A família de proteínas 14-3-3 as quais desempenham funções reguladoras conservadas foi estudada em parasitos do gênero Echinococcus, agentes causadores de diferentes formas de hidatidose. Nos genomas de Echinococcus granulosus e de Echinococcus multilocularis seis isoformas foram encontradas (Eg14-3-3.1-6 e Em14-3-3.1-6, respectivamente) com sequências e estruturas conservadas entre ortólogos. As estruturas gene/proteína de 14-3-3 de E. granulosus e de E. multilocularis foram analisadas e as relações filogenéticas com proteínas ortólogas foram estabelecidas para uma ampla gama de espécies. As quatro sequências de 14-3-3 expressas no metacestódeo de E. granulosus (Eg14-3-3.1-4) foram clonadas e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas. A avaliação do padrão de expressão demonstrou a presença destas proteínas em diferentes componentes do metacestódeo de E. granulosus, incluindo componentes da interface parasito-hospedeiro. Os papéis desempenhados por proteínas Eg14-3-3 na biologia do parasito foram inferidos a partir dos repertórios de proteínas que interagem com cada isoforma recombinante, sendo avaliados por gel overlay, cross linking, ensaio de cromatografia de afinidade e posteriormente identificadas por espectrometria de massa. Um total de 95 proteínas de interação com as proteínas Eg14-3-3 foi identificado. As isoformas Eg14-3-3 apresentaram ligantes compartilhados (44 proteínas), indicando sobreposição de algumas funções, mas elas também se ligam a parceiros exclusivos (51 proteínas), o que sugere uma especialização funcional das Eg14-3-3.1-4. Esses repertórios de ligantes indicam o envolvimento das proteínas Eg14-3-3 em várias vias bioquímicas no metacestódeo de E. granulosus. Neste estudo foi possível caracterizar as proteínas 14-3-3 de Echinococcus spp. e evidenciar os possíveis papéis que estas proteínas podem desempenhar no metacestódeo, sugerindo sua participação em mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento do cisto hidático no hospedeiro intermediário. / The 14-3-3 family, formed by conserved regulatory proteins, was studied in Echinococcus spp. parasites, the causative agents of different forms of hydatid disease. The genomes of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis code each for six 14-3-3 isoforms (Eg14-3-3.1-6 and Em14-3-3.1-6, respectively) with conserved sequences and structures between orthologues. E. granulosus and E. multilocularis 14-3-3 gene/protein structures were analyzed and their phylogenetic relationships were established with ortholog proteins from a wide range of eukaryotic species. The four 14-3-3 coding sequences expressed in E. granulosus metacestode (Eg14-3-3.1-4) were cloned and the corresponding recombinant proteins were expressed and purified. The evaluation of the expression pattern of Eg14-3-3.1-4 demonstrated the presence of these proteins in different components of E. granulosus metacestode, including interface components with the host. The roles played by Eg14-3-3 proteins in parasite biology were inferred from the repertoires of interacting proteins with each recombinant isoform, assessed by gel overlay, cross linking, affinity chromatography assays and identified by mass spectrometry. A total of 95 Eg14-3-3 protein ligands was identified. Eg14-3-3 isoforms have shared partners (44 proteins), indicating some overlapping functions, but they also bind exclusive partners (51 proteins), suggesting Eg14-3-3 functional specialization. These ligand repertoires indicate the involvement of Eg14-3-3 proteins in multiple biochemical pathways in the E. granulosus metacestode. It was possible to characterize the proteins 14-3-3 of Echinococcus spp. and evidence the possible roles played by these proteins in the metacestode, suggesting their participation in molecular mechanisms related to the survival and development of the hydatid cyst in the intermediate host.

