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Antígeno B de Echinococcus : instabilidade genômica, variação no verme adulto e anticorpos policlonais

Graichen, Daniel Ângelo Sganzerla January 2011 (has links)
Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.
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Caracterização estrutural de oligômeros de subunidades recombinantes do antígeno B de Echinococcus granulosus

Monteiro, Karina Mariante January 2006 (has links)
O antígeno B (AgB) de Echinococcus granulosus é um dos principais componentes do líquido hidático. O AgB é um proteína oligomérica de 120-160 kDa composta de subunidades de 8 kDa, que em SDS-PAGE dissocia-se em componentes de 8, 16, 24 e 32 kDa. Embora diferentes subunidades do AgB tenham sido isoladas, pouco se sabe sobre a estrutura da proteína e do seu mecanismo de oligomerização. Neste trabalho foi realizada a caracterização estrutural de homo-oligômeros de três subunidades recombinantes do AgB, AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3, expressadas a partir de seqüências previamente clonadas Essas subunidades associam-se em homo-oligômeros com características semelhantes às da proteína purificada de líquido hidático, como massa molecular, conteúdo de estrutura secundária, tendência agregativa e termoestabilidade, fazendo deles ferramentas importantes para o estudo da estrutura do AgB. Diferentes graus de estabilidade e compactação foram verificados entre os oligômeros recombinantes, com o oligômero de AgB8/3 apresentando-se mais estável e compacto. Através da modelagem molecular das subunidades do AgB, foi possível calcular a superfície de potencial eletrostático das moléculas e propor um mecanismo de oligomerização envolvendo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Foram também realizadas tentativas de cristalização de oligômeros de AgB8/3 para ensaios de difração de raios X, e cristais foram obtidos em três condições do screening inicial. Estes cristais difrataram à resoluções máximas de 8 Å, não permitindo a coleta de dados estruturais da proteína. Entretanto, estas condições podem ser refinadas para a obtenção de cristais com melhor qualidade. / Echinococcus granulosus antigen B is one of the major components of the hydatid fluid. AgB is a oligomeric protein of 120-160 kDa composed by 8 kDa subunits, that in SDS-PAGE dissociates in components of 8, 16 , 24 and 32 kDa. Although different AgB subunits have been isolated, little is known about AgB structure and its oligomerization mechanism. In this work we have performed the homo-oligomers structural characterization of three AgB recombinant subunits, AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3, expressed from previously cloned genes. These subunits self-assemble in homo-oligomers with similar characteristics to that of hydatid fluid purified protein, such as molecular mass, secondary structure content, aggregative tendency and thermostability, making them valuable tools for AgB structure study. Different degrees of stability and compactness were verified between the recombinant oligomers, with the AgB8/3 one showing a more stable and compact structure. Using molecular modelling it was possible to calculate the surface electrostatic potencial of AgB subunits and to propose a mechanism of oligomerization involving electrostatic and hydrophobic interactions. Also crystallization attempts had been carried through with AgB8/3 oligomer to X-ray diffraction, and crystals have been obtained in three conditions of initial screening. These crystals difracted to maximum resolutions of 8 Å, and it was not possible to collect protein structural data. However, these crystallization conditions can be refined in order to obtain crystals of better quality.
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Antígeno B de Echinococcus : instabilidade genômica, variação no verme adulto e anticorpos policlonais

Graichen, Daniel Ângelo Sganzerla January 2011 (has links)
Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.
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Caracterização estrutural de oligômeros de subunidades recombinantes do antígeno B de Echinococcus granulosus

