Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:40:31Z : No. of bitstreams: 1 souza_bm_dr_rcla.pdf: 2198506 bytes, checksum: e0710a5511f60c3053d26f8713b6478b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização estrutural e funcional de alguns peptídeos da classe dos mastoparanos de vespas, que apresentam diferentes padrões de anfipaticidade, em função das diferentes seqüências de aminoácidos que cada um possui. Os peptídeos foram manualmente sintetizados, utilizando-se estratégia Fmoc, e purificados através de técnicas de cromatografia líquida de alta performance. Após a obtenção do material sintético, foram realizadas análises de espectrometria de massas ESI-MS, para monitoração do controle de qualidade. A estrutura secundária foi investigada com o uso de espectroscopia de dicroísmo circular. Além disso, foram realizadas as modelagens moleculares e dinâmica dos peptídeos para análise de suas trajetórias. Foram feitos ensaios para investigar a interação desses peptídeos com membranas fosfolipídicas sintéticas (lipossomos), sendo esta interação, monitorada por medidas de dicroísmo circular e de troca isotópica H/D combinada com espectrometria de massas. Além disto, foram realizados ensaios de atividades biológicas de cada um dos peptídeos, onde foram testadas as atividades de degranulação de mastócitos, hemólise e antibiose. Os dados de Dicroísmo Circular revelaram que todos os peptídeos possuem a tendência de se estruturar em hélice-a quando em ambientes hidrofóbicos, ou em contato com membranas. Além disso, a presença de fosfolipídios ácidos nas membranas aumenta a interação eletrostática destas com peptídeos positivamente carregados. Os estudos de dinâmica molecular em meio aquoso mostraram alta flexibilidade estrutural dos peptídeos e uma variedade de estados conformacionais, em que predominam conformações randômicas, sem, contudo deixar de apresentar alguma porção helicoidal. Além disso, foi mostrado que esses peptídeos possuem caráter anfifílico quando estruturados em hélice. / The aim of the present investigation was to study the structure/activity relationship of a series of mastoparan-like peptides presenting different patterns of amphipathicit given by their distinct amino acid sequences. The peptides were manually synthesized by using Fmoc strategy and purified under HPLC. The synthetic material homogeneity was analyzed by ESI mass spectrometry and Edman Degradation Chemistry. The secondary structure was investigated through circular dichroism (CD) spectroscopy. In addiction, the secondary structures were modeled and their structural trajectories observed through Molecular Dynamics. The interaction of peptides with membranes was investigated through the combination of synthetic vesicles with H/D exchange and ESI-mass spectrometry. Some biological activities, like: mast cell degranulation, hemolysis and antibiosis were investigated for all the peptides. The CD spectra revealed that the peptides in presence of hydrophobic environment or in presence of biological membranes have the tendency to form helix conformations. Highly organized structures were not observed in aqueous or buffer solutions, however, the peptides always presented some tendency to form helices. The mastoparans interacts strongly and preferentially with the charged PG headgroups. The positive charges of these peptides enable selective binding to bacterial membranes through electrostatic interactions. The molecular dynamic studies of the peptides in water solvent revealed that all the peptides have high structural flexibility and many conformational states. Probably, these molecules assume different conformational states depending on the environment. In addition, it has been shown that the helical conformation gives the amphipathic feature to these peptides. The insertion and orientation of the mastoparan in the bilayer environment was investigated by H/D exchange, combined with mass spectrometry analysis.

