O estudo de agregados anfifílicos é de extrema importância devido à sua mimetização de membranas celulares, que são essenciais para a vida da célula. Sabe-se que os fosfolipídios não possuem estruturas moleculares bem definidas nas membranas, porém exercem um papel essencial na manutenção da sua integridade. Fosfolipídios zwitteriônicos são um dos principais componentes estruturais das membranas celulares, e um modelo simplificado destas membranas são as bicamadas que estes fosfolipídios podem formar em meio aquoso. A principal característica destas bicamadas lipídicas é a auto-organização dos lipídios, fazendo-se necessário o estudo de processos naturais e espontâneos, como suas propriedades estruturais e dinâmicas. A espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada no estudo de diversos processos e sistemas de interesse biológico, principalmente por medidas de anisotropia de fluorescência, que fornece informações sobre a dinâmica rotacional das sondas fluorescentes inseridas nos sistemas de interesse, refletindo efeitos combinados de flexibilidade, fluidez e interações estáticas com moléculas circundantes. Neste trabalho examinamos as propriedades estruturais e dinâmicas de membranas modelo fosfolipídicas formadas de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) por técnicas relacionadas à espectroscopia de fluorescência, principalmente por medidas de anisotropia do estado estacionário e resolvida no tempo, das sondas fluorescentes 1,6-diphenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-il (NBD) ligado em diferentes regiões das moléculas fosfolipídicas e também da sonda lipofílica 2-amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba). As medidas foram realizadas tanto acima como abaixo da temperatura de transição de fase das bicamadas fosfolipídicas de DPPC, na fase gel e líquido-cristalina, devido à diferença da organização lateral das cadeias de hidrocarboneto nestas duas fases. Medidas de espalhamento dinâmico de luz foram realizadas para confirmar a formação das vesículas unilamelares pelo processo de extrusão da suspensão lipídica contendo vesículas multilamelares, e a técnica de calorimetria diferencial de varredura foi empregada para verificar se baixa concentração das sondas fluorescentes nas vesículas afetam seu empacotamento lipídico. Pelos resultados obtidos, constatamos que os comportamentos das três sondas fluorescentes diferem em ambas as fases das bicamadas fosfolipídicas, revelando suas propriedades estruturais e dinâmicas, principalmente pelas diferentes localizações dos fluoróforos. Verificamos que, devido à afinidade pela região hidrofóbica, o movimento do DPH é restrito ao movimento \"wobbling\", limitado pelas cadeias alifáticas. Para o NBD em lipídios marcados, o movimento do análogo fluorescente como um todo depende da localização do fluoróforo e de sua conformação em ambas as fases das bicamadas lipídicas. Devido à localização do grupo fluorescente da sonda Ahba na interface das bicamadas lipídicas, verificamos que seu movimento rotacional aumenta à medida que a bicamada torna-se mais fluida, mostrando uma dependência deste movimento com a microviscosidade destas bicamadas. / The study of amphiphilic aggregates is extremely important due to their cell membrane mimic, which are essential for the life of the cell. It is known that phospholipids do not have molecular structure well defined in membranes, but play an essential role in maintaining of their integrity. Zwitterionic phospholipids are one of the main components of cell membranes, and a simplified model for the membranes are the bilayers they can form in aqueous medium. The main characteristic of lipid bilayers is the self-organization of lipids, making it necessary to study natural and spontaneous process, as their structural and dynamical properties. The fluorescence spectroscopy has been used to study many processes and systems of biological interest, especially by measurement of fluorescence anisotropy, which gives information about the rotational dynamics of the fluorescent probe inserted in the systems of interest, reflecting the combined effects of flexibility, fluidity and static interactions with surrounding molecules. In this work we examined the structural and dynamic properties of phospholipid model membranes formed of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocoline DPPC by techniques related to fluorescence spectroscopy, mainly by measurements of steady-state and time resolved anisotropy of the probes 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-yl (NBD) attached to different regions of phospholipid molecules and also the lipophilic probe 2-amino-N-hexadecyl-benzamide (Ahba). The measurements were perfomed above and below of the phase transition temperature of the phospholipid bilayers of DPPC, gel and liquid-crystalline phase, due to the difference in the lateral organization of hydrocarbon chains in these two phases. Measures of dynamic light scattering (DLS) was performed to confirm the formation of the unilamellar vesicles by extrusion of lipid suspension containing multilamellar vesicles, and the technique of differential scanning calorimetry (DSC) was used to verify if the low concentration of fluorescent probes in lipid vesicles affect its packing. From the results, we found that the behavior of the three different fluorescent probes differ in both phases of phospholipid bilayers, revealing their structural and dynamic properties, mainly because to specific locations of the fluorophores. We verify that, due to the affinity for the hydrophobic region, the motion of the DPH is restricted to the \"wobbling\" motion, limited by hydrocarbon chains. For the NBD labeled in lipids, the motion of the fluorescent analogues as a whole depends on the location of the fluorophore and on the lipid conformation in both phases of lipid bilayers. Because of the location of the fluorescent group of the probe Ahba in the interface of lipid bilayers, we found that its rotational motion increases as the bilayers becomes more fluid, showing a dependency of the motion with the microviscosity of these bilayers.