Monteiro, Karina Mariante January 2006 (has links)
O antígeno B (AgB) de Echinococcus granulosus é um dos principais componentes do líquido hidático. O AgB é um proteína oligomérica de 120-160 kDa composta de subunidades de 8 kDa, que em SDS-PAGE dissocia-se em componentes de 8, 16, 24 e 32 kDa. Embora diferentes subunidades do AgB tenham sido isoladas, pouco se sabe sobre a estrutura da proteína e do seu mecanismo de oligomerização. Neste trabalho foi realizada a caracterização estrutural de homo-oligômeros de três subunidades recombinantes do AgB, AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3, expressadas a partir de seqüências previamente clonadas Essas subunidades associam-se em homo-oligômeros com características semelhantes às da proteína purificada de líquido hidático, como massa molecular, conteúdo de estrutura secundária, tendência agregativa e termoestabilidade, fazendo deles ferramentas importantes para o estudo da estrutura do AgB. Diferentes graus de estabilidade e compactação foram verificados entre os oligômeros recombinantes, com o oligômero de AgB8/3 apresentando-se mais estável e compacto. Através da modelagem molecular das subunidades do AgB, foi possível calcular a superfície de potencial eletrostático das moléculas e propor um mecanismo de oligomerização envolvendo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Foram também realizadas tentativas de cristalização de oligômeros de AgB8/3 para ensaios de difração de raios X, e cristais foram obtidos em três condições do screening inicial. Estes cristais difrataram à resoluções máximas de 8 Å, não permitindo a coleta de dados estruturais da proteína. Entretanto, estas condições podem ser refinadas para a obtenção de cristais com melhor qualidade. / Echinococcus granulosus antigen B is one of the major components of the hydatid fluid. AgB is a oligomeric protein of 120-160 kDa composed by 8 kDa subunits, that in SDS-PAGE dissociates in components of 8, 16 , 24 and 32 kDa. Although different AgB subunits have been isolated, little is known about AgB structure and its oligomerization mechanism. In this work we have performed the homo-oligomers structural characterization of three AgB recombinant subunits, AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3, expressed from previously cloned genes. These subunits self-assemble in homo-oligomers with similar characteristics to that of hydatid fluid purified protein, such as molecular mass, secondary structure content, aggregative tendency and thermostability, making them valuable tools for AgB structure study. Different degrees of stability and compactness were verified between the recombinant oligomers, with the AgB8/3 one showing a more stable and compact structure. Using molecular modelling it was possible to calculate the surface electrostatic potencial of AgB subunits and to propose a mechanism of oligomerization involving electrostatic and hydrophobic interactions. Also crystallization attempts had been carried through with AgB8/3 oligomer to X-ray diffraction, and crystals have been obtained in three conditions of initial screening. These crystals difracted to maximum resolutions of 8 Å, and it was not possible to collect protein structural data. However, these crystallization conditions can be refined in order to obtain crystals of better quality.
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Antígeno B de Echinococcus : instabilidade genômica, variação no verme adulto e anticorpos policlonais

Graichen, Daniel Ângelo Sganzerla January 2011 (has links)
Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.
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Caracterização estrutural de oligômeros de subunidades recombinantes do antígeno B de Echinococcus granulosus

