yet totally understood.This thesis focused on the study of PhCPN, the Chaperonin fromPyrococcus horikoshii,and its interaction with substrate proteins by various biochemical and biophysical techniques including NMR. In fact, NMR spectroscopy is a powerful tool to probe transient interactions in solution, at atomic resolution. Especially, specific isotope labeling of methyl groups is a technique of choice to study huge protein assemblies such as PhCPN chaperonin because they overcome the liquid-state NMR size limitation. To study the protein folding within the cavities of PhCPN, two different model substrate of various sizes and biological functions were selected. Particularly, one of these substrates (Malate Synthase G /MSG) forms amorphous aggregates when submitted to heat while the other (Amylin) is able to self-associate into amyloid fibrils. During this thesis, I have demonstrated that the Chaperonin PhCPN can prevent the aggregation of the chosen substrates.In fact, the PhCPN Chaperonin is able to irreversibly bind thermally unfoldedMSGin a 1/1 ratio. TheMSG/PhCPN complex was isolated and characterized. Especially, theinteraction surface between PhCPN and this large substrate protein was investigated using a combination of NMR and EM.In addition, the inhibition of the Amylin fibrillation by the Chaperonin was investigated using NMR and ThT fluorescence assays. It was shown that the Chaperonin delays the fibrils formation, no matter its oligomeric state. The role of the Chaperonin on the Amylin nucleation and fibril elongation mechanisms was investigated.

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement. / Amyloidosis is a progressive and, as of now, incurable disease caused by the deposition of insoluble proteins. Amyloid research over the past decades focused on the characterization of the substantive biological variability of amyloid deposits. Amyloidosis encompasses a diversity of pathological manifestations, explained by the diversity of underlying causal proteins. In the pancreas of susceptible species, islet amyloid polypeptide (IAPP) is a precursor for an amyloid protein (AIAPP), which has a characteristic fibrillar structure and resistance to physical agents. This folded protein deposits in the islets of Langerhans of patients with type 2 diabetes or islet cell tumors (insulinoma). Amyloid deposits have also been well characterized, anatomically, in feline and non-human primate species. Amyloid fibril formation contributes to the pathogenesis of diabetes mellitus but the precise pathophysiologic factors involved in the fibrillization of IAPP as well as resultant islet injury remain to be elucidated. Further understanding of the causative factors in the fibrillogenesis of IAPP will be requisite in the development of therapeutic strategies to disrupt the amyloidosis process. This project hypothesizes that the specific variations found in IAPP peptide sequences among different animal species are critical for IAPP fibrillization. Also, some aromatic/polyphenolic compounds can abrogate fibrillization. The main objective forms the basis for development of new therapeutic tactics to impede amyloid formation and associated cellular injury. Thus this project has two specific aims. The first specific aim was to identify critical variations in IAPP amino acid sequences from different animal species and to assess their amyloidogenic potential. To accomplish this, the IAPP gene was isolated and sequenced from paraffin-embedded tissues from various animals (40 species). The aggregation potency was assessed for each sequence using in silico analysis. A library of 23 peptides was prepared from sequences that were distinctly different and their amyloidogenic potential was assessed in vitro using physicochemical analysis (thioflavin-T assay, Congo red binding assay, far-UV circular dichroism, transmission electron microscopy) and cytotoxicity assays (insulinoma cell line INS-1). Among this peptide library, three were non-amyloidogenic and corresponded to the following animal species: golden lion tamarin (Leontopithecus rosalia), commun bottlenose dolphin (Tursiops truncates) and alpaca (Vicugna pacos). Segment 8-20 of the peptide was critical for amyloid formation and the substitution of the NFLVH motif found in this region by a DFLGR or KFLIR motif impeded fibrillization. The amino acids 29P, 14K and 18R were also demonstrated to abrogate fibril formation. The second objective consisted in abrogating IAPP fibrillogenesis using conceptualized aromatic/polyphenolic structures, specifically hypoglycemic, non-steroidal anti-inflammatory and aryl ethyl urea agents. This part of the project involved molecular screening of more than 60 compounds. Their efficacy at inhibiting amyloid formation was assessed in vitro on human IAPP, which exhibits the highest amyloidogenic potential. Techniques included the above-mentioned methods, with the addition of photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP). A total of 11 compounds showed potential in abrogating IAPP aggregation. Among the hypoglycemic agents evaluated, glyburide, repaglinide and troglitazone showed the highest potency in reducing fibril formation. The NSAIDs that displayed anti-amyloidogenic activity were diclofenac, meloxicam, phenylbutazone, sulindac and tenoxicam. EU-362 and EU-418 were the hit compounds resulting from the screening of the aryl ethyl urea (EU) class. Additionally, these anti-amyloidogenic molecules conferred a protection against fibril cytotoxicity. All of the active molecules bear a commun motif composed of benzene ring with electron donor moieties, such as alcohol, amine or halide. To conclude, this project characterized IAPP in several animal species in which it has not been previously described and improves our understanding of the amyloidogenesis process. Moreover, the therapeutic potential of hypoglycemic, non-steroidal anti-inflammatory and aryl ethyl ureas agents as anti-amyloidogenic compounds was evaluated. It is conceivable that the additional information hereby gained on the regulation of amyloidogenesis may point towards new therapeutic strategies for diabetic patients.