As anêmonas do mar utilizam um rico complexo protéico para capturar suas presas e para se defender de predadores. A peçonha, destes animais, contem neurotoxinas com ação em canais iônicos específicos e hemolisinas que atuam formando poros em membranas. No entanto, pouco se conhece sobre a atividade biológica de substâncias de baixo peso molecular isoladas da peçonha destes animais. Bunodosina 391 (BDS 391), um composto de baixo peso molecular isolado da peçonha da anêmona do mar Bunodosoma cangicum, apresenta atividade antinociceptiva periférica. Ensaios farmacológicos mostraram que a ação do BDS 391 é mediada pela ativação de receptores serotoninérgicos, histaminérgicos e pela abertura de canais de potássio. É interessante observar que o BDS 391 apresenta similaridade estrutural a 5-HT e histamina, o que torna de especial interesse a detecção do efeito antinociceptivo periférico para este composto. Os resultados obtidos nesse estudo poderão favorecer o melhor conhecimento sobre a fisiopatologia da dor e de seu controle, bem como o desenvolvimento de novos fármacos. / Animal toxins are directed against a wide variety of pharmacological targets, making them an invaluable source of ligands for studying the signaling pathways of pain and its control. Sea anemone venoms contain many biologically active compounds such as cytolysins (1820 kDa) and ion channel modulators (35 kDa). In addition, low molecular weight compounds have been isolated and identified in these venoms; however few studies have been carried out in order to determine the biological activity of such compounds. BDS 391 is a low molecular weight and non-peptidic compound purified from the Brazilian sea anemone Bunodosoma cangicum venom. Studies on the structure of BDS 391 have demonstrated that this compound is composed of a bromoindole group connected to histidine. Our recent data have indicated that BDS 391 administered by intraplantar route into the rat hind paw induces potent peripheral analgesia in models of acute and chronic pain. These study can to contribute to the better characterization of the pain pathway and your control.

A peçonha de anêmonas do mar é uma fonte conhecida de compostos bioativos, incluindo peptídeos, que atuam em canais voltagem-dependentes. Foram descritos 4 tipos de neurotoxinas de anêmonas do mar, que atuam em canais NaV e 4 tipos que atuam em canais KV. Essas toxinas têm permitido discriminar subtipos de canais voltagem-dependentes, estreitamente relacionados, e constituem poderosas ferramentas para estudar o funcionamento e estrutura desses canais. Neste estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos da fração neurotóxica da anêmona do mar Anthopleura cascaia. Esses peptídeos foram nomeados como AcaIII1425, AcaIII2970 e AcaIII3090, onde Aca faz referência a espécie e os números seguem os resultados obtidos nas etapas de purificação. A peçonha foi extraída por meio de estímulos elétricos e purificada por gel-filtração (Sephadex G-50) e fase reversa por HPLC (C-18). As massas moleculares foram obtidas por meio de MALDI-TOF, apresentando 3337,4 Da para a AcaIII1425, 4881,7 Da para a AcaIII2970 e 4880,5 Da para AcaIII3090. Através da técnica de voltage-clamp, esses peptídeos foram testados em diferentes subtipos de canais NaV e KV expressados em ovócito de Xenopus. As toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 retardam, de maneira seletiva, a inativação rápida dos subtipos rNaV1.3, mNaV1.6 e hNaV1.5, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. É importantemente salientar que, a AcaIII2970 e AcaIII3090 também foram examinadas no canal de inseto DmNaV1, revelando uma clara \"filo-seletividade\" na eficácia da atividade das toxinas. A AcaIII2970 e AcaIII3090 inibem fortemente a inativação do canal NaV de inseto, resultando em um aumento na amplitude do pico da corrente e removendo completamente a inativação rápida. Para quantificarmos essa \"filo-seletividade\", foram construídas curvas da dependência da concentração no retardo da inativação induzida pelas toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 nos canais em que apresentaram maior eficácia. Os IC50 foram obtidos após a plotagem dos