O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos. / The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms.

A família de proteínas 14-3-3 as quais desempenham funções reguladoras conservadas foi estudada em parasitos do gênero Echinococcus, agentes causadores de diferentes formas de hidatidose. Nos genomas de Echinococcus granulosus e de Echinococcus multilocularis seis isoformas foram encontradas (Eg14-3-3.1-6 e Em14-3-3.1-6, respectivamente) com sequências e estruturas conservadas entre ortólogos. As estruturas gene/proteína de 14-3-3 de E. granulosus e de E. multilocularis foram analisadas e as relações filogenéticas com proteínas ortólogas foram estabelecidas para uma ampla gama de espécies. As quatro sequências de 14-3-3 expressas no metacestódeo de E. granulosus (Eg14-3-3.1-4) foram clonadas e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas. A avaliação do padrão de expressão demonstrou a presença destas proteínas em diferentes componentes do metacestódeo de E. granulosus, incluindo componentes da interface parasito-hospedeiro. Os papéis desempenhados por proteínas Eg14-3-3 na biologia do parasito foram inferidos a partir dos repertórios de proteínas que interagem com cada isoforma recombinante, sendo avaliados por gel overlay, cross linking, ensaio de cromatografia de afinidade e posteriormente identificadas por espectrometria de massa. Um total de 95 proteínas de interação com as proteínas Eg14-3-3 foi identificado. As isoformas Eg14-3-3 apresentaram ligantes compartilhados (44 proteínas), indicando sobreposição de algumas funções, mas elas também se ligam a parceiros exclusivos (51 proteínas), o que sugere uma especialização funcional das Eg14-3-3.1-4. Esses repertórios de ligantes indicam o envolvimento das proteínas Eg14-3-3 em várias vias bioquímicas no metacestódeo de E. granulosus. Neste estudo foi possível caracterizar as proteínas 14-3-3 de Echinococcus spp. e evidenciar os possíveis papéis que estas proteínas podem desempenhar no metacestódeo, sugerindo sua participação em mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento do cisto hidático no hospedeiro intermediário. / The 14-3-3 family, formed by conserved regulatory proteins, was studied in Echinococcus spp. parasites, the causative agents of different forms of hydatid disease. The genomes of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis code each for six 14-3-3 isoforms (Eg14-3-3.1-6 and Em14-3-3.1-6, respectively) with conserved sequences and structures between orthologues. E. granulosus and E. multilocularis 14-3-3 gene/protein structures were analyzed and their phylogenetic relationships were established with ortholog proteins from a wide range of eukaryotic species. The four 14-3-3 coding sequences expressed in E. granulosus metacestode (Eg14-3-3.1-4) were cloned and the corresponding recombinant proteins were expressed and purified. The evaluation of the expression pattern of Eg14-3-3.1-4 demonstrated the presence of these proteins in different components of E. granulosus metacestode, including interface components with the host. The roles played by Eg14-3-3 proteins in parasite biology were inferred from the repertoires of interacting proteins with each recombinant isoform, assessed by gel overlay, cross linking, affinity chromatography assays and identified by mass spectrometry. A total of 95 Eg14-3-3 protein ligands was identified. Eg14-3-3 isoforms have shared partners (44 proteins), indicating some overlapping functions, but they also bind exclusive partners (51 proteins), suggesting Eg14-3-3 functional specialization. These ligand repertoires indicate the involvement of Eg14-3-3 proteins in multiple biochemical pathways in the E. granulosus metacestode. It was possible to characterize the proteins 14-3-3 of Echinococcus spp. and evidence the possible roles played by these proteins in the metacestode, suggesting their participation in molecular mechanisms related to the survival and development of the hydatid cyst in the intermediate host.

Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.

