O gênero Echinococcus consiste de parasitos que têm ciclo de vida com dois hospedeiros mamíferos. Sua fase larval, cisto hidático, desenvolve-se predominantemente no fígado e pulmões de hospedeiros intermediários, ungulados domésticos, como bovinos, ovinos, suínos, e do próprio ser humano. O cisto hidático é o agente causador da hidatidose, e no Brasil, Echinococcus granulosus (G1) e Echinococcus ortleppi (G5) são ambos responsáveis pela grande maioria dos casos de hidatidose em hospedeiros humanos (G1 e G5), bovinos (G1 e G5) e ovinos (G1). Visando à identificação mais rápida das espécies, a técnica de high-resolution melting utilizando o gene cox1 em sete espécies de tenídeos foi padronizada, resultando em uma metodologia que requer apenas um único par de iniciadores e proporciona diferenciação das espécies de forma rápida e eficiente. Em estudo de análise proteômica deste trabalho nós identificamos 498 proteínas, por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), a partir de cistos férteis e inférteis. A análise funcional in silico permitiu destacar os seguintes aspectos: a existência de uma possível competição envolvendo parasito e hospedeiro; uma série de proteínas no líquido hidático sem anotação funcional e/ou com possíveis funções alternativas; a presença de vesículas extracelulares, como exossomos, no líquido hidático de E. granulosus. Também identificamos neste trabalho as proteínas compartilhadas entre G1 e G5, em uma tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na sobrevivência destes parasitos. As amostras de líquido hidático de seis isolados foram analisadas por LC-MS/MS e permitiu-nos identificar um total de 842 proteínas. A análise in silico destes dados permitiu a identificação de um conjunto de 162 proteínas presentes em, ao menos, cinco das seis amostras utilizadas, e identificar maior grau de especialização na infecção causada por G5 em cistos de pulmão de bovino. / The Echinococcus genus consists of parasites that have life cycle with two mammalian hosts. Their larval stage, called hydatid cyst develops predominantly in the liver and lungs of intermediate hosts, domestic ungulates, such as cattle, sheep, pig, and the human being himself. The hydatid cyst is the causative agent of hydatid disease, and in Brazil Echinococcus granulosus (G1) and Echinococcus ortleppi (G5) are both responsible for the vast majority of hydatid disease cases in human hosts (G1 and G5), cattle (G1 and G5) and sheep (G1). In order to rapidly identify the species, we have standardized the high-resolution melting technique using the cox1 gene in seven Taeniidae species, resulting in a technique that only requires a single pair of primers and provide a quick, closed-tube and gel-free species differentiation. In a study of proteomic analysis we identified 498 proteins, by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) from fertile and infertile cysts. The functional in silico analysis allowed us to emphasize some important aspects: the existence of a possible competition involving parasite and host responses; a number of proteins in hydatid fluid without functional annotation and with possible alternative functions; the presence of extracellular vesicles, such as exosomes, in hydatid fluid from E. granulosus. We also identified in this work the proteins shared between G1 and G5, in an attempt to elucidate mechanisms involved in the survival of these parasites. The hydatid fluid samples from six isolates were analyzed by LC-MS/MS and allowed us to identify a total of 842 proteins. The in silico analysis of these data enabled us to set a core of 162 proteins present in at least five of the six samples, besides some degree of infection specialization from G5 for lung bovine cysts.