Monteiro, Karina Mariante January 2006 (has links)
O antígeno B (AgB) de Echinococcus granulosus é um dos principais componentes do líquido hidático. O AgB é um proteína oligomérica de 120-160 kDa composta de subunidades de 8 kDa, que em SDS-PAGE dissocia-se em componentes de 8, 16, 24 e 32 kDa. Embora diferentes subunidades do AgB tenham sido isoladas, pouco se sabe sobre a estrutura da proteína e do seu mecanismo de oligomerização. Neste trabalho foi realizada a caracterização estrutural de homo-oligômeros de três subunidades recombinantes do AgB, AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3, expressadas a partir de seqüências previamente clonadas Essas subunidades associam-se em homo-oligômeros com características semelhantes às da proteína purificada de líquido hidático, como massa molecular, conteúdo de estrutura secundária, tendência agregativa e termoestabilidade, fazendo deles ferramentas importantes para o estudo da estrutura do AgB. Diferentes graus de estabilidade e compactação foram verificados entre os oligômeros recombinantes, com o oligômero de AgB8/3 apresentando-se mais estável e compacto. Através da modelagem molecular das subunidades do AgB, foi possível calcular a superfície de potencial eletrostático das moléculas e propor um mecanismo de oligomerização envolvendo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Foram também realizadas tentativas de cristalização de oligômeros de AgB8/3 para ensaios de difração de raios X, e cristais foram obtidos em três condições do screening inicial. Estes cristais difrataram à resoluções máximas de 8 Å, não permitindo a coleta de dados estruturais da proteína. Entretanto, estas condições podem ser refinadas para a obtenção de cristais com melhor qualidade. / Echinococcus granulosus antigen B is one of the major components of the hydatid fluid. AgB is a oligomeric protein of 120-160 kDa composed by 8 kDa subunits, that in SDS-PAGE dissociates in components of 8, 16 , 24 and 32 kDa. Although different AgB subunits have been isolated, little is known about AgB structure and its oligomerization mechanism. In this work we have performed the homo-oligomers structural characterization of three AgB recombinant subunits, AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3, expressed from previously cloned genes. These subunits self-assemble in homo-oligomers with similar characteristics to that of hydatid fluid purified protein, such as molecular mass, secondary structure content, aggregative tendency and thermostability, making them valuable tools for AgB structure study. Different degrees of stability and compactness were verified between the recombinant oligomers, with the AgB8/3 one showing a more stable and compact structure. Using molecular modelling it was possible to calculate the surface electrostatic potencial of AgB subunits and to propose a mechanism of oligomerization involving electrostatic and hydrophobic interactions. Also crystallization attempts had been carried through with AgB8/3 oligomer to X-ray diffraction, and crystals have been obtained in three conditions of initial screening. These crystals difracted to maximum resolutions of 8 Å, and it was not possible to collect protein structural data. However, these crystallization conditions can be refined in order to obtain crystals of better quality.
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Análise dos efeitos de protoescólices e AgB de Echinococcus granulosus em possíveis mecanismos de evasão da resposta imune do hospedeiro

Virginio, Veridiana Gomes January 2007 (has links)
Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.
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Co-expressão das subunidades EgB8/2 e EgB8/3 do antígeno B de Echinococcus granulosus em E. coli

Ansolin, Poliana Leopoldino January 2013 (has links)