dados em uma curva sigmoidal. Para a AcaIII2970, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 162,19 ± 11,22 nM, mNaV1.6 = 645,92 ± 18,52 nM, rNaV1.3 = 572,56 ± 44,96 nM. Para a AcaIII3090, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 99,03 ± 9,25 nM, mNaV1.6 = 158,30 ± 33,86 nM, rNaV1.3 = 371,60 ± 6,48 nM. A AcaIII1425 atua, bloqueando, de modo seletivo os subtipos rKV1.1, rKV1.6 e rKV4.3, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. Devido à maior especificidade da toxina AcaIII1425 pelos subtipos rKV1.1 e rKV1.6, foram realizados ensaios de bloqueio da corrente do canal em função da concentração da toxina (curva dose-resposta). Os valores de IC50 para os subtipos rKV1.1 e rKV1.6 são de 7642,98 ±1601,65 nM e 241,65 ±4,27 nM, respectivamente. Desta forma, a AcaIII1425 é cerca de 32 vezes mais potente em canais do subtipo rKV1.6 do que em relação aos canais do subtipo rKV1.1. A estrutura primária das toxinas foram determinadas por degradação de Edman. A sequência parcial da AcaIII2970 e AcaIII3090 revelou que estas são similares a toxinas de canal de sódio do tipo1 de anêmonas do mar. A sequência completa da AcaIII1425 não apresenta similaridade com toxinas de anêmonas do mar, mas é similar a toxinas de Conus e aranha que possuem um motivo estrutural conhecido como ICK. Dessa forma, propomos que a AcaIII1425 seja um novo grupo de toxinas de anêmonas do mar que bloqueiam KV. Dado o ineditismo da toxina AcaIII1425, foram feitos experimentos in silico para obtermos um maior refinamento do mecanismo de interação entre a toxina e o canal rKV1.6. Estes experimentos indicaram que diferentes regiões dos canais KV são importantes para a seletividade e potência da toxina, corroborando com as propostas que vem sendo descritas / The venom of sea anemones is a known source of bioactive compounds, including peptides that act on voltage-gated ion channels. Four types of neurotoxins from sea anemones, acting on NaV channels, and four types acting on KV channels, have been reported. These toxins have developed the ability to discriminate closely related subtypes of voltage-gated channels, making them powerful tools to studying the function and structure of these channels. In this study, we isolated and characterized three peptides of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia. These peptides were named as AcaIII1425, and AcaIII2970 AcaIII3090, where Aca refers to the species and the following numbers refer to results obtained in the purification steps. The venom was milked by electric shock and purified by molecular exclusion (Sephadex G-50) and reverse phase HPLC (C-18). Their molecular weights are 3337.4 Da to AcaIII1425, 4881.7 Da to AcaIII2970 and 4880.5 Da to AcaIII3090, obtained through a MALDI-TOF. Using the voltage-clamp technique, we have assayed the effects of these peptides on different subtypes of NaV and KV channels expressed in Xenopus oocytes. AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins selectively slow down the fast inactivation of rNaV1.3, mNaV1.6 and hNaV1.5 subtypes, while the other mammalian isoforms remained unaffected. Importantly, AcaIII2970 and AcaIII3090 were also examined in insect DmNaV1 channel, revealing a clear phyla-selectivity with regards to the efficacy of the toxin. AcaIII2970 and AcaIII3090 strongly inhibit the inactivation of the insect NaV channel, resulting in an increase in the amplitude of the peak current, and complete removal of the fast and steady-state inactivation. In order to quantify this \"phyla-selectivity\", curves of the concentration dependence of the delayed inactivation induced by AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins channels with higher efficacy, were built. After plotting the data on a sigmoidal curve the IC50 values were obtained. For AcaIII2970, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 162.19 ± 11.22 nM, mNaV1.6 = 645.92 ± 18.52 nM and rNaV1.3 = 572.56 ± 44.96 nM. For AcaIII3090, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 99.03 ± 9.25 nM, mNaV1.6 = 158.30 ± 33.86 nM and rNaV1.3 = 371.60 ± 6.48 nM. AcaIII1425 acts, selectively, blocking rKV1.1, rKV1.6 and rKV4.3 subtypes, while the