Experimentalmente, a transição entre as fases gel e gel-líquida de bicamadas fosfolipídicas pode ser mensurada por técnicas de anisotropia de fluorescência. A partir de uma sonda interna à membrana, a diferença entre as radiações absorvida e emitida, causada pela rotação da sonda no intervalo de fluorescência, relaciona-se com a fluidez da membrana. Com esta técnica aplicada à sondas DPH, foi encontrada influência do líquido iônico (LI) C14MImCl na temperatura de transição de fase de fosfolipídios carregados (DPPG), mas não nos casos neutros (DPPC e DMPC). A temperatura de transição para DPPG apresenta queda de 45oC, em estado puro, para 26oC com concentração de 30%mol de LI. Neste estudo, simulações de dinâmica molecular foram conduzidas de forma a descrever as interações de LI com os fosfolipídios de bicamadas em dois casos, DPPC e DPPG, e de analisar o comportamento dinâmico da sonda. Diferentes condições iniciais de mistura entre lipídios e LI foram consideradas nas simulações. Os resultados indicam que, quando misturadas aleatoriamente, ambos os lipídios apresentam agregação espontânea, evoluindo para forma lamelar com LI distribuído uniformemente. Quando uniformemente distribuído, o LI diminuí a interação entre lipídios e outras moléculas do sistema nos dois casos, porém com maior intensidade em DPPG devido à repulsão dos contra íons catiônicos (Na+) do lipídio, enquanto que em DPPC os contra íons aniônicos provenientes do LI (Cl-) mantém-se perto da interface. O comportamento da sonda foi qualitativamente reproduzido e visto ser altamente correlacionado com a fluidez das caudas, medida por meio do parâmetro de ordem deutérica. Por conta da equivalência das caudas entre DPPC e DPPG, encontrou-se omportamento similar nos dois sistemas. / The gel-liquid phase transition of phospholipid bilayers can be experimentally measured via fluorescence anisotropy techniques. Using a fluorescent probe within the membrane, the difference between absorbed and emitted radiation due to rotational movement can be related to the bilayer fluidity. The use of the fluorescent probe DPH shows the influence of the ionic liquid (IL) C14MImCl on the phase transition temperature of charged lipids (DPPG) but not neutral ones (DPPC and DMPC). The phase transition temperature for DPPG bilayers dropped from 45oC, in pure state, to 26oC, with 30%mol concentration of IL. In this study, molecular dynamics (MD) simulations were performed in order to describe the IL interactions with the phospholipids in the membranes for two cases, DPPG and DPPC, and to analyze the dynamical behavior of the probe. Different initial conditions of the mixture between IL and lipids were considered in the simulations. The results indicate that in random initial conditions, both lipids spontaneously aggregates with the IL into a bilayer shape with IL uniformly distributed across it. The uniform distribution of IL in the membranes decreased the total interaction of the lipids and the other molecules in the system for both cases, but with higher influence in DPPG due to repulsion of cationic counter ions from the lipids (Na+), whereas in DPPC the anionic counter ions from IL (Cl-) remained closer to the bilayer interface. The probe behavior was qualitatively verified and found to be highly correlated with the lipid tails fluidity, through the calculated Deuter order parameter. Because of tails equivalence between the DPPG and DPPC, it was found a similar behavior of the probe in both systems.