O gênero Echinococcus consiste de parasitos que têm ciclo de vida com dois hospedeiros mamíferos. Sua fase larval, cisto hidático, desenvolve-se predominantemente no fígado e pulmões de hospedeiros intermediários, ungulados domésticos, como bovinos, ovinos, suínos, e do próprio ser humano. O cisto hidático é o agente causador da hidatidose, e no Brasil, Echinococcus granulosus (G1) e Echinococcus ortleppi (G5) são ambos responsáveis pela grande maioria dos casos de hidatidose em hospedeiros humanos (G1 e G5), bovinos (G1 e G5) e ovinos (G1). Visando à identificação mais rápida das espécies, a técnica de high-resolution melting utilizando o gene cox1 em sete espécies de tenídeos foi padronizada, resultando em uma metodologia que requer apenas um único par de iniciadores e proporciona diferenciação das espécies de forma rápida e eficiente. Em estudo de análise proteômica deste trabalho nós identificamos 498 proteínas, por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), a partir de cistos férteis e inférteis. A análise funcional in silico permitiu destacar os seguintes aspectos: a existência de uma possível competição envolvendo parasito e hospedeiro; uma série de proteínas no líquido hidático sem anotação funcional e/ou com possíveis funções alternativas; a presença de vesículas extracelulares, como exossomos, no líquido hidático de E. granulosus. Também identificamos neste trabalho as proteínas compartilhadas entre G1 e G5, em uma tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na sobrevivência destes parasitos. As amostras de líquido hidático de seis isolados foram analisadas por LC-MS/MS e permitiu-nos identificar um total de 842 proteínas. A análise in silico destes dados permitiu a identificação de um conjunto de 162 proteínas presentes em, ao menos, cinco das seis amostras utilizadas, e identificar maior grau de especialização na infecção causada por G5 em cistos de pulmão de bovino. / The Echinococcus genus consists of parasites that have life cycle with two mammalian hosts. Their larval stage, called hydatid cyst develops predominantly in the liver and lungs of intermediate hosts, domestic ungulates, such as cattle, sheep, pig, and the human being himself. The hydatid cyst is the causative agent of hydatid disease, and in Brazil Echinococcus granulosus (G1) and Echinococcus ortleppi (G5) are both responsible for the vast majority of hydatid disease cases in human hosts (G1 and G5), cattle (G1 and G5) and sheep (G1). In order to rapidly identify the species, we have standardized the high-resolution melting technique using the cox1 gene in seven Taeniidae species, resulting in a technique that only requires a single pair of primers and provide a quick, closed-tube and gel-free species differentiation. In a study of proteomic analysis we identified 498 proteins, by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) from fertile and infertile cysts. The functional in silico analysis allowed us to emphasize some important aspects: the existence of a possible competition involving parasite and host responses; a number of proteins in hydatid fluid without functional annotation and with possible alternative functions; the presence of extracellular vesicles, such as exosomes, in hydatid fluid from E. granulosus. We also identified in this work the proteins shared between G1 and G5, in an attempt to elucidate mechanisms involved in the survival of these parasites. The hydatid fluid samples from six isolates were analyzed by LC-MS/MS and allowed us to identify a total of 842 proteins. The in silico analysis of these data enabled us to set a core of 162 proteins present in at least five of the six samples, besides some degree of infection specialization from G5 for lung bovine cysts.