A dengue é a mais importante arbovirose no mundo; aproximadamente 50 milhões de infecções ocorrem anualmente acarretando 500.000 casos de dengue hemorrágica e 22.000 mortes. A febre amarela é uma doença hemorrágica viral com elevada mortalidade que é transmitida por mosquitos. Vacinas eficazes contra a febre amarela já estão disponíveis há quase 70 anos e são responsáveis por uma redução significativa de ocorrências da doença no mundo, no entanto, cerca de 200.000 casos de febre amarela ainda ocorrem anualmente, principalmente na África. Dessa forma, o desenvolvimento de fármacos antivirais contra essas viroses é uma prioridade de saúde pública. Os produtos naturais sejam de origem vegetal ou animal, possuem uma extensa diversidade química, sendo uma fonte inesgotável de compostos com promissoras atividades biológicas. No Brasil, é grande a incidência de animais venenosos ou peçonhentos, tais como serpentes, sapos e escorpiões. Os venenos desses animais são fontes de diversas substâncias químicas que ainda não possuem a sua atividade biológica e farmacológica completamente estudada. Neste trabalho avaliamos a potencial ação antiviral de peçonhas de serpentes (Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops brasili e Bothrops fonseca) e escorpião (Tityus serrulatus) contra os virus da febre amarela e dengue usando diferentes estratégias metodológicas (pré-tratamento, pós-tratamento, virucida, adsorção e internalização). Primeiramente realizamos um screening com as peçonhas brutas, observando que a peçonha de Crotalus durissus terrificus inibiu a replicação viral apresentando os maiores índices de seletividade (IS). Crotoxina, crotamina, crotapotina, convulxina, giroxina, PLA2-CB e PLA2-IC, isoladas de Crotalus durissus terrificus, foram então testadas nas diferentes estratégias metodológicas contra os vírus dengue e febre amarela. Foi possível verificar que crotoxina, PLA2-CB e PLA2-IC inibiram a replicação viral com altos índices de seletividade (IS). A ação verificada ocorreu na fase inicial do ciclo de replicação viral (pré-tratamento, virucida, adsorção). A ação antiviral verificada neste estudo foi atribuida a ação da PLA2, visto que a crotoxina é um complexo protéico composto pela crotapotina e pela PLA2-CB. Posteriormente avaliamos uma fosfolipase sem atividade catalítica isolada de Bothrops jararacussu, a BthTX-I. Essa fosfolipase apresentou baixa inibição da replicação viral, sugerindo que a atividade catalítica da fosfolipase é importante, mas possivelmente não a única responsável pela ação antiviral. Os resultados obtidos permitem sugerir também que as fosfolipases apresentam ação tanto sobre a partícula viral quanto sobre receptores celulares, o que justifica os altos índices de seletividade observados. / Dengue is the most important arbovirus disease in the world; nearly 50 million infections occur annually resulting in 500,000 cases of DHF and 22,000 deaths. Yellow fever is a viral haemorrhagic fever with high mortality that is transmitted by mosquitoes. Effective vaccines against yellow fever have been available for almost 70 years and are responsible for a significant reduction of the disease worldwide. However, about 200,000 cases of yellow fever still occur annually, mainly in Africa. Thus, the development of antiviral drugs against these viruses is a public health priority. Natural products of plant or animal origin have an extensive chemical diversity, and an inexhaustible source of compounds with promising biological activities. In Brazil, there is a high incidence of poisonous or venomous animals such as snakes, frogs and scorpions occur. The venoms of these animals are a source of several chemicals that does not possess biological and pharmacological activity completely studied. In this study, we assess the potential antiviral action of snake venom (Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops brasili and Bothrops fonseca) and Scorpion (Tityus serrulatus) against yellow fever and dengue viruses using different methodological strategies (pre-treatment, post-treatment, virucidal, adsorption and internalization). First, we performed a screening with the crude venoms, founding that the venom of Crotalus durissus terrificus inhibited viral replication showing the highest selectivity index (SI). Crotoxin crotamin, crotapotin, convulxin, gyroxin, PLA2-CB and PLA2-IC isolated from Crotalus durissus terrificus, were then tested in the different methodological strategies against dengue and yellow fever viruses. We found that crotoxin, PLA2-CB and PLA2-IC inhibited viral replication with high SI. The action of these compounds against the virus was at the first steps of the replication cycle (pre-treatment, virucidal, adsorption). The antiviral action observed in this study was attributed to the action of PLA2, since crotoxin is a protein complex composed of crotapotin and PLA2-CB. Afterwards, we evaluated a phospholipase without catalytic activity isolated from Bothrops jararacussu, the BthTX-I. This phospholipase showed low inhibition of viral replication, showing that the catalytic activity of phospholipase is important, but perhaps not the only one responsible for the antiviral action. Our results also suggest that phospholipases have action on the viral particle and on cell receptors, which explains the high levels of selectivity observed.