A família de proteínas 14-3-3 as quais desempenham funções reguladoras conservadas foi estudada em parasitos do gênero Echinococcus, agentes causadores de diferentes formas de hidatidose. Nos genomas de Echinococcus granulosus e de Echinococcus multilocularis seis isoformas foram encontradas (Eg14-3-3.1-6 e Em14-3-3.1-6, respectivamente) com sequências e estruturas conservadas entre ortólogos. As estruturas gene/proteína de 14-3-3 de E. granulosus e de E. multilocularis foram analisadas e as relações filogenéticas com proteínas ortólogas foram estabelecidas para uma ampla gama de espécies. As quatro sequências de 14-3-3 expressas no metacestódeo de E. granulosus (Eg14-3-3.1-4) foram clonadas e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas. A avaliação do padrão de expressão demonstrou a presença destas proteínas em diferentes componentes do metacestódeo de E. granulosus, incluindo componentes da interface parasito-hospedeiro. Os papéis desempenhados por proteínas Eg14-3-3 na biologia do parasito foram inferidos a partir dos repertórios de proteínas que interagem com cada isoforma recombinante, sendo avaliados por gel overlay, cross linking, ensaio de cromatografia de afinidade e posteriormente identificadas por espectrometria de massa. Um total de 95 proteínas de interação com as proteínas Eg14-3-3 foi identificado. As isoformas Eg14-3-3 apresentaram ligantes compartilhados (44 proteínas), indicando sobreposição de algumas funções, mas elas também se ligam a parceiros exclusivos (51 proteínas), o que sugere uma especialização funcional das Eg14-3-3.1-4. Esses repertórios de ligantes indicam o envolvimento das proteínas Eg14-3-3 em várias vias bioquímicas no metacestódeo de E. granulosus. Neste estudo foi possível caracterizar as proteínas 14-3-3 de Echinococcus spp. e evidenciar os possíveis papéis que estas proteínas podem desempenhar no metacestódeo, sugerindo sua participação em mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento do cisto hidático no hospedeiro intermediário. / The 14-3-3 family, formed by conserved regulatory proteins, was studied in Echinococcus spp. parasites, the causative agents of different forms of hydatid disease. The genomes of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis code each for six 14-3-3 isoforms (Eg14-3-3.1-6 and Em14-3-3.1-6, respectively) with conserved sequences and structures between orthologues. E. granulosus and E. multilocularis 14-3-3 gene/protein structures were analyzed and their phylogenetic relationships were established with ortholog proteins from a wide range of eukaryotic species. The four 14-3-3 coding sequences expressed in E. granulosus metacestode (Eg14-3-3.1-4) were cloned and the corresponding recombinant proteins were expressed and purified. The evaluation of the expression pattern of Eg14-3-3.1-4 demonstrated the presence of these proteins in different components of E. granulosus metacestode, including interface components with the host. The roles played by Eg14-3-3 proteins in parasite biology were inferred from the repertoires of interacting proteins with each recombinant isoform, assessed by gel overlay, cross linking, affinity chromatography assays and identified by mass spectrometry. A total of 95 Eg14-3-3 protein ligands was identified. Eg14-3-3 isoforms have shared partners (44 proteins), indicating some overlapping functions, but they also bind exclusive partners (51 proteins), suggesting Eg14-3-3 functional specialization. These ligand repertoires indicate the involvement of Eg14-3-3 proteins in multiple biochemical pathways in the E. granulosus metacestode. It was possible to characterize the proteins 14-3-3 of Echinococcus spp. and evidence the possible roles played by these proteins in the metacestode, suggesting their participation in molecular mechanisms related to the survival and development of the hydatid cyst in the intermediate host.

A família de proteínas 14-3-3 as quais desempenham funções reguladoras conservadas foi estudada em parasitos do gênero Echinococcus, agentes causadores de diferentes formas de hidatidose. Nos genomas de Echinococcus granulosus e de Echinococcus multilocularis seis isoformas foram encontradas (Eg14-3-3.1-6 e Em14-3-3.1-6, respectivamente) com sequências e estruturas conservadas entre ortólogos. As estruturas gene/proteína de 14-3-3 de E. granulosus e de E. multilocularis foram analisadas e as relações filogenéticas com proteínas ortólogas foram estabelecidas para uma ampla gama de espécies. As quatro sequências de 14-3-3 expressas no metacestódeo de E. granulosus (Eg14-3-3.1-4) foram clonadas e as proteínas recombinantes foram expressas e purificadas. A avaliação do padrão de expressão demonstrou a presença destas