O gênero Echinococcus consiste de parasitos que têm ciclo de vida com dois hospedeiros mamíferos. Sua fase larval, cisto hidático, desenvolve-se predominantemente no fígado e pulmões de hospedeiros intermediários, ungulados domésticos, como bovinos, ovinos, suínos, e do próprio ser humano. O cisto hidático é o agente causador da hidatidose, e no Brasil, Echinococcus granulosus (G1) e Echinococcus ortleppi (G5) são ambos responsáveis pela grande maioria dos casos de hidatidose em hospedeiros humanos (G1 e G5), bovinos (G1 e G5) e ovinos (G1). Visando à identificação mais rápida das espécies, a técnica de high-resolution melting utilizando o gene cox1 em sete espécies de tenídeos foi padronizada, resultando em uma metodologia que requer apenas um único par de iniciadores e proporciona diferenciação das espécies de forma rápida e eficiente. Em estudo de análise proteômica deste trabalho nós identificamos 498 proteínas, por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), a partir de cistos férteis e inférteis. A análise funcional in silico permitiu destacar os seguintes aspectos: a existência de uma possível competição envolvendo parasito e hospedeiro; uma série de proteínas no líquido hidático sem anotação funcional e/ou com possíveis funções alternativas; a presença de vesículas extracelulares, como exossomos, no líquido hidático de E. granulosus. Também identificamos neste trabalho as proteínas compartilhadas entre G1 e G5, em uma tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na sobrevivência destes parasitos. As amostras de líquido hidático de seis isolados foram analisadas por LC-MS/MS e permitiu-nos identificar um total de 842 proteínas. A análise in silico destes dados permitiu a identificação de um conjunto de 162 proteínas presentes em, ao menos, cinco das seis amostras utilizadas, e identificar maior grau de especialização na infecção causada por G5 em cistos de pulmão de bovino. / The Echinococcus genus consists of parasites that have life cycle with two mammalian hosts. Their larval stage, called hydatid cyst develops predominantly in the liver and lungs of intermediate hosts, domestic ungulates, such as cattle, sheep, pig, and the human being himself. The hydatid cyst is the causative agent of hydatid disease, and in Brazil Echinococcus granulosus (G1) and Echinococcus ortleppi (G5) are both responsible for the vast majority of hydatid disease cases in human hosts (G1 and G5), cattle (G1 and G5) and sheep (G1). In order to rapidly identify the species, we have standardized the high-resolution melting technique using the cox1 gene in seven Taeniidae species, resulting in a technique that only requires a single pair of primers and provide a quick, closed-tube and gel-free species differentiation. In a study of proteomic analysis we identified 498 proteins, by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) from fertile and infertile cysts. The functional in silico analysis allowed us to emphasize some important aspects: the existence of a possible competition involving parasite and host responses; a number of proteins in hydatid fluid without functional annotation and with possible alternative functions; the presence of extracellular vesicles, such as exosomes, in hydatid fluid from E. granulosus. We also identified in this work the proteins shared between G1 and G5, in an attempt to elucidate mechanisms involved in the survival of these parasites. The hydatid fluid samples from six isolates were analyzed by LC-MS/MS and allowed us to identify a total of 842 proteins. The in silico analysis of these data enabled us to set a core of 162 proteins present in at least five of the six samples, besides some degree of infection specialization from G5 for lung bovine cysts.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

A taxonomia dos cestóides do gênero Echinococcus está submetida a constante revisão. Dez espécies são atualmente aceitas para Echinococcus, duas delas são o Echinococcus oligarthrus, agente causador da equinococose unicística, e o Echinococcus vogeli, agente causador da equinococose policística e que parece ser a espécie mais patogênica do gênero. Existem haplótipos que ainda não foram determinados como espécies e permanecem dentro da categoria de variantes genéticas. Atualmente, os estudos genéticos em Echinococcus concentram-se na análise do DNA mitocondrial, um genoma que não recombina, de rápida evolução, e de herança materna na maioria dos animais. Além disso, esses estudos têm se concentrado em E. granulosus e E. multilocularis, usando uma ou poucas amostras de Echinococcus neotropical. Este estudo teve como objetivo analisar, utilizando sequências nucleares, a composição genética das duas espécies neotropicais, visando colaborar para a compreensão dos processos evolutivos do gênero Echinococcus e, consequentemente, contribuir para o correto manuseio