A dengue é a mais importante arbovirose no mundo; aproximadamente 50 milhões de infecções ocorrem anualmente acarretando 500.000 casos de dengue hemorrágica e 22.000 mortes. A febre amarela é uma doença hemorrágica viral com elevada mortalidade que é transmitida por mosquitos. Vacinas eficazes contra a febre amarela já estão disponíveis há quase 70 anos e são responsáveis por uma redução significativa de ocorrências da doença no mundo, no entanto, cerca de 200.000 casos de febre amarela ainda ocorrem anualmente, principalmente na África. Dessa forma, o desenvolvimento de fármacos antivirais contra essas viroses é uma prioridade de saúde pública. Os produtos naturais sejam de origem vegetal ou animal, possuem uma extensa diversidade química, sendo uma fonte inesgotável de compostos com promissoras atividades biológicas. No Brasil, é grande a incidência de animais venenosos ou peçonhentos, tais como serpentes, sapos e escorpiões. Os venenos desses animais são fontes de diversas substâncias químicas que ainda não possuem a sua atividade biológica e farmacológica completamente estudada. Neste trabalho avaliamos a potencial ação antiviral de peçonhas de serpentes (Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops brasili e Bothrops fonseca) e escorpião (Tityus serrulatus) contra os virus da febre amarela e dengue usando diferentes estratégias metodológicas (pré-tratamento, pós-tratamento, virucida, adsorção e internalização). Primeiramente realizamos um screening com as peçonhas brutas, observando que a peçonha de Crotalus durissus terrificus inibiu a replicação viral apresentando os maiores índices de seletividade (IS). Crotoxina, crotamina, crotapotina, convulxina, giroxina, PLA2-CB e PLA2-IC, isoladas de Crotalus durissus terrificus, foram então testadas nas diferentes estratégias metodológicas contra os vírus dengue e febre amarela. Foi possível verificar que crotoxina, PLA2-CB e PLA2-IC inibiram a replicação viral com altos índices de seletividade (IS). A ação verificada ocorreu na fase inicial do ciclo de replicação viral (pré-tratamento, virucida, adsorção). A ação antiviral verificada neste estudo foi atribuida a ação da PLA2, visto que a crotoxina é um complexo protéico composto pela crotapotina e pela PLA2-CB. Posteriormente avaliamos uma fosfolipase sem atividade catalítica isolada de Bothrops jararacussu, a BthTX-I. Essa fosfolipase apresentou baixa inibição da replicação viral, sugerindo que a atividade catalítica da fosfolipase é importante, mas possivelmente não a única responsável pela ação antiviral. Os resultados obtidos permitem sugerir também que as fosfolipases apresentam ação tanto sobre a partícula viral quanto sobre receptores celulares, o que justifica os altos índices de seletividade observados. / Dengue is the most important arbovirus disease in the world; nearly 50 million infections occur annually resulting in 500,000 cases of DHF and 22,000 deaths. Yellow fever is a viral haemorrhagic fever with high mortality that is transmitted by mosquitoes. Effective vaccines against yellow fever have been available for almost 70 years and are responsible for a significant reduction of the disease worldwide. However, about 200,000 cases of yellow fever still occur annually, mainly in Africa. Thus, the development of antiviral drugs against these viruses is a public health priority. Natural products of plant or animal origin have an extensive chemical diversity, and an inexhaustible source of compounds with promising biological activities. In Brazil, there is a high incidence of poisonous or venomous animals such as snakes, frogs and scorpions occur. The venoms of these animals are a source of several chemicals that does not possess biological and pharmacological activity completely studied. In this study, we assess the potential antiviral action of snake venom (Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararacussu, Bothrops jararaca, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops brasili and Bothrops fonseca) and Scorpion (Tityus serrulatus) against yellow fever and dengue viruses using different methodological strategies (pre-treatment, post-treatment, virucidal, adsorption and internalization). First, we performed a screening with the crude venoms, founding that the venom of Crotalus durissus terrificus inhibited viral replication showing the highest selectivity index (SI). Crotoxin crotamin, crotapotin, convulxin, gyroxin, PLA2-CB and PLA2-IC isolated from Crotalus durissus terrificus, were then tested in the different methodological strategies against dengue and yellow fever viruses. We found that crotoxin, PLA2-CB and PLA2-IC inhibited viral replication with high SI. The action of these compounds against the virus was at the first steps of the replication cycle (pre-treatment, virucidal, adsorption). The antiviral action observed in this study was attributed to the action of PLA2, since crotoxin is a protein complex composed of crotapotin and PLA2-CB. Afterwards, we evaluated a phospholipase without catalytic activity isolated from Bothrops jararacussu, the BthTX-I. This phospholipase showed low inhibition of viral replication, showing that the catalytic activity of phospholipase is important, but perhaps not the only one responsible for the antiviral action. Our results also suggest that phospholipases have action on the viral particle and on cell receptors, which explains the high levels of selectivity observed.