O estudo de agregados anfifílicos é de extrema importância devido à sua mimetização de membranas celulares, que são essenciais para a vida da célula. Sabe-se que os fosfolipídios não possuem estruturas moleculares bem definidas nas membranas, porém exercem um papel essencial na manutenção da sua integridade. Fosfolipídios zwitteriônicos são um dos principais componentes estruturais das membranas celulares, e um modelo simplificado destas membranas são as bicamadas que estes fosfolipídios podem formar em meio aquoso. A principal característica destas bicamadas lipídicas é a auto-organização dos lipídios, fazendo-se necessário o estudo de processos naturais e espontâneos, como suas propriedades estruturais e dinâmicas. A espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada no estudo de diversos processos e sistemas de interesse biológico, principalmente por medidas de anisotropia de fluorescência, que fornece informações sobre a dinâmica rotacional das sondas fluorescentes inseridas nos sistemas de interesse, refletindo efeitos combinados de flexibilidade, fluidez e interações estáticas com moléculas circundantes. Neste trabalho examinamos as propriedades estruturais e dinâmicas de membranas modelo fosfolipídicas formadas de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) por técnicas relacionadas à espectroscopia de fluorescência, principalmente por medidas de anisotropia do estado estacionário e resolvida no tempo, das sondas fluorescentes 1,6-diphenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-il (NBD) ligado em diferentes regiões das moléculas fosfolipídicas e também da sonda lipofílica 2-amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba). As medidas foram realizadas tanto acima como abaixo da temperatura de transição de fase das bicamadas fosfolipídicas de DPPC, na fase gel e líquido-cristalina, devido à diferença da organização lateral das cadeias de hidrocarboneto nestas duas fases. Medidas de espalhamento dinâmico de luz foram realizadas para confirmar a formação das vesículas unilamelares pelo processo de extrusão da suspensão lipídica contendo vesículas multilamelares, e a técnica de calorimetria diferencial de varredura foi empregada para verificar se baixa concentração das sondas fluorescentes nas vesículas afetam seu empacotamento lipídico. Pelos resultados obtidos, constatamos que os comportamentos das três sondas fluorescentes diferem em ambas as fases das bicamadas fosfolipídicas, revelando suas propriedades estruturais e dinâmicas, principalmente pelas diferentes localizações dos fluoróforos. Verificamos que, devido à afinidade pela região hidrofóbica, o movimento do DPH é restrito ao movimento \"wobbling\", limitado pelas cadeias alifáticas. Para o NBD em lipídios marcados, o movimento do análogo fluorescente como um todo depende da localização do fluoróforo e de sua conformação em ambas as fases das bicamadas lipídicas. Devido à localização do grupo fluorescente da sonda Ahba na interface das bicamadas lipídicas, verificamos que seu movimento rotacional aumenta à medida que a bicamada torna-se mais fluida, mostrando uma dependência deste movimento com a microviscosidade destas bicamadas. / The study of amphiphilic aggregates is extremely important due to their cell membrane mimic, which are essential for the life of the cell. It is known that phospholipids do not have molecular structure well defined in membranes, but play an essential role in maintaining of their integrity. Zwitterionic phospholipids are one of the main components of cell membranes, and a simplified model for the membranes are the bilayers they can form in aqueous medium. The main characteristic of lipid bilayers is the self-organization of lipids, making it necessary to study natural and spontaneous process, as their structural and dynamical properties. The fluorescence spectroscopy has been used to study many processes and systems of biological interest, especially by measurement of fluorescence anisotropy, which gives information about the rotational dynamics of the fluorescent probe inserted in the systems of interest, reflecting the combined effects of flexibility, fluidity and static interactions with surrounding molecules. In this work we examined the structural and dynamic properties of phospholipid model membranes formed of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocoline DPPC by techniques related to fluorescence spectroscopy, mainly by measurements of steady-state and time resolved anisotropy of the probes 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-yl (NBD) attached to different regions of phospholipid molecules and also the lipophilic probe 2-amino-N-hexadecyl-benzamide (Ahba). The measurements were perfomed above and below of the phase transition temperature of the phospholipid bilayers of DPPC, gel and liquid-crystalline phase, due to the difference in the lateral organization of hydrocarbon chains in these two phases. Measures of dynamic light scattering (DLS) was performed to confirm the formation of the unilamellar vesicles by extrusion of lipid suspension containing multilamellar vesicles, and the technique of differential scanning calorimetry (DSC) was used to verify if the low concentration of fluorescent probes in lipid vesicles affect its packing. From the results, we found that the behavior of the three different fluorescent probes differ in both phases of phospholipid bilayers, revealing their structural and dynamic properties, mainly because to specific locations of the fluorophores. We verify that, due to the affinity for the hydrophobic region, the motion of the DPH is restricted to the \"wobbling\" motion, limited by hydrocarbon chains. For the NBD labeled in lipids, the motion of the fluorescent analogues as a whole depends on the location of the fluorophore and on the lipid conformation in both phases of lipid bilayers. Because of the location of the fluorescent group of the probe Ahba in the interface of lipid bilayers, we found that its rotational motion increases as the bilayers becomes more fluid, showing a dependency of the motion with the microviscosity of these bilayers.