O estágio larval do Echinococcus granulosus é o agente etiológico da hidatidose. O antígeno B (AgB) é um dos principais componentes antigênicos do liquído hidático do metacestódeo e foi caracterizado como uma lipoproteína imunogêncica de 120-160 kDa. Na presença de agentes redutores, dissocia-se em 8, 16, 24 e 32 kDa, sugerindo que é composto de multímeros de subunidades de 8 kDa. Embora a função biológica do AgB ainda não seja totalmente clara, muitos estudos demonstraram sua atuação junto à processos importantes na relação parasito-hospedeiro, por exemplo, a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nosso laboratório já clonou e expressou em Escherichia coli cinco cDNAs que codificam subunidades do AgB, EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5. Um trabalho recente realizado em nosso laboratório demonstrou que as subunidades recombinantes do AgB, rAgB8/1, rAgB8/2 e rAgB8/3, são capazes de autoassociarem em solução formando homo-oligômeros com características estruturais semelhantes ao AgB nativo. Entretanto, neste trabalho não foi testada a heterooligomerização das subunidades recombinantes do AgB, visto que as proteínas recombinantes purificadas foram obtidas já sob a forma de homo-oligômeros, não sendo possível a mistura destas subunidades para este fim. Este trabalho tem como objetivo investigar a possível hetero-oligomerização das subunidades recombinantes do AgB através de experimentos de co-expressão. As sequências codificadoras do AgB (EgB8/2) e (EgB8/3) de E. granulosus foram amplificadas por PCR e os produtos de PCR de ambas as sequências foram clonados no vetor de expressão (pCDF-Duet), o qual possui duas regiões com múltiplos sítios de clonagem (MCS). A fidelidade das sequências clondadas foi confirmada por sequenciamento de DNA. As proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli e pela copurificação em coluna de níquel, foi possível verificar experimentalmente que as subunidades rAgB8/2 e rAgB8/3 estão interagindo entre si. A interação entre as subunidades foi confirmada pela análise por imunoblot e espectrometria de massas. Nossos resultados demostram a hetero-oligomerização das subunidades recombinantes rAgB8/2 e rAgB8/3 de E. granulosus e os dados podem fornecer um possível mecanismo de regulação na oligomerização destas subunidades. É necessário um melhor entendimento da estrutura e dos mecanismos de oligomerização do AgB para usá-lo como um importante alvo na elaboração de novas estratégias de prevenção, controle e tratamento de cestodíases. / The larval stage of Echinococcus granulosus is the etiologic agent of hydatidosis. Antigen B (AgB) is a major protein component of the metacestode hydatid fluid and was characterized as a immunogenic lipoprotein of 120-160 kDa. In presence of reducing agents, dissociates into 8, 16, 24 and 32 kDa, suggesting that their consists of multimers of 8kDa subunits. Although the biological function of AgB is still not entirely clear, numerous studies have demonstrated it engagement in important processes in the host-parasite relationship such as evasion of host immune response. Our laboratory has already cloned and expressed five cDNA encode EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5 antigen B subunits in E. coli. Previous studies from our group demonstrated that recombinant AgB subunits are able to self-associate in solution to form homo-oligomers, presenting similar properties to native AgB. However the hetero-oligomerization of the recombinant AgB subunits were not investigated. Since purified recombinant proteins were already obtained in the form of homo-oligomers and, it was not possible to combine these subunits for this purpose. In this work we aim to investigate the possible hetero-oligomerization of the AgB subunits through co-expression experiments. The cDNA sequences enconding E. granulosus EgAgB8/2 and EgAgB8/3 by PCR and the PCR products of both sequences have been cloned in the expression vector (pCDF-Duet), which has two multiple cloning site (MCS). The fidelity of the cloned sequences was confirmed by DNA sequencing. Afterwards the recombinant proteins rAgB8/2 and rAgB8/3 expressed in Escherichia coli. By co-purification in the nickel column, it was possible to verify experimentally that the two subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 are interacting one each other. The interaction between the subunits was confirmed by immunoblotting and mass spectrometry. Our results demonstrated the heterooligomerization of recombinant subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 of E. granulosus and these data may help to elucidate a possible mechanism for regulation of the subunits oligomerization process. A better understanding of the structure and mechanisms of oligomerization is necessary since that the AgB as an important target in the development of new strategies for prevention, control and treatment of cestodiasis.
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Co-expressão das subunidades EgB8/2 e EgB8/3 do antígeno B de Echinococcus granulosus em E. coli