A hidatidose cística é uma zoonose helmíntica endêmica causada pela infecção com a forma larval ou metacestódeo de Echinococcus granulosus. Neste trabalho, foi realizada uma análise proteômica do metacestódeo de E. granulosus durante a infecção do seu hospedeiro intermediário bovino. A identificação de proteínas do parasito e do hospedeiro presentes nos diferentes componentes da larva do parasito (protoescólices, camada germinativa e líquido hidático) gerou informações valiosas sobre a relação parasitohospedeiro. Os resultados obtidos permitiram a caracterização da resposta imune montada pelo hospedeiro contra a infecção por E. granulosus, bem como de potenciais estratégias moleculares adotadas pelo parasito para evadir essa resposta e promover a sua sobrevivência dentro do corpo do hospedeiro. Além disso, novas proteínas-alvo foram identificadas para o desenvolvimento ou melhora de ferramentas de diagnóstico, tratamento e controle da hidatidose. Nesse trabalho, foi também estudada a estrutura do antígeno B (AgB) de E. granulosus, uma proteína implicada em múltiplas interações parasito-hospedeiro durante a infecção. Medidas de espalhamento de luz dinâmico utilizando subunidades recombinantes (AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3) demonstraram que o AgB forma diferentes estruturas moleculares sob condições fisiológicas, incluindo oligômeros e agregados de alta massa molecular. As subunidades recombinantes do AgB mostraram diferentes tendências agregativas, sendo os agregados de alta massa molecular formados por AgB8/3 os mais similares, em morfologia e tamanho, àqueles do AgB produzido pelo parasito. Experimentos de dissociação induzida por pressão revelaram que a formação de pontes dissulfeto confere maior estabilidade aos homo-oligômeros de AgB8/2 e AgB8/3. A composição de subunidades do AgB foi avaliada por espectrometria de massas (MS), identificando as subunidades AgB8/1, AgB8/3 e AgB8/4, o que indica uma contribuição principal dessas subunidades nas propriedades estruturais, biológicas e imunológicas do AgB de E. granulosus. A análise de MS indicou também uma associação entre AgB e Ag5, os principais antígenos secretados pelo metacestódeo de E. granulosus. / Cystic hydatid disease (CHD) is an endemic helminthic zoonosis caused by infection with the larval stage or metacestode of the tapeworm Echinococcus granulosus. Here, we performed a proteomic analysis of the E. granulosus metacestode during infection of its intermediate bovine host. Identification of parasite and host proteins present in different components of parasite larvae (protoscoleces, germinal layer and hydatid cyst fluid) provided valuable information on host-parasite interplay. Our results allowed the characterization of host immune response mounted against E. granulosus infection, as well as potential molecular strategies adopted by the parasite to avoid this response and promote its survival inside the host body. Moreover, new protein targets were identified for the development or improvement of CHD diagnosis, treatment, and control tools. In this work, we also study the structure of E. granulosus antigen B (AgB), a protein implicated in multiple host-parasite interactions during infection. Dynamic light scattering experiments with recombinant subunits (AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3) demonstrated that AgB form different molecular assemblies under physiological conditions, including oligomers and high-molecular-weight aggregates. AgB recombinant subunits showed different aggregative tendencies, being AgB8/3 high-molecular-weight aggregates most similar, both in morphology and size, to those of parasite-produced AgB. Pressure-induced dissociation experiments revealed that disulfide bonds formation confers greater stability to AgB8/2 and AgB8/3 homo-oligomers. AgB subunit composition was evaluated by mass spectrometry (MS), identifying AgB8/1, AgB8/3 and AgB8/4 subunits, which indicates a major contribution for these subunits on E. granulosus AgB structural, biological, and immunological properties. The MS analysis also indicated an association between AgB and Ag5, the major antigens secreted by E. granulosus metacestode.