do parasito nas regiões afetadas. No total, foram utilizados 45 isolados para extração de DNA e subsequentes análises, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi e 1 E. multilocularis. As espécies foram determinadas a partir da amplificação e análise da sequência parcial (366 pb) do gene mitocondrial da citocromo-oxidase (cox1). Para os 45 isolados, 6 diferentes alvos nucleares (P-29, EG10, AG4, Ir, Er e TGF) foram amplificados por PCR e os diferentes genótipos foram selecionados através da técnica de SSCP. Os loci mais polimórficos encontrados em E. vogeli foram Ag4 e E10, ambos com 2 alelos, e nos loci Ir, Er, P-29 e Tgf, com um alelo. E. oligarthrus tem alelos exclusivos para cinco dos seis loci nucleares analisados; contudo, o alelo T2, do locus Tgf, também está presente em seis isolados de E. vogeli. O fluxo gênico entre as metapopulações de E. vogeli das duas áreas geográficas parece ser restrito. Além disso, o fluxo gênico entre a população de E. oligarthrus e as demais populações é restrito. A AMOVA revelou que o nível mais significante de variabilidade genética ocorre dentro das metapopulações, o segundo nível mais significativo foi encontrado entre as metapopulações dentro das suprapopulações do Acre e Pará. Os isolados amostrados no estado do Acre parecem formar um “cluster” distinto. Além disso, foi possível verificar que os isolados de E. vogeli amostrados no estado do Pará também tendem a constituir um “cluster” único, mas de forma menos uniforme. Os 11 haplótipos mitocondriais de E. vogeli constituem um grupo monofilético e distinto de E. oligarthrus e das demais espécies do gênero. / Cestodes of the genus Echinococcus are subjected to a constant taxonomic revision. Ten species are currently accepted for the genus Echinococcus, two of them are Echinococcus oligarthrus, the agent of unicystic echinococcosis and Echinococcus vogeli, the agent of polycystic echinococcosis, which seems to be one of the most pathogenic species of Echinococcus. There are haplotypes that have not been determined as species and remain within the genetic variants category. Currently, the genetic studies on Echinococcus have focused on the analysis of mitochondrial DNA, a non-recombining, fast evolving and maternally inherited genome in most animals. Besides, these studies have been concentrated in the E. granulosus and E. multilocularis, using one or few samples from neotropical Echinococcus. This study aimed to analyze, using nuclear sequences, the genetic composition of the two neotropical species, which may support the understanding of evolutionary processes on the genus Echinococcus and, consequently, will contribute to the correct handling of the parasite in the affected regions. A total of 45 isolates were used for DNA extraction and further analyses, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi and 1 E. multilocularis. The species were determined by amplification and sequence analysis of a partial sequence (366 bp) of the mitochondrial cytochrome oxydase 1 gene (cox1). For the 45 isolates, 6 different nuclear targets (P-29, Eg10, Ag4, Ir, Er and Tgf) were amplified by PCR and the genotypes were screened by SSCP technique. In E. vogeli, the most polymorphic loci found were Ag4 and E10, both with 2 alleles, and the Ir, Er, P-29 and Tgf loci with 1 allele. E. oligarthrus has exclusive alleles for five of the six analyzed nuclear loci. However, the allele T2, from Tgf locus, is also present in six E. vogeli isolates. The gene flow between the metapopulations of E. vogeli seems to be restricted. In addition, the gene flow between the E. oligarthrus population and the other populations of E. vogeli is restricted. The AMOVA revealed that the most significant level of genetic variability occurs within metapopulations, and the second most significant level of variability was found among metapopulations within suprapopulations of Acre and Pará. Isolates sampled in Acre seems to form a distinct cluster. Furthermore, it was possible to verify that the E. vogeli isolates sampled in Pará also are likely to form a single "cluster", but less uniform. The 11 mitochondrial haplotypes of E. vogeli constitute a monophyletic group and distinct from E. oligarthrus and other Echinococcus species.

Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.

A taxonomia dos cestóides do gênero Echinococcus está submetida a constante revisão. Dez espécies são atualmente aceitas para Echinococcus, duas delas são o Echinococcus oligarthrus, agente causador da equinococose unicística, e o Echinococcus vogeli, agente causador da equinococose policística e que parece ser a espécie mais patogênica do gênero. Existem haplótipos que ainda não foram determinados como espécies e permanecem dentro da categoria de variantes genéticas. Atualmente, os estudos genéticos em Echinococcus concentram-se na análise do DNA mitocondrial, um genoma que não recombina, de rápida evolução, e de herança materna na maioria dos animais. Além disso, esses estudos têm se concentrado em E. granulosus e E. multilocularis, usando uma ou poucas amostras de Echinococcus neotropical. Este estudo teve como objetivo analisar, utilizando sequências nucleares, a composição genética das duas espécies neotropicais, visando colaborar para a compreensão dos processos evolutivos do gênero Echinococcus e, consequentemente, contribuir para o correto manuseio do parasito nas regiões afetadas. No total, foram utilizados 45 isolados para extração de DNA e subsequentes análises, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi e 1 E. multilocularis. As espécies foram determinadas a partir da amplificação e análise da sequência parcial (366 pb) do gene mitocondrial da citocromo-oxidase (cox1). Para os 45 isolados, 6 diferentes alvos nucleares (P-29, EG10, AG4, Ir, Er e TGF) foram amplificados por PCR e os diferentes genótipos foram selecionados através da técnica de SSCP. Os loci mais polimórficos encontrados em E. vogeli foram Ag4 e E10, ambos com 2 alelos, e nos loci Ir, Er, P-29 e Tgf, com um alelo. E. oligarthrus tem alelos exclusivos para cinco dos seis loci nucleares analisados; contudo, o alelo T2, do locus Tgf, também está presente em seis isolados de E. vogeli. O fluxo gênico entre as metapopulações de E. vogeli das duas áreas geográficas parece ser restrito. Além disso, o fluxo gênico entre a população de E. oligarthrus e as demais populações é restrito. A AMOVA revelou que o nível mais significante de variabilidade genética ocorre dentro das metapopulações, o segundo nível mais significativo foi encontrado entre as metapopulações dentro das suprapopulações do Acre e Pará. Os isolados amostrados no estado do Acre parecem formar um “cluster” distinto. Além disso, foi possível verificar que os isolados de E. vogeli amostrados no estado do Pará também tendem a constituir um “cluster” único, mas de forma menos uniforme. Os 11 haplótipos mitocondriais de E. vogeli constituem um grupo monofilético e distinto de E. oligarthrus e das demais espécies do gênero. / Cestodes of the genus Echinococcus are subjected to a constant taxonomic revision. Ten species are currently accepted for the genus Echinococcus, two of them are Echinococcus oligarthrus, the agent of unicystic echinococcosis and Echinococcus vogeli, the agent of polycystic echinococcosis, which seems to be one of the most pathogenic species of Echinococcus. There are haplotypes that have not been determined as species and remain within the genetic variants category. Currently, the genetic studies on Echinococcus have focused on the analysis of mitochondrial DNA, a non-recombining, fast evolving and maternally inherited genome in most animals. Besides, these studies have been concentrated in the E. granulosus and E. multilocularis, using one or few samples from neotropical Echinococcus. This study aimed to analyze, using nuclear sequences, the genetic composition of the two neotropical species, which may support the understanding of evolutionary processes on the genus Echinococcus and, consequently, will contribute to the correct handling of the parasite in the affected regions. A total of 45 isolates were used for DNA extraction and further analyses, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi and 1 E. multilocularis. The species were determined by amplification and sequence analysis of a partial sequence (366 bp) of the mitochondrial cytochrome oxydase 1 gene (cox1). For the 45 isolates, 6 different nuclear targets (P-29, Eg10, Ag4, Ir, Er and Tgf) were amplified by PCR and the genotypes were screened by SSCP technique. In E. vogeli, the most polymorphic loci found were Ag4 and E10, both with 2 alleles, and the Ir, Er, P-29 and Tgf loci with 1 allele. E. oligarthrus has exclusive alleles for five of the six analyzed nuclear loci. However, the allele T2, from Tgf locus, is also present in six E. vogeli isolates. The gene flow between the metapopulations of E. vogeli seems to be restricted. In addition, the gene flow between the E. oligarthrus population and the other populations of E. vogeli is restricted. The AMOVA revealed that the most significant level of genetic variability occurs within metapopulations, and the second most significant level of variability was found among metapopulations within suprapopulations of Acre and Pará. Isolates sampled in Acre seems to form a distinct cluster. Furthermore, it was possible to verify that the E. vogeli isolates sampled in Pará also are likely to form a single "cluster", but less uniform. The 11 mitochondrial haplotypes of E. vogeli constitute a monophyletic group and distinct from E. oligarthrus and other Echinococcus species.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.