others isoforms tested remained unaltered. Due the higher specificity of AcaIII1425 to rKV1.1 and rKV1.6 subtypes, assays were performed to evaluate the blocking channel current versus toxin concentration (dose-response curve). IC50 values for the subtypes rKV1.6 and rKV1.1 are 7642.98 ± 1601.65 nM and 241.65 ± 4.27 nM, respectively. Thus, AcaIII1425 is about 32 times more potent in the rKV1.6 than in the rKV1.1 channel. The primary structure of the toxins was determined by the Edman degradation. The partial sequence of AcaIII2970 and AcaIII3090 revealed that these toxins are similar to the type 1 sodium channel sea anemones neurotoxins. The complete sequence of AcaIII1425 has no similarity with other sea anemone toxins, but is similar to the Conus and spider neurotoxins which have a structural motif known as ICK. Thus, we propose that AcaIII1425 comprises a new group of sea anemones toxins that block KV channels. Given the unprecedented nature of the toxin AcaIII1425, in silico assays were carried out in order to further refining the proposed mechanism underlying the interaction between the toxin and the rKV1.6 channel. The results indicate that, in agreement to what has been proposed elsewhere, different regions of the KV channels are important for the toxin selectivity and potency

A peçonha das anêmonas do mar é uma fonte de compostos bioativos, incluindo toxinas peptídicas que são ferramentas para o estudo da estrutura e função dos canais voltagem dependentes de K+ (KV). Neste trabalho, quatro neurotoxinas foram purificadas da peçonha das anêmonas do mar Actinia bermudenesis e Bunodosoma caissarum. AbeTx1 e BcsTx4 possuem um motivo estrutural semelhante à das \"kappa-toxinas\" e análises funcionais e estruturais permitiram concluir que são os primeiros membros de um novo (tipo 5) de neurotoxinas de anêmonas do mar que atuam em canais KV. Por sua vez, a similaridade estrutural das toxinas BcsTx 1 e BcsTx2 nos permitiu inferir que estas são membros do já descrito tipo 1 (subtipo 1b) de neurotoxinas de anêmona que também atuam em canais KV. A caracterização funcional foi realizada utilizando-se diferentes subtipos de canais KV, expressos em ovócitos de Xenopus laevis e as medidas eletrofisiológicas foram feitas empregando-se a técnica de \"voltage-clamp\" com dois microelétrodos. AbeTx1, BcsTx1 e BcsTx2 (3 μM) apresentaram uma seletividade de atividade para os subtipos de KV1.1-KV1.3, KV1.6 e Shaker IR, ao passo que a BcsTx4 (3 μM) é somente capaz de bloquear a corrente dos subtipos de KV1.1, KV1.2 e KV1.6. Os mecanismos de ação envolvidos na seletividade da atividade e na potência com que estas se ligam aos seus alvos biológicos foram discutidos com base nos resultados obtidos e análises fisiológicas permitiram propor que estas toxinas atuam como \"armas\" para defesa contra predadores e/ou para captura de presas / The sea anemones venom is a rich source of bioactive compounds, including peptide toxins which are tools for studying the structure and function of voltage-dependent channels K+ (KV). In this work, four neurotoxins were purified from the venom of the sea anemones Actinia bermudenesis and Bunodosoma caissarum. AbeTx1 and BcsTx4 have a structural motif similar to that of kappa-toxins and functional and structural analysis showed that they are the first members of a new type (type 5) of sea anemone neurotoxins acting on KV channels. Moreover, the structural analysis of BcsTx1 and BcsTx2 toxins allowed us to conclude that they are members of the previously described type 1 (subtype 1b) of sea anemone neurotoxins. Functional characterization was performed by means of a wide electrophysiological screening on different KV channels using oocytes of Xenopus laevis and electrophysiological measurements were performed employing the voltage-clamp technique. AbeTx1, BcsTx1 and BcsTx2 (μM) showed a selective activity for KV1.1-KV1.3, KV1.6 and Shaker IR, while BcsTx4 (3 μM) only blocks KV1.1, KV1.2 and KV1.6. The mechanisms involved in potency and selectivity were discussed based on the results obtained and physiological analyses have provided new insights on the role of these toxins in the physiology of the sea anemones