A expressão “proteínas moonlighting” refere-se a um subgrupo de proteínas multifuncionais, onde duas ou mais funções são realizadas por uma mesma cadeia polipeptídica. Dentre as proteínas com funções moonlighting estão diversas enzimas glicolíticas que podem desempenhar papeis importantes em processos-chave na biologia de organismos parasitas, como os de motilidade, adesão, invasão e diferenciação. A aldolase, a enolase e a lactato-desidrogenase (LDH) estão entre as enzimas que foram detectadas nos produtos de excreção-secreção (ES) e em tecidos de interface com o hospedeiro de Echinococcus granulosus, o cestódeo causador da hidatidose cística em seres humanos e ungulados domésticos. Neste contexto, a caracterização destas enzimas pode revelar possíveis funções moonligthing por elas desempenhadas e contribuir para a compreensão de aspectos básicos do desenvolvimento do parasito e de possíveis mecanismos de interação com os hospedeiros. Inicialmente, as sequências codificadoras da aldolase (EgAldo), da enolase (EgEno) e da LDH (EgLDH) de E. granulosus foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em um vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli, para a produção das proteínas recombinantes correspondentes (rEgAldo, rEgEno e rEgLDH, respectivamente). Soros de pacientes humanos com hidatidose reconhecem, em imunoblots, a EgAldo e EgEno nativas mas não reconhecem as proteínas recombinantes correspondentes, sugerindo o envolvimento de epitopos não proteicos no reconhecimento desses antígenos. Antissoros policlonais contra a rEgAldo e a rEgEno evidenciaram, em protoescólices, uma localização predominantemente citoplasmática para as proteínas nativas cognatas. Elas também foram detectadas na camada germinativa e no líquido hidático, que representam interfaces entre o parasito e o hospedeiro. Além disso, tanto a EgAldo como a EgEno foram reconhecidas em frações de proteínas tegumentares e em produtos de ES de protoescólices, localizações sugestivas de funções moonlighting. Proteínas do parasito e do hospedeiro intermediário que interagem com as proteínas rEgAldo, rEgEno e rEgLDH foram recuperadas por experimentos de GST pull-down para posterior identificação destas proteínas por espectrometria de massas. A identificação destas proteínas de interação poderá apontar processos não-glicolíticos nos quais estas enzimas estejam envolvidas. / The term “moonlighting proteins” refers to a subset of multifunctional proteins in which two or more different functions are performed by one polipeptide chain. Among the proteins described as moonlighting, there are many glycolytic enzymes that play important roles in key processes in the biology of parasites, such as motility, adhesion, invasion and cell differentiation. Aldolase, enolase and lactate dehydrogenase are among the enzymes that have been detected in the excretory-secretory (ES) products and in the host-interacting metacestode components from Echinococcus granulosus, a cestode that causes cystic hydatid disease and affects both humans and livestock. In this context, the characterization of these enzymes may reveal possible moonlighting functions they perform and contribute to the understanding of basic aspects of the parasite development and differentiation and possible interaction mechanisms with the intermediate host. Initially, the complete coding sequences from E. granulosus aldolase (EgAldo), enolase (EgEno) and lactate dehydrogenase (EgLDH) were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production (rEgAldo, rEgEno and rEgLDH, respectively). Sera from human hydatid disease patients recognize in immunoblots the native EgAldo and EgEno, but not its recombinant counterparts, which was taken as evidence of involvement of non proteic epitopes in the EgAldo and EgEno recognition. Polyclonal antiserum against rEgAldo and rEgEno have shown, in protoscoleces, a predominantly cytoplasmic localization for the cognate native proteins, as expected for glycolytic enzymes. They have also been detected in the germinal layer and hydatid fluid, which represent host-parasite interfaces. Furthermore, both EgAldo and EgEno were recognized in protoscoleces tegument extracts and in ES products from these parasites in culture, which are indicative of moonlighting functions. Parasite and intermediate host proteins that interact with proteins rEgAldo, rEgEno and rEgLDH in vitro were recovered by GST pull-down assays and the identification of these proteins will be performed using mass spectrometry. Identification of interacting proteins may also be an indication that these enzymes perform nonglycolytic functions.