proteínas em diferentes componentes do metacestódeo de E. granulosus, incluindo componentes da interface parasito-hospedeiro. Os papéis desempenhados por proteínas Eg14-3-3 na biologia do parasito foram inferidos a partir dos repertórios de proteínas que interagem com cada isoforma recombinante, sendo avaliados por gel overlay, cross linking, ensaio de cromatografia de afinidade e posteriormente identificadas por espectrometria de massa. Um total de 95 proteínas de interação com as proteínas Eg14-3-3 foi identificado. As isoformas Eg14-3-3 apresentaram ligantes compartilhados (44 proteínas), indicando sobreposição de algumas funções, mas elas também se ligam a parceiros exclusivos (51 proteínas), o que sugere uma especialização funcional das Eg14-3-3.1-4. Esses repertórios de ligantes indicam o envolvimento das proteínas Eg14-3-3 em várias vias bioquímicas no metacestódeo de E. granulosus. Neste estudo foi possível caracterizar as proteínas 14-3-3 de Echinococcus spp. e evidenciar os possíveis papéis que estas proteínas podem desempenhar no metacestódeo, sugerindo sua participação em mecanismos moleculares relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento do cisto hidático no hospedeiro intermediário. / The 14-3-3 family, formed by conserved regulatory proteins, was studied in Echinococcus spp. parasites, the causative agents of different forms of hydatid disease. The genomes of Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis code each for six 14-3-3 isoforms (Eg14-3-3.1-6 and Em14-3-3.1-6, respectively) with conserved sequences and structures between orthologues. E. granulosus and E. multilocularis 14-3-3 gene/protein structures were analyzed and their phylogenetic relationships were established with ortholog proteins from a wide range of eukaryotic species. The four 14-3-3 coding sequences expressed in E. granulosus metacestode (Eg14-3-3.1-4) were cloned and the corresponding recombinant proteins were expressed and purified. The evaluation of the expression pattern of Eg14-3-3.1-4 demonstrated the presence of these proteins in different components of E. granulosus metacestode, including interface components with the host. The roles played by Eg14-3-3 proteins in parasite biology were inferred from the repertoires of interacting proteins with each recombinant isoform, assessed by gel overlay, cross linking, affinity chromatography assays and identified by mass spectrometry. A total of 95 Eg14-3-3 protein ligands was identified. Eg14-3-3 isoforms have shared partners (44 proteins), indicating some overlapping functions, but they also bind exclusive partners (51 proteins), suggesting Eg14-3-3 functional specialization. These ligand repertoires indicate the involvement of Eg14-3-3 proteins in multiple biochemical pathways in the E. granulosus metacestode. It was possible to characterize the proteins 14-3-3 of Echinococcus spp. and evidence the possible roles played by these proteins in the metacestode, suggesting their participation in molecular mechanisms related to the survival and development of the hydatid cyst in the intermediate host.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cystic echinococcosis (CE) is a zoonotic disease caused by Echinococcus genus. The larval stage (hydatid cyst) of the parasite causes serious public health problems, and affects various species of animals, causing economic losses to the meat industry. This study aimed to identify samples of fertile hydatid cysts in cattle and characterize them molecularly, analyzing in vitro and ex vivo Melaleuca alternifolia oil activity (tea tree oil - TTO) and its formulation in nanoemulsion (NE-TTO) and saris an (terpinen 4-ol) front to protoscolices of Echinococcus spp. Two thousand three hundred and ninety-six samples with cysts derived from an abattoir in the central region of the RS were analyzed, where 295 samples were classified as hydatid cysts by the presence of protoscolices. In PCR reactions for the 12S gene, 251 positive samples were identified for the group of genotypes G5/G6/G7 (E. ortleppi/ E. canadensis) and 40 samples for the G1 genotype (E. granulosus sensu stricto). In PCR subsequently, 250 samples were positive for G5 (E. ortleppi) and one sample for G7 (E. canadensis). A sample (n=12) of PCR products using the region of cox I gene, which was sequenced and compared with samples deposited in Genbank. Phylogenetic analysis identified three distinct groups E1, E2 and E3, which were grouped in sequences with greater similarity. The organ most affected by echinococcosis in cattle was the lung. After confirming the fertility of the cyst, protoscolices were removed and evaluated for viability using eosin 0.1%. For in vitro testing, concentrations of 2.5, 5 