Ansolin, Poliana Leopoldino January 2013 (has links)
O estágio larval do Echinococcus granulosus é o agente etiológico da hidatidose. O antígeno B (AgB) é um dos principais componentes antigênicos do liquído hidático do metacestódeo e foi caracterizado como uma lipoproteína imunogêncica de 120-160 kDa. Na presença de agentes redutores, dissocia-se em 8, 16, 24 e 32 kDa, sugerindo que é composto de multímeros de subunidades de 8 kDa. Embora a função biológica do AgB ainda não seja totalmente clara, muitos estudos demonstraram sua atuação junto à processos importantes na relação parasito-hospedeiro, por exemplo, a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nosso laboratório já clonou e expressou em Escherichia coli cinco cDNAs que codificam subunidades do AgB, EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5. Um trabalho recente realizado em nosso laboratório demonstrou que as subunidades recombinantes do AgB, rAgB8/1, rAgB8/2 e rAgB8/3, são capazes de autoassociarem em solução formando homo-oligômeros com características estruturais semelhantes ao AgB nativo. Entretanto, neste trabalho não foi testada a heterooligomerização das subunidades recombinantes do AgB, visto que as proteínas recombinantes purificadas foram obtidas já sob a forma de homo-oligômeros, não sendo possível a mistura destas subunidades para este fim. Este trabalho tem como objetivo investigar a possível hetero-oligomerização das subunidades recombinantes do AgB através de experimentos de co-expressão. As sequências codificadoras do AgB (EgB8/2) e (EgB8/3) de E. granulosus foram amplificadas por PCR e os produtos de PCR de ambas as sequências foram clonados no vetor de expressão (pCDF-Duet), o qual possui duas regiões com múltiplos sítios de clonagem (MCS). A fidelidade das sequências clondadas foi confirmada por sequenciamento de DNA. As proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli e pela copurificação em coluna de níquel, foi possível verificar experimentalmente que as subunidades rAgB8/2 e rAgB8/3 estão interagindo entre si. A interação entre as subunidades foi confirmada pela análise por imunoblot e espectrometria de massas. Nossos resultados demostram a hetero-oligomerização das subunidades recombinantes rAgB8/2 e rAgB8/3 de E. granulosus e os dados podem fornecer um possível mecanismo de regulação na oligomerização destas subunidades. É necessário um melhor entendimento da estrutura e dos mecanismos de oligomerização do AgB para usá-lo como um importante alvo na elaboração de novas estratégias de prevenção, controle e tratamento de cestodíases. / The larval stage of Echinococcus granulosus is the etiologic agent of hydatidosis. Antigen B (AgB) is a major protein component of the metacestode hydatid fluid and was characterized as a immunogenic lipoprotein of 120-160 kDa. In presence of reducing agents, dissociates into 8, 16, 24 and 32 kDa, suggesting that their consists of multimers of 8kDa subunits. Although the biological function of AgB is still not entirely clear, numerous studies have demonstrated it engagement in important processes in the host-parasite relationship such as evasion of host immune response. Our laboratory has already cloned and expressed five cDNA encode EgB8/1, EgB8/2 e EgB8/3, EgB8/4 e EgB8/5 antigen B subunits in E. coli. Previous studies from our group demonstrated that recombinant AgB subunits are able to self-associate in solution to form homo-oligomers, presenting similar properties to native AgB. However the hetero-oligomerization of the recombinant AgB subunits were not investigated. Since purified recombinant proteins were already obtained in the form of homo-oligomers and, it was not possible to combine these subunits for this purpose. In this work we aim to investigate the possible hetero-oligomerization of the AgB subunits through co-expression experiments. The cDNA sequences enconding E. granulosus EgAgB8/2 and EgAgB8/3 by PCR and the PCR products of both sequences have been cloned in the expression vector (pCDF-Duet), which has two multiple cloning site (MCS). The fidelity of the cloned sequences was confirmed by DNA sequencing. Afterwards the recombinant proteins rAgB8/2 and rAgB8/3 expressed in Escherichia coli. By co-purification in the nickel column, it was possible to verify experimentally that the two subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 are interacting one each other. The interaction between the subunits was confirmed by immunoblotting and mass spectrometry. Our results demonstrated the heterooligomerization of recombinant subunits rAgB8/2 and rAgB8/3 of E. granulosus and these data may help to elucidate a possible mechanism for regulation of the subunits oligomerization process. A better understanding of the structure and mechanisms of oligomerization is necessary since that the AgB as an important target in the development of new strategies for prevention, control and treatment of cestodiasis.
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Análise dos efeitos de protoescólices e AgB de Echinococcus granulosus em possíveis mecanismos de evasão da resposta imune do hospedeiro