As anêmonas do mar utilizam um rico complexo protéico para capturar suas presas e para se defender de predadores. A peçonha, destes animais, contem neurotoxinas com ação em canais iônicos específicos e hemolisinas que atuam formando poros em membranas. No entanto, pouco se conhece sobre a atividade biológica de substâncias de baixo peso molecular isoladas da peçonha destes animais. Bunodosina 391 (BDS 391), um composto de baixo peso molecular isolado da peçonha da anêmona do mar Bunodosoma cangicum, apresenta atividade antinociceptiva periférica. Ensaios farmacológicos mostraram que a ação do BDS 391 é mediada pela ativação de receptores serotoninérgicos, histaminérgicos e pela abertura de canais de potássio. É interessante observar que o BDS 391 apresenta similaridade estrutural a 5-HT e histamina, o que torna de especial interesse a detecção do efeito antinociceptivo periférico para este composto. Os resultados obtidos nesse estudo poderão favorecer o melhor conhecimento sobre a fisiopatologia da dor e de seu controle, bem como o desenvolvimento de novos fármacos. / Animal toxins are directed against a wide variety of pharmacological targets, making them an invaluable source of ligands for studying the signaling pathways of pain and its control. Sea anemone venoms contain many biologically active compounds such as cytolysins (1820 kDa) and ion channel modulators (35 kDa). In addition, low molecular weight compounds have been isolated and identified in these venoms; however few studies have been carried out in order to determine the biological activity of such compounds. BDS 391 is a low molecular weight and non-peptidic compound purified from the Brazilian sea anemone Bunodosoma cangicum venom. Studies on the structure of BDS 391 have demonstrated that this compound is composed of a bromoindole group connected to histidine. Our recent data have indicated that BDS 391 administered by intraplantar route into the rat hind paw induces potent peripheral analgesia in models of acute and chronic pain. These study can to contribute to the better characterization of the pain pathway and your control.

As anêmonas do mar utilizam um rico complexo protéico para capturar suas presas e para se defender de predadores. A peçonha, destes animais, contem neurotoxinas com ação em canais iônicos específicos e hemolisinas que atuam formando poros em membranas. No entanto, pouco se conhece sobre a atividade biológica de substâncias de baixo peso molecular isoladas da peçonha destes animais. Bunodosina 391 (BDS 391), um composto de baixo peso molecular isolado da peçonha da anêmona do mar Bunodosoma cangicum, apresenta atividade antinociceptiva periférica. Ensaios farmacológicos mostraram que a ação do BDS 391 é mediada pela ativação de receptores serotoninérgicos, histaminérgicos e pela abertura de canais de potássio. É interessante observar que o BDS 391 apresenta similaridade estrutural a 5-HT e histamina, o que torna de especial interesse a detecção do efeito antinociceptivo periférico para este composto. Os resultados obtidos nesse estudo poderão favorecer o melhor conhecimento sobre a fisiopatologia da dor e de seu controle, bem como o desenvolvimento de novos fármacos. / Animal toxins are directed against a wide variety of pharmacological targets, making them an invaluable source of ligands for studying the signaling pathways of pain and its control. Sea anemone venoms contain many biologically active compounds such as cytolysins (1820 kDa) and ion channel modulators (35 kDa). In addition, low molecular weight compounds have been isolated and identified in these venoms; however few studies have been carried out in order to determine the biological activity of such compounds. BDS 391 is a low molecular weight and non-peptidic compound purified from the Brazilian sea anemone Bunodosoma cangicum venom. Studies on the structure of BDS 391 have demonstrated that this compound is composed of a bromoindole group connected to histidine. Our recent data have indicated that BDS 391 administered by intraplantar route into the rat hind paw induces potent peripheral analgesia in models of acute and chronic pain. These study can to contribute to the better characterization of the pain pathway and your control.