O antígeno B (AgB) de Echinococcus granulosus é um dos principais componentes do líquido hidático. O AgB é um proteína oligomérica de 120-160 kDa composta de subunidades de 8 kDa, que em SDS-PAGE dissocia-se em componentes de 8, 16, 24 e 32 kDa. Embora diferentes subunidades do AgB tenham sido isoladas, pouco se sabe sobre a estrutura da proteína e do seu mecanismo de oligomerização. Neste trabalho foi realizada a caracterização estrutural de homo-oligômeros de três subunidades recombinantes do AgB, AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3, expressadas a partir de seqüências previamente clonadas Essas subunidades associam-se em homo-oligômeros com características semelhantes às da proteína purificada de líquido hidático, como massa molecular, conteúdo de estrutura secundária, tendência agregativa e termoestabilidade, fazendo deles ferramentas importantes para o estudo da estrutura do AgB. Diferentes graus de estabilidade e compactação foram verificados entre os oligômeros recombinantes, com o oligômero de AgB8/3 apresentando-se mais estável e compacto. Através da modelagem molecular das subunidades do AgB, foi possível calcular a superfície de potencial eletrostático das moléculas e propor um mecanismo de oligomerização envolvendo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Foram também realizadas tentativas de cristalização de oligômeros de AgB8/3 para ensaios de difração de raios X, e cristais foram obtidos em três condições do screening inicial. Estes cristais difrataram à resoluções máximas de 8 Å, não permitindo a coleta de dados estruturais da proteína. Entretanto, estas condições podem ser refinadas para a obtenção de cristais com melhor qualidade. / Echinococcus granulosus antigen B is one of the major components of the hydatid fluid. AgB is a oligomeric protein of 120-160 kDa composed by 8 kDa subunits, that in SDS-PAGE dissociates in components of 8, 16 , 24 and 32 kDa. Although different AgB subunits have been isolated, little is known about AgB structure and its oligomerization mechanism. In this work we have performed the homo-oligomers structural characterization of three AgB recombinant subunits, AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3, expressed from previously cloned genes. These subunits self-assemble in homo-oligomers with similar characteristics to that of hydatid fluid purified protein, such as molecular mass, secondary structure content, aggregative tendency and thermostability, making them valuable tools for AgB structure study. Different degrees of stability and compactness were verified between the recombinant oligomers, with the AgB8/3 one showing a more stable and compact structure. Using molecular modelling it was possible to calculate the surface electrostatic potencial of AgB subunits and to propose a mechanism of oligomerization involving electrostatic and hydrophobic interactions. Also crystallization attempts had been carried through with AgB8/3 oligomer to X-ray diffraction, and crystals have been obtained in three conditions of initial screening. These crystals difracted to maximum resolutions of 8 Å, and it was not possible to collect protein structural data. However, these crystallization conditions can be refined in order to obtain crystals of better quality.

A família de proteínas 14-3-3 as quais desempenham funções reguladoras conservadas foi estudada em parasitos do gênero Echinococcus, agentes causadores de diferentes formas de hidatidose. Nos genomas de Echinococcus granulosus e de Echinococcus multilocularis seis isoformas foram encontradas (Eg14-3-3.1-6 e Em14-3-3.1-6, respectivamente) com sequências e estruturas conservadas entre ortólogos. As estruturas gene/proteína de 14-3-3 de E. granulosus e de E. multilocularis foram analisadas e as relações filogenéticas com proteínas ortólogas foram estabelecidas para uma ampla gama de espécies. As quatro sequências de 14-3-3 expressas no metacestódeo de E. granulosus (Eg14-3-3.1-4) foram clonadas e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas. A avaliação do padrão de expressão demonstrou a presença destas proteínas em diferentes componentes do metacestódeo de E. granulosus, incluindo componentes da interface parasito-hospedeiro. Os papéis desempenhados por proteínas Eg14-3-3 na biologia do parasito foram inferidos a partir dos repertórios de proteínas que interagem com cada isoforma recombinante, sendo avaliados por gel overlay, cross linking, ensaio de