Virginio, Veridiana Gomes January 2007 (has links)
Os fatores que afetam a susceptibilidade a infecção com E. granulosus são pouco conhecidos. Neste trabalho, foi avaliada a interação de protoescólices e um antígeno imunodominante secretado (AgB) de E. granulosus com neutrófilos humanos saudáveis. A intensidade de expressão de CD11b e produção de H2O2 foram avaliadas por citometria de fluxo usando sangue total. Os neutrófilos isolados também foram incubados com protoescólices ou AgB, e a interleucina 8 (IL-8) foi determinada por ELISA de captura. Os protoescólices induziram um aumento significativo na expressão de CD11b em neutrófilos (p=0,026) e na produção de H2O2 (p=0,026), entretanto a sua viabilidade não foi afetada. Em contraste, nenhum efeito foi observado com o AgB em ambos ensaios. Uma moderada produção de IL-8 foi detectada somente em sobrenadantes de neutrófilos cultivados com protoescólices comparada com a produção basal (p=0,028). O efeito de uma incubação prévia com o AgB foi avaliada em relação a expressão de CD11 e H2O2 induzida pelo tratamento dos neutrófilos com forbol meristato acetato (PMA). Nenhuma mudança foi observada na expressão de CD11b, entretanto, a intensidade de produção de H2O2 foi significantemente reduzida em comparação ao tratamento apenas com PMA (p=0,038) quando o fator ativador de plaquetas (PAF) foi usado como priming. Como os protoescólices ocasionalmente podem ser liberados dos cistos em compartimentos do hospedeiro causando a hidatidose secundária, estes resultados contribuem para elucidação da defesa do hospedeiro e dos mecanismos imunomoduladores do parasito. A identificação de produtos de secreção e/ou excreção de protoescólices de E. granulosus também foi avaliada neste trabalho. Os produtos de secreção e/ou excreção foram obtidos a partir das primeiras 48 h de cultivo de protoescólices in vitro. A caracterização imunológica foi feita por western blotting com um pool de soros de indivíduos infectados com hidatidose cística. Os produtos de secreção e/ou excreção também foram analisados por espectrometria de massas. As preparações de seis diferentes amostras de protoescólices continham componentes protéicos, os quais foram visualizados por SDS-PAGE com aparentes massas moleculares entre 10 e 200 kDa. Os ensaios de western blotting mostraram a presença de diversos antígenos imunogênicos de massas moleculares maiores (acima de 50 kDa), e do AgB. Os resultados de espectrometria de massas foram obtidos com um pool de seis amostras de sobrenadantes de cultivo contendo produtos de secreção e/ou excreção, e foram identificadas onze proteínas: malato desidrogenase, ciclofilina, miofilina, P-29, 14-3-3, enolase, duas serinoproteases, fosfoenolpiruvato carboxiquinase e tiorredoxina peroxidase. Estes resultados também podem contribuir para elucidação de novos aspectos da complexa interação parasito-hospedeiro, e de mecanismos imunomoduladores, uma vez que as proteínas secretadas podem estar diretamente envolvidas nesses processos. / The factors affecting innate susceptibility to infection with E. granulosus are little known. In this work, the interaction of healthy human neutrophils with protoscoleces and a secreted immunodominant antigen (AgB) of E. granulosus was assessed. The intensity of CD11b expression and H2O2 production were evaluated by flow cytometry using whole blood. Isolated neutrophils were incubated also with PSC or AgB and interleukin 8 (IL-8) was measured by capture ELISA. The protoscoleces induced a significant increment of CD11b expression in neutrophils (p=0.026) and of H2O2 production (p=0.026), however their viability was not affected. In contrast, no effect was observed with AgB in both assays. A moderate IL-8 production was detected only in supernatants from neutrophils cultured with protoscoleces compared with basal production (p=0.028). The effect of previous AgB incubation was evaluated in relation with CD11b and H2O2 expression induced by phorbol meristate acetate (PMA) treatment. No changes were observed with CD11 expression, however the magnitude of H2O2 production was significant decreased in comparison with PMA alone (p=0.038) when platelet–activating factor was used for priming. As protoscoleces occasionally spillaged from cysts into compartments of the host causing secondary cysts, these results contribute to the elucidation of the host defense and parasite immunomodulatory mechanisms involved. The identification of excretory and/or secretory products from E. granulosus protoscoleces also was assessed in this work. Excretory and/or secretory products were obtained from the first 48 h maintenance of protoscoleces in vitro. Immunological characterization was performed by western blotting with a pool of sera from individuals infected by cystic hydatidosis. Excretory and/or secretory products also were assessed by mass spectrometry. The preparations of six differents sample of protoscoleces contained components proteins which could be distinguished by SDS-PAGE with apparent molecular masses between 10 and 200 kDa. The assays of western blotting showed the presence of the several immunogenic antigens of major molecular masses (above 50 kDa), and of the AgB. The results of the mass espectrometry were obtained with a pool of six cultive sobrenadants sample containing excretory and/or secretory products, and were identified eleven proteins: malate dehydrogenase, cyclofilin, myophilin, P-29, 14-3-3, enolase, tegumental protein, two serineproteases, phosphoenolpyruvate carboxykinase and thioredoxin peroxidase. These results can contribute also for elucidate novel aspects of the complex interaction host-parasite and of the immunomodulatory mechanisms, since that secreted proteins can be directly involved in these process.

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