Receptores nucleares formam uma superfamília de proteínas responsáveis pela regulação da expressão de genes. Estruturalmente, são formados por três domínios: um domínio N-terminal bastante variável, um domínio altamente conservado de ligação com o DNA e um domínio C-terminal, menos conservado, denominado domínio de ligação com o ligante (LDB). Diversos experimentos mostram que a interação com o ligante afeta a estrutura e a mobilidade da hélice C-terminal dos receptores nucleares (hélice 12 do domínio de ligação com o ligante), sendo o principal mecanismo de ativação e repressão da transcrição. As primeiras estruturas de LBDs de receptores nucleares revelaram importantes diferenças entre estruturas contendo ligantes (holo) e estruturas apo, principalmente no que diz respeito a posição da hélice 12: em estruturas apo, foi observada a H12 em uma conformação aberta, expondo o sítio de ligação com o ligante, enquanto que em estruturas holo, foi observada a H12 em uma conformação fechada, dobrada sobre o corpo do LBD e envolvendo completamente o ligante. Essa diferença sugeriu um mecanismo para a entrada e saída de ligantes do sítio de ligação denominado modelo da ratoeira, entretanto, esse modelo apresenta diversas inconsistências e tem sido desacreditado. Estudos experimentais e teóricos recentes mostram que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, entretanto, esses estudos não fornecem evidencias de que o aumento da mobilidade da está associado com o deslocamento da H12 em relação ao corpo do LBD, como sugerido pelo modelo da ratoeira. Embora esteja claro que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, a dimensão da variação conformacional sofrida pela hélice 12 ainda não está clara. Nesse trabalho buscamos a construção de um modelo capaz de dimensionar a mobilidade da hélice 12 através da comparação direta entre simulações de dinâmica molecular e experimentos de anisotropia de fluorescência resolvida no tempo. Utilizando simulações de dinâmica molecular reproduzimos experimentos de anisotropia de fluorescência acoplando a sonda cys-flúor a hélice 12 do PPARγ para estudar sua mobilidade. Mostramos que as observações experimentais só podem ser explicadas por conformações onde a sonda fluorescente permanece presa a superfície do LBD. Foi mostrado também que curvas de anisotropia com decaimentos comparáveis com os decaimentos experimentais estão associados a pequenas variações conformacionais de hélice 12. Simulações para dois modelos de apo-PPARγ com a H12 aberta em relação ao corpo do LBD e para as estruturas cristalográficas de apo-RXR e apo-ER, onde a H12 também adota uma conformação aberta, revelaram curvas de anisotropia com decaimentos mais rápidos que os experimentais. Esses resultados implicam em um modelo onde a H12 sofre alterações conformacionais locais, não apresentando variações tão dramáticas como o proposto pelo modelo da ratoeira. / Nuclear Hormone Receptors comprise a protein superfamily responsible for regulation of gene expression. Structurally, they are composed by three domains: a variable N-terminal domain, a highly conserved DNA-binding domain (DBD), and a less conserved C-terminal domain, known as ligand binding domain (LBD). Many experiments have shown that the interaction with ligands affects the structure and the mobility of nuclear receptors C-terminal helix (LBDs Helix 12), being the main mechanism of transcription activation and repression. The first nuclear receptor LBDs structures revealed important differences between ligand bound (holo) and apo-structures concerning the position of the H12: in apo structures, H12 adopted an open conformation, exposing the ligand binding pocket, whereas in holo structures, the H12 was closed, packed over the body of the LBD, burying completely the ligand. This difference suggested a mechanism for ligand entry and exit from the binding pocket called mouse-trap model, however this model has several inconsistencies and has been discredited. Recent experimental and theoretical studies have shown that H12 is more labile in the absence of ligand, but these studies dont provide evidences that the increase in the mobility is associated with the detachment of H12 from the body of the LBD as suggested by the mouse-trap model. Although its clear that H12 is more flexible in the absence of ligands, the size of the conformational changes undergone by H12 is not yet clear. In this work we seek to construct a definitive model for the range of motions that H12 may undergo in the presence or absence of ligand using molecular dynamics simulations. Through direct comparison between molecular dynamics simulations and time-resolved fluorescence anisotropy experiments, we show that experimental observation can only be explained by conformations where the fluorescent probe is interacting with the surface of the PPARγ surface. We also show that simulations with anisotropy decay rates comparable to the experimental decay are associated with small helix 12 conformational changes. Simulations with two models of apo-PPARγ with H12 detached from the body of the LBD and with crystallographic structures of apo-RXR and apo-ER, where the H12 also is in an open conformation, display anisotropy decay rates significantly faster than the experimental ones. These results imply a model for the molecular mobility of the LBD where H12 undergoes local conformational changes and should exhibit dynamic properties less dramatic than proposed by the mouse trap model.