and 10 mg/mL of TTO, 10mg/mL of NE-TTO and 1, 1.5 and 2 mg/mL of terpinen-4-ol were analyzed front to protoscolices of E. ortleppi previously identified, in times of 5, 10, 15 and 30 minutes. For ex vivo test, TTO 10mg/mL and 20mg/mL was injected directly into hydatid cysts of E. ortleppi (n = 20) at times of 5, 15 and 30 minutes, and for each time one aliquot of protoscolices was removed for feasibility detection and implementation of PCR to confirm the species involved in the parasitism. Results of this in vitro study showed the protoscolicidal effect of M. alternifolia in all tested formulations and concentrations. Terpinen-4-ol (2mg/mL) had a better action when compared with the highest concentration of pure oil (TTO 10mg/mL). Nanoemulsion formulations (10mg/mL) showed a good activity front to the protoscolices. In ex vivo analysis, TTO (20mg/mL) showed 100% protoscolicidal action in hydatid cyst in 15 minutes. This study is pioneer in Brazil in identifying the potent effect of protoscolicidal M. alternifolia front protoscolices of E. ortleppi, being this kind of Echinococcus genus responsible for most fertile hydatid cysts analyzed in cattle in RS. / A equinococose cística (EC) é uma infecção zoonótica causada por parasito do gênero Echinococcus. O estágio larvário (cisto hidático) do parasito causa sérios problemas de saúde pública, além de acometer várias espécies de animais, ocasionando prejuízos econômicos à indústria de carnes. Neste contexto, o objetivo desse estudo foi identificar amostras de cistos hidáticos férteis em bovinos e caracterizá-las molecularmente, além de analisar in vitro e ex vivo a atividade anti-helmíntica do óleo de Melaleuca alternifolia (TTO), bem como sua formulação em nanoemulsão (NE-TTO) e seu componente majoritário (terpinen 4-ol) frente aos protoescóleces de Echinococcus spp. Foram analisadas 2396 amostras de cistos oriundos de bovinos abatidos em frigorífico da região central do RS, onde 295 amostras foram classificadas como cistos hidáticos pela presença de protoescóleces. Nas reações de PCR para o gene 12S, pode-se identificar 251 amostras positivas para o grupamento de genótipos G5/G6/G7 (E. ortleppi/ E. canadensis) e 40 amostras para o genótipo G1 (E. granulosus sensu stricto). Em subsequente PCR foram identificadas 250 amostras positivas para G5 (E. ortleppi) e uma amostra positiva para G7 (E. canadensis). Uma amostragem (n=12) dos produtos de PCR utilizando o gene da região cox I, foi sequenciada e comparada com amostras depositadas no Genbank. A análise filogenética identificou três grupos distintos E1, E2 e E3, onde agruparam-se sequências com maior similaridade. O órgão mais acometido pela parasitose em bovinos foi o pulmão. Após a confirmação da fertilidade do cisto, os protoescóleces foram retirados e avaliados quanto à viabilidade utilizando eosina 0.1%. Para o teste in vitro, concentrações de 2.5, 5 e 10mg/ml de TTO, 10mg/ml de NE-TTO e 1, 1.5 e 2mg/ml de Terpinen 4-ol foram analisadas frente aos protoescóleces de E. ortleppi previamente identificados, nos tempos de 5, 10, 15 e 30 minutos. Para o teste ex vivo, TTO 10mg/ml e 20mg/ml foi injetado diretamente em cistos hidáticos de E. ortleppi (n=20) nos tempos de 5, 15 e 30 minutos, para cada tempo foi retirada uma alíquota de protoescóleces para detecção da viabilidade e realização do PCR para confirmação da espécie envolvida na parasitose. Os resultados deste estudo in vitro indicaram efeito protoescolicida de M. alternifolia em todas as formulações e concentrações testadas. O Terpinen 4-ol (2mg/ml) obteve uma melhor ação quando comparado com a maior concentração testada do óleo puro (TTO 10mg/ml). As formulações em nanoemulsão (10mg/ml) demonstraram atividade frente aos protoescóleces. Na análise ex vivo, TTO (20mg/ml) apresentou 100% de ação protoescolicida no cisto hidático em 15 minutos. O presente estudo torna-se pioneiro no Brasil a identificar o potente efeito protoescolicida de M. alternifolia frente aos protoescóleces de E. ortleppi, sendo essa espécie do gênero Echinococcus a responsável pela maior parte dos cistos hidáticos férteis analisados em bovinos no RS.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Echinococcosis is a zoonotic infection caused by a metacestóide belonging to the family Taeniidae genus Echinococcus. The larval stage (hydatid cyst) of the parasite causes serious public health problems, and achieves several species of animals, including livestock production, leading to economic losses to the meat industry. Echinococcosis is considered endemic in many countries and in South America the most affected countries are Argentina, Uruguay, Peru, Bolivia, Chile and southern part of Brazil. In the State of Rio Grande do Sul (