cromatografia de afinidade e posteriormente identificadas por espectrometria de massa. Um total de 95 proteínas de interação com as proteínas Eg14-3-3 foi identificado. As isoformas Eg14-3-3 apresentaram ligantes compartilhados (44 proteínas), indicando sobreposição de algumas funções, mas elas também se ligam a parceiros exclusivos (51 proteínas), o que sugere uma especialização funcional das Eg14-3-3.1-4. Esses repertórios de ligantes indicam o envolvimento das proteínas Eg14-3-3 em várias vias bioquímicas no metacestódeo de E. granulosus. Neste estudo foi possível caracterizar as proteínas 14-3-3 de Echinococcus spp. e evidenciar os possíveis papéis que estas proteínas podem desempenhar no metacestódeo, sugerindo sua participação em mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento do cisto hidático no hospedeiro intermediário. / The 14-3-3 family, formed by conserved regulatory proteins, was studied in Echinococcus spp. parasites, the causative agents of different forms of hydatid disease. The genomes of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis code each for six 14-3-3 isoforms (Eg14-3-3.1-6 and Em14-3-3.1-6, respectively) with conserved sequences and structures between orthologues. E. granulosus and E. multilocularis 14-3-3 gene/protein structures were analyzed and their phylogenetic relationships were established with ortholog proteins from a wide range of eukaryotic species. The four 14-3-3 coding sequences expressed in E. granulosus metacestode (Eg14-3-3.1-4) were cloned and the corresponding recombinant proteins were expressed and purified. The evaluation of the expression pattern of Eg14-3-3.1-4 demonstrated the presence of these proteins in different components of E. granulosus metacestode, including interface components with the host. The roles played by Eg14-3-3 proteins in parasite biology were inferred from the repertoires of interacting proteins with each recombinant isoform, assessed by gel overlay, cross linking, affinity chromatography assays and identified by mass spectrometry. A total of 95 Eg14-3-3 protein ligands was identified. Eg14-3-3 isoforms have shared partners (44 proteins), indicating some overlapping functions, but they also bind exclusive partners (51 proteins), suggesting Eg14-3-3 functional specialization. These ligand repertoires indicate the involvement of Eg14-3-3 proteins in multiple biochemical pathways in the E. granulosus metacestode. It was possible to characterize the proteins 14-3-3 of Echinococcus spp. and evidence the possible roles played by these proteins in the metacestode, suggesting their participation in molecular mechanisms related to the survival and development of the hydatid cyst in the intermediate host.

Nos parasitos do gênero Echinococcus observam-se grandes diferenças genéticas entre as espécies. Mais ainda, a espécie E. granulosus apresenta uma grande variação intraespecífica. Diversas variantes com características biológicas e epidemiológicas particulares, e adaptadas a hospedeiros intermediários diferentes, foram classificadas como linhagens. De fato, estas linhagens são muitas vezes tão divergentes geneticamente quanto as demais espécies do gênero. Isto tem gerado diversas discussões quanto seu status taxonômico. Os genes do antígeno B (AgB) de Echinococcus compõem uma família multigênica. A proteína secretada, um oligômero formado a partir de subunidades de 8 kDa, tem um papel importante no estabelecimento da infecção, modulando a resposta imune do hospedeiro. Estudos demonstraram que alguns genes desta família devem estar sob seleção positiva ou diversificadora. Inclusive, a quantidade de variantes encontradas é alta em um único parasito. Este trabalho analisa amostras de E. granulosus coletadas no Rio Grande do Sul e as compara a amostras de outra populações geográficas (Argentina, Argélia e Romênia) usando um marcador mitocondrial (cox1-391 pb) e duas seqüências nucleares. Uma delas corresponde a um fragmento que inclui majoritariamente o segundo íntron do gene de cópia única codificador da malato desidrogenase citosólica (mdh - 214 pb) e a outra trata-se da seqüência parcial do gene que codifica a subunidade 4 do AgB (AgB4 - 329-355 pb), incluindo aproximadamente 80 pb da região promotora do gene até em torno de 60 pb à montante do códon de parada da tradução. A análise do fragmento de mdh utilizou a técnica de PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento, para discriminar os alelos das amostras de cada população, totalizando 259 indivíduos (isolados). Os achados confirmam a homogeneidade das populações geográficas de E. granulosus e a divergência dos parasitos das linhagens ovina e bovina (freqüentemente denominada E. ortleppi). Apesar da divergência entre as linhagens, são encontrados em baixa freqüência alelos característicos da linhagem bovina (haplótipo G5) em parasitos com haplótipo mitocondrial ovino (G1) e vice-versa. Tal situação poderia ser conseqüência do cruzamento entre parasitos destas linhagens quando em simpatria. A abordagem adotada na análise do gene AgB4 foi a amplificação por PCR seguida do seqüenciamento direto de 151 isolados. Os dados indicam a presença de mais de duas cópias do AgB4 no genoma, e que, dada a conservação na região codificante, seria provável que estes genes estejam evoluindo em concerto. Também encontramos alta divergência entre as seqüências dos isolados com haplótipos mitocondriais G1 (AgB4 tipo 1) e G5 (AgB4 tipo 2). A divergência é tão grande que acreditamos que na linhagem bovina o gene AgB4 tenha recombinado com AgB2. Uma seqüência idêntica a nossa depositada no GeneBank foi previamente sugerida como sendo uma variante não-funcional do AgB2. Assim como no caso do mdh alguns parasitos com haplótipos mitocondriais G5 (linhagem bovina) apresentaram em baixa freqüência seqüências de AgB4 do tipo 1 características da linhagem ovina. Este achado reforça a hipótese de fluxo gênico entre as linhagens de E. granulosus. / In the parasites belonging to the genus Echinococcus large differences between species are observed. Furthermore, the E. granulosus species shows a high intraspecific variability. Different variants with particular biologic and epidemiologic features, adapted to distinct intermediate hosts, were classified as strains. Indeed, the strains are frequently as genetically divergent as the other species within the genus. This has generated several discussions about their taxonomic status. The Echinococcus antigen B (AgB) genes belong to a multigene family. The secreted protein, an oligomer built by subunits of 8kDa, has an important role in the infection establishment, modulating the host immune response. Studies have demonstrated that some genes in this family might be under positive or diversifying selection. Moreover, the quantity of variants found is high, even in a single parasite. This study analyzes samples of E. granulosus collected in Rio Grande do Sul, and compares them to samples from other geographic regions (Argentina, Algeria and Romania) using a mitochondrial marker (cox1 – 391bp) and two nuclear sequences. One corresponds to a fragment including mostly the second intron of the cytosolic malate dehydrogenase single copy gene (mdh – 214bp) and the other is a partial gene sequence encoding the fourth subunit of AgB (AgB4 – 329-355bp), which includes approximately 80bp of the promoter region until around 60bp upstream to the stop codon. The analysis of the mdh fragment was based on the PCR-SSCP technique, followed by sequencing, to discriminate among alleles within samples of each population, totalizing 259 individuals (isolates). Our findings confirm the homogeneity within E. granulosus geographic populations and a high divergence between parasites from the ovine and bovine (frequently named E. ortleppi) strains. Despite the divergence between strains, bovine strain (haplotype G5) characteristic alleles are found in low frequency in parasites with the ovine mitochondrial haplotype (G1) and vice-versa. This situation could be a consequence of interbreeding between parasites from the different strains, when in simpatry. The approach used for the AgB4 gene analysis was the PCR amplification followed by direct sequencing of 151 isolates. The data indicate the presence of more than two AgB4 gene copies inside the genome; and that, considering the conservation of the coding region, it would be probable that these genes are evolving in concert. We also found a high divergence in AgB4 sequences between isolates with haplotypes G1 (AgB4 type 1) and G5 (AgB4 type 2). The divergence is so large, that we believe that in the bovine strain the AgB4 gene might have recombined with AgB2. As well as for the mdh gene, some parasites with the G5 mitochondrial haplotype (bovine strain) showed in low frequencies AgB4 type 1 sequences, characteristic of the ovine strain. This finding reinforces the hypothesis of gene flow between strains of E. granulosus.