Receptores nucleares formam uma superfamília de proteínas responsáveis pela regulação da expressão de genes. Estruturalmente, são formados por três domínios: um domínio N-terminal bastante variável, um domínio altamente conservado de ligação com o DNA e um domínio C-terminal, menos conservado, denominado domínio de ligação com o ligante (LDB). Diversos experimentos mostram que a interação com o ligante afeta a estrutura e a mobilidade da hélice C-terminal dos receptores nucleares (hélice 12 do domínio de ligação com o ligante), sendo o principal mecanismo de ativação e repressão da transcrição. As primeiras estruturas de LBDs de receptores nucleares revelaram importantes diferenças entre estruturas contendo ligantes (holo) e estruturas apo, principalmente no que diz respeito a posição da hélice 12: em estruturas apo, foi observada a H12 em uma conformação aberta, expondo o sítio de ligação com o ligante, enquanto que em estruturas holo, foi observada a H12 em uma conformação fechada, dobrada sobre o corpo do LBD e envolvendo completamente o ligante. Essa diferença sugeriu um mecanismo para a entrada e saída de ligantes do sítio de ligação denominado modelo da ratoeira, entretanto, esse modelo apresenta diversas inconsistências e tem sido desacreditado. Estudos experimentais e teóricos recentes mostram que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, entretanto, esses estudos não fornecem evidencias de que o aumento da mobilidade da está associado com o deslocamento da H12 em relação ao corpo do LBD, como sugerido pelo modelo da ratoeira. Embora esteja claro que a hélice 12 é mais móvel na ausência de ligantes, a dimensão da variação conformacional sofrida pela hélice 12 ainda não está clara. Nesse trabalho buscamos a construção de um modelo capaz de dimensionar a mobilidade da hélice 12 através da comparação direta entre simulações de dinâmica molecular e experimentos de anisotropia de fluorescência resolvida no tempo. Utilizando simulações de dinâmica molecular reproduzimos experimentos de anisotropia de fluorescência acoplando a sonda cys-flúor a hélice 12 do PPARγ para estudar sua mobilidade. Mostramos que as observações experimentais só podem ser explicadas por conformações onde a sonda fluorescente permanece presa a superfície do LBD. Foi mostrado também que curvas de anisotropia com decaimentos comparáveis com os decaimentos experimentais estão associados a pequenas variações conformacionais de hélice 12. Simulações para dois modelos de apo-PPARγ com a H12 aberta em relação ao corpo do LBD e para as estruturas cristalográficas de apo-RXR e apo-ER, onde a H12 também adota uma conformação aberta, revelaram curvas de anisotropia com decaimentos mais rápidos que os experimentais. Esses resultados implicam em um modelo onde a H12 sofre alterações conformacionais locais, não apresentando variações tão dramáticas como o proposto pelo modelo da ratoeira. / Nuclear Hormone Receptors comprise a protein superfamily responsible for regulation of gene expression. Structurally, they are composed by three domains: a variable N-terminal domain, a highly conserved DNA-binding domain (DBD), and a less conserved C-terminal domain, known as ligand binding domain (LBD). Many experiments have shown that the interaction with ligands affects the structure and the mobility of nuclear receptors C-terminal helix (LBDs Helix 12), being the main mechanism of transcription activation and repression. The first nuclear receptor LBDs structures revealed important differences between ligand bound (holo) and apo-structures concerning the position of the H12: in apo structures, H12 adopted an open conformation, exposing the ligand binding pocket, whereas in holo structures, the H12 was closed, packed over the body of the LBD, burying completely the ligand. This difference suggested a mechanism for ligand entry and exit from the binding pocket called mouse-trap model, however this model has several inconsistencies and has been discredited. Recent experimental and theoretical studies have shown that H12 is more labile in the absence of ligand, but these studies dont provide evidences that the increase in the mobility is associated with the detachment of H12 from the body of the LBD as suggested by the mouse-trap model. Although its clear that H12 is more flexible in the absence of ligands, the size of the conformational changes undergone by H12 is not yet clear. In this work we seek to construct a definitive model for the range of motions that H12 may undergo in the presence or absence of ligand using molecular dynamics simulations. Through direct comparison between molecular dynamics simulations and time-resolved fluorescence anisotropy experiments, we show that experimental observation can only be explained by conformations where the fluorescent probe is interacting with the surface of the PPARγ surface. We also show that simulations with anisotropy decay rates comparable to the experimental decay are associated with small helix 12 conformational changes. Simulations with two models of apo-PPARγ with H12 detached from the body of the LBD and with crystallographic structures of apo-RXR and apo-ER, where the H12 also is in an open conformation, display anisotropy decay rates significantly faster than the experimental ones. These results imply a model for the molecular mobility of the LBD where H12 undergoes local conformational changes and should exhibit dynamic properties less dramatic than proposed by the mouse trap model.

Apresentamos os resultados de estudos sobre a utilização de técnicas baseadas no fenômeno de fluorescência para a investigação de processos relacionados a membranas modelo. Nessa investigação, estão envolvidas medidas de propriedades espectrais de absorção e emissão de luz por cromóforos adequados, determinação xperimental de perfis de decaimento temporal da fluorescência e correlação temporal de emissão fluorescente, bem como a utilização apropriada de metodologias para análise e interpretação dos dados experimentais. Foram utilizados diversos compostos que apresentam absorção e emissão na região ultravioleta/visível, como as sondas lipofílicas 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-yl) (NBD), em diferentes condições: meio aquoso homogêneo, suspensões de micelas de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) e 3-(Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) e vesículas de fosfolipídios, como o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) e o 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Supressores alquilpiridínios de diferentes comprimentos da cadeia alquila e, portanto, diferentes afinidades por agregados anfifílicos, foram utilizados em experimentos de supressão da fluorescência da sonda Ahba. Usando o formalismo que descreve fenômenos de supressão dependente de colisões entre fluoróforo e supressor, observamos que as taxas de supressão são maiores em presença de agregados anfifílicos carregados negativamente: micelas de SDS e vesículas de DMPG; em micelas zwiteriônicas o processo é mais eficiente quando a hidrofobicidade do supressor é grande, o que ocorre quando a cadeia alquila é mais longa. Realizamos experimentos de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) onde o grupo fluorescente da sonda lipofílica Ahba atuou como doador. Como aceitadores utilizamos os compostos Acridina Laranja, -(2,4,dinitrofenil)-etilenodiamina (Eddnp) e o NBD ligado a fosfolipídios. Fizemos uso do programa CONTIN para análise de dados experimentais de perfis de decaimento da fluorescência em sistemas em que ocorre transferência de energia e obtivemos distribuições de distâncias para os pares Ahba/Eddnp e Ahba/NBD-fosfolipídios na presença de vesículas de fosfolipídios. Para este último par, verificou-se que a distribuição de distâncias depende da temperatura do sistema, ou seja, da fase da bicamada, da concentração de aceitador e da posição onde o NBD está ligado ao fosfolipídio. Analisamos a utilização da sonda Laurdan em presença de vesículas de DMPC e POPC, em experimentos de espectroscopia de correlação de fluorescência. Embora tenha apresentado sinal elevado de fluorescência, a sonda é fotodegradável. Os mesmos experimentos de correlação de fluorescência foram realizados com o Ahba que, apesar de ter se mostrado bastante fotoestável, revelou não ser uma sonda adequada para uso em tal técnica. O espectro de excitação a dois fótons foi obtido para esta sonda, com máximo de absorção em 695 nm. Em experimentos de microscopia de fluorescência, o Ahba mostrou ser um bom marcador fluorescente para membranas lipídicas, ao possibilitar a aquisição de imagens de fluorescência de vesículas gigantes marcadas. / In this work we showed results from studies about the use of fluorescence spectroscopy techniques as a tool to investigate amphiphilic aggregates, used as a model of the cell membrane. We performed measurements on the spectral properties of light absorption and emission of adequate chromophors, registered the experimental timeresolved decay of fluorescence and time correlated fluorescence emission of the probes and used also adequate methodologies for the analysis and interpretation of experimental data. Several compounds presenting absorption and emission in the UV/visible spectral range were employed: the lipophilic probes 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) (NBD), in different environment:homogeneous aqueous medium, micelles of surfactants like Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) and 3- (Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) and phospholipid vesicles of 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3- [Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) and 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Alkyilpyridinium halides with different alkyl chain length were employed fluorescence quenchers of the Ahba probe. Using the Stern-Volmer model to describe the quenching phenomena dependent on fluorophor/quencher collision, we observed that higher quenching rates were obtained in the presence of negatively charged amphiphilic agreggates: SDS micelles and DMPG vesicles; in the presence of zwitterionic vesicles the quenching efficiency was more efficient when the quencher hydrophobicity was high (long alkyl chain). We performed Förster resonance energy transfer (FRET) experiments where the fluorescent moiety of the probe Ahba was the energy donor. As acceptors molecules we used Acridine Orange, Ethylene-diamine-dinitrophenyl (Eddnp) and NBD-labeled phospholipids. The computational package CONTIN was adapted to analyze the experimentally obtained fluorescence decay profiles of the donor in the presence of the acceptor, in order to determine the distance distribution between the Ahba/Eddnp and Ahba/NBD-phospholipids pairs in the presence of lipid vesicles. For the Ahba/NBD pair, the distances were dependent on the emperature of the system (or the phase bilayer behavior), the acceptor concentration and the NBD position in the phospholipid. We observed that the Laurdan probe can be used in studies about DMPC vesicles diffusion using fluorescence correlation spectroscopy techniques. Investigation about the use of the probe Ahba with this technique had shown that its maximum absorption for two photon excitation occurs near to 695 nm, but it is not an appropriated probe to FCS experiments due to its very low brightness. On the other hand, Ahba can be used as a membrane fluorescent label in membrane fluorescence microscopy, as we can see in the fluorescence imaging experiments with giant vesicles labeled with Ahba.

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ). / The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

Apresentamos os resultados de estudos sobre a utilização de técnicas baseadas no fenômeno de fluorescência para a investigação de processos relacionados a membranas modelo. Nessa investigação, estão envolvidas medidas de propriedades espectrais de absorção e emissão de luz por cromóforos adequados, determinação xperimental de perfis de decaimento temporal da fluorescência e correlação temporal de emissão fluorescente, bem como a utilização apropriada de metodologias para análise e interpretação dos dados experimentais. Foram utilizados diversos compostos que apresentam absorção e emissão na região ultravioleta/visível, como as sondas lipofílicas 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-yl) (NBD), em diferentes condições: meio aquoso homogêneo, suspensões de micelas de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) e 3-(Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) e vesículas de fosfolipídios, como o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) e o 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Supressores alquilpiridínios de diferentes comprimentos da cadeia alquila e, portanto, diferentes afinidades por agregados anfifílicos, foram utilizados em experimentos de supressão da fluorescência da sonda Ahba. Usando o formalismo que descreve fenômenos de supressão dependente de colisões entre fluoróforo e supressor, observamos que as taxas de supressão são maiores em presença de agregados anfifílicos carregados negativamente: micelas de SDS e vesículas de DMPG; em micelas zwiteriônicas o processo é mais eficiente quando a hidrofobicidade do supressor é grande, o que ocorre quando a cadeia alquila é mais longa. Realizamos experimentos de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) onde o grupo fluorescente da sonda lipofílica Ahba atuou como doador. Como aceitadores utilizamos os compostos Acridina Laranja, -(2,4,dinitrofenil)-etilenodiamina (Eddnp) e o NBD ligado a fosfolipídios. Fizemos uso do programa CONTIN para análise de dados experimentais de perfis de decaimento da fluorescência em sistemas em que ocorre transferência de energia e obtivemos distribuições de distâncias para os pares Ahba/Eddnp e Ahba/NBD-fosfolipídios na presença de vesículas de fosfolipídios. Para este último par, verificou-se que a distribuição de distâncias depende da temperatura do sistema, ou seja, da fase da bicamada, da concentração de aceitador e da posição onde o NBD está ligado ao fosfolipídio. Analisamos a utilização da sonda Laurdan em presença de vesículas de DMPC e POPC, em experimentos de espectroscopia de correlação de fluorescência. Embora tenha apresentado sinal elevado de fluorescência, a sonda é fotodegradável. Os mesmos experimentos de correlação de fluorescência foram realizados com o Ahba que, apesar de ter se mostrado bastante fotoestável, revelou não ser uma sonda adequada para uso em tal técnica. O espectro de excitação a dois fótons foi obtido para esta sonda, com máximo de absorção em 695 nm. Em experimentos de microscopia de fluorescência, o Ahba mostrou ser um bom marcador fluorescente para membranas lipídicas, ao possibilitar a aquisição de imagens de fluorescência de vesículas gigantes marcadas. / In this work we showed results from studies about the use of fluorescence spectroscopy techniques as a tool to investigate amphiphilic aggregates, used as a model of the cell membrane. We performed measurements on the spectral properties of light absorption and emission of adequate chromophors, registered the experimental timeresolved decay of fluorescence and time correlated fluorescence emission of the probes and used also adequate methodologies for the analysis and interpretation of experimental data. Several compounds presenting absorption and emission in the UV/visible spectral range were employed: the lipophilic probes 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) (NBD), in different environment:homogeneous aqueous medium, micelles of surfactants like Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) and 3- (Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) and phospholipid vesicles of 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3- [Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) and 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Alkyilpyridinium halides with different alkyl chain length were employed fluorescence quenchers of the Ahba probe. Using the Stern-Volmer model to describe the quenching phenomena dependent on fluorophor/quencher collision, we observed that higher quenching rates were obtained in the presence of negatively charged amphiphilic agreggates: SDS micelles and DMPG vesicles; in the presence of zwitterionic vesicles the quenching efficiency was more efficient when the quencher hydrophobicity was high (long alkyl chain). We performed Förster resonance energy transfer (FRET) experiments where the fluorescent moiety of the probe Ahba was the energy donor. As acceptors molecules we used Acridine Orange, Ethylene-diamine-dinitrophenyl (Eddnp) and NBD-labeled phospholipids. The computational package CONTIN was adapted to analyze the experimentally obtained fluorescence decay profiles of the donor in the presence of the acceptor, in order to determine the distance distribution between the Ahba/Eddnp and Ahba/NBD-phospholipids pairs in the presence of lipid vesicles. For the Ahba/NBD pair, the distances were dependent on the emperature of the system (or the phase bilayer behavior), the acceptor concentration and the NBD position in the phospholipid. We observed that the Laurdan probe can be used in studies about DMPC vesicles diffusion using fluorescence correlation spectroscopy techniques. Investigation about the use of the probe Ahba with this technique had shown that its maximum absorption for two photon excitation occurs near to 695 nm, but it is not an appropriated probe to FCS experiments due to its very low brightness. On the other hand, Ahba can be used as a membrane fluorescent label in membrane fluorescence microscopy, as we can see in the fluorescence imaging experiments with giant vesicles labeled with Ahba.

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ). / The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino. / Collective motions play a fundamental role in solution biomolecule dynamics and energetics. These movements can couple very distant regions in the protein structures affection, for instance, allosteric mechanisms, the establishment of macromolecular complexes, and on the integrated function of multidomain proteins as molecullar machines. In this thesis, we present results concerning to the joint use of experimental biophysical techniques, structural modeling and molecular dynamics simulations on the study of two systems for which these collective motions have substantial importance. First, we study the interaction of the nuclear retinoid X receptor with its specific DNA hormone response element (HRE) using a combination of molecular dynamics simulations and affinity assays performed by using fluorescence anisotropy. We find out that collective motions mediate the low binding affinity of monomers and the high cooperative binding of HRE dimers. The lower binding affinity of the monomer is more prominent for 5´ monomers. This occur due to an natural ineffective stacking of the last base pair step at the 5´-half-site and to the phasing of the two binding half-sites in the DNA topology, that impose a collective motions that tends to occlude the 5´ binding site. This behavior, in turn, is concurrent with the well known 3´ polarity and the decreased binding specificity to the 5´ half site for the hRXRα monomer. This same pattern impose a lock-and-key mechanisms dependent on the binding of the full dimer. Second, an integrated Small angle X ray scattering and molecular dynamics based structural modeling was used to comprehend the interdomain motions of cellobiohydrolase I of Trichoderma harziannum. We manage to build a refined model for this enzime, with important biotechnological potential. We also provide insights into molecular mechanisms of linker and glycosylation imposed restraints on the orientation and vibrational modes of the full-length enzyme, supporting a mechanism of sliding of on the cellulose surface. This mechanism is fundamental for the high processivity on the hydrolysis of microcrystalline cellulose.