As proteínas 14-3-3 formam uma família altamente conservada, expressas em todos os organismos eucariotos já estudados. Através da interação com seus alvos, as proteínas 14-3-3 participam de importantes processos celulares, como controle do ciclo celular, apoptose, transdução de sinal e diferenciação celular. Neste trabalho, essa família gênica foi estudada em Echinococcus granulosus e em Echinococcus multilocularis, as espécies de maior importância do gênero Echinococcus. E. granulosus e E. multilocularis, na fase larval, são agentes etiológicos da hidatidose cística e da hidatidose alveolar, respectivamente, zoonoses associadas a grandes prejuízos na área da pecuária e a gastos no tratamento de pacientes humanos. Por meio da análise dos bancos de dados disponíveis e comparação com os dados genômicos, neste estudo, seis potenciais genes codificadores de proteínas 14-3-3 foram identificados para ambas as espécies, sendo denominados Eg14-3-3 e Em14-3-3 para E. granulosus e E. multilocularis, respectivamente. Análises filogenéticas das sequências preditas de aminoácidos codificadas por esses genes demonstram que as proteínas Eg14-3-3 e Em14-3-3 retêm características ancestrais, não se agrupando claramente com proteínas ortólogas de outros organismos quanto ao tipo de isoforma (zeta e épsilon), como ocorre, por exemplo, em mamíferos. A fim de caracterizar funcionalmente as proteínas Eg14-3-3, o padrão de expressão das isoformas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 foi avaliado. A identificação dessas isoformas em componentes do metacestódeo de E. granulosus que representam interfaces parasito-hospedeiro sugere a possível participação dessas proteínas em mecanismos de interação com o hospedeiro. Estudos para a identificação dos ligantes protéicos que interagem com as proteínas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 também foram realizados. Entre os ligantes identificados estão chaperonas, proteínas associadas à conversão de energia, citoesqueleto, e transporte e metabolismo de carboidratos. Essas interações apontam o envolvimento da família proteica 14-3-3 em mecanismos que promovem o estabelecimento e sobrevivência de E. granulosus. A caracterização das interações identificadas neste estudo poderá auxiliar na elucidação de aspectos biológicos básicos do parasito, e mecanismos moleculares utilizados para o desenvolvimento e manutenção do metacestódeo nas vísceras do hospedeiro intermediário por longo período de tempo. / The 14-3-3 proteins form a highly conserved family, and have been shown to be actively expressed in all eukaryotic organisms studied so far. Through interaction with their targets, the 14-3-3 proteins participate in some of the major eukaryotic cellular processes, such as cell cycle regulation, apoptosis, signal transduction, and cell differentiation pathways. In the present work, this gene family has been studied in two species of the genus Echinococcus, namely Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, which, in their larval stage, are the causative agents of the cystic hydatid disease and the alveolar hydatid disease, respectively, two economically relevant zoonotic diseases associated with livestock production losses and human health care expenditures. Through analysis and comparison of available database, and searches in Echinococcus sequencing genome data, six candidate genes encoding 14-3-3 proteins were identified in both species, being named Eg14-3-3 and Em14-3-3 to E. granulosus and E. multilocularis, respectively. Interestingly, the phylogenetic analyses of deduced amino acid sequences encoded by these genes showed that Eg14-3-3 and Em14- 3-3 proteins retain more ancestral characteristics, and do not group clearly with orthologous proteins from other organisms relative to isoform types (zeta and epsilon), as occurs, for example, in mammals. In order to functionally characterize the Eg14-3-3 proteins, the expression patterns of the Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 isoforms were analyzed. The identification of both isoforms in E. granulosus metacestode components, that represent host–parasite interface, suggests a possible participation of these proteins on mechanisms of interaction with the host. Additionally, studies aiming the identification of proteins able to bind to Eg14-3-3ζ2 and Eg14-3-3ζ3 isoforms were carried out. Among the ligands identified, chaperones, proteins associated with energy production and conversion, cytoskeleton and carbohydrate transport and metabolism, were present, suggesting the involvement of 14-3-3 protein family in mechanisms that promote the establishment and survival of E. granulosus. Further characterization of the interactions identified in this study can help to elucidate basic biological aspects of these parasites, as well as molecular mechanisms involved in the development and maintenance of hydatid cyst in within intermediate host tissues for long time.

Com base na interação especifica entre o fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e o 5’ CAP monometilguanosina (MMGcap) do mRNA foi desenvolvido um eficiente sistema para purificação de mRNA usando um mutante da proteína humana eIF4E. Apesar de o MMGcap ser o mais comum nos mRNAs eucarióticos, em nematoides e platelmintos devido ao processo de trans-splicing há também a presença do 5’ CAP trimetilguanosina (TMGcap). Tendo em vista a capacidade única da eIF4E de helmintos em interagir com ambos MMGcap e TMGcap, nesse trabalho foram analisadas as sequências peptídicas das eIF4E de platelmintos e a aplicação da proteína recombinante eIF4E de Echinococcus granulosus como uma ferramenta para o enriquecimento de amostras com mRNAs a partir de RNA total do parasito. As sequências preditas das eIF4E de platelmintos foram obtidas para 18 platelmintos parasitos e apenas uma isoforma da proteína foi encontrada em cada organismo. Na análise filogenética, essas proteínas formaram um ramo único e divergente, inclusive dos platelmintos de vida livre. A sequência codificante da proteína eIF4E de E. granulosus foi clonada por recombinação in vivo e a proteína recombinante (EgReIF4E) em fusão com a glutationa S-transferase (GST) foi expressa em Escherichia coli. A proteína em fusão foi recuperada a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade, sendo obtido o rendimento de 12,8 mg de proteína por 1 L de cultura. No ensaio de captura de mRNAs através do 5’ CAP pela GST-EgReIF4E foi usado RNA total de E. granulosus e de E. ortleppi. A capacidade da EgReIF4E em capturar mRNAs foi avaliada por RT-qPCR de forma comparativa ao RNA total e aos resultados obtidos de um kit comercial de Oligo-dT. Foram avaliados tanto os genes relacionados ao processo de trans-splicing como os genes que não passam por este processo. Também foi avaliado a presença dos rRNAs nas amostras. Nossos dados preliminares indicam que a EgReIF4E foi capaz de purificar os mRNAs e reduzir os níveis dos rRNAs. Porém, houve perdas significativas de mRNAs, que precisam ser corrigidas. Apesar de promissora para platelmintos, a aplicação dessa metodologia precisa ser melhor padronizada visando o aumento do rendimento global do sistema. / Based on the specific interaction between the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) and the mRNA 5 'CAP monometilguanosina (MMGcap), an efficient system for mRNA purification using a mutant of the human protein eIF4E has been developed. Despite of the MMGcap be the most common in eukaryotic mRNAs, in in parasitic nematodes and flatworms due to the trans-splicing process there is also the 5 'CAP trimetilguanosina (TMGcap). Due to this peculiarity and unique ability of the helminthes eIF4E in interacting with both MMGcap and TMGcap, in this work was analyzed the sequences of eIF4E from flatworms and evaluated the using of eIF4E from E. granulosus (Eg-eIF4E) be used as a tool for purification of mRNA derived from total RNA of the parasite. The predicted sequence of the eIF4E flatworms was obtained for 18 parasitic flatworms and only one protein isoform was found for each species. In phylogenetic analysis of these proteins was formed a unique and divergent branch, even when compared with the free-living flatworms. The coding sequence of the E. granulosus eIF4E protein was cloned by in vivo recombination and the recombinant protein (EgReIF4E) fused to glutathione S-transferase (GST) was expressed using Escherichia coli. The fusion protein was recovered from the soluble fraction by affinity chromatography and the yield was 12.8 mg of protein per 1 L of culture. For the mRNAs capture assay using the 5 'CAP by GST-EgReIF4E were used total RNA from E. granulosus and E. ortleppi. The ability of EgReIF4E to capture mRNAs was evaluated by RT-qPCR compared with the total RNA and the results obtained with the commercial Oligo-dT kit. For comparison and analyzed were selected both genes related to trans-splice process as genes that do not undergo this process. The levels of rRNAs in the samples were also assessed. Our preliminary data indicate that EgReIF4E was able to purify the mRNAs and reduce the levels of rRNA. However, there was a significant loss in the level of mRNAs and it need to be adjusted. Despite of being a promising for flatworms, the implementation of this alternative methodology should be further standardized to increase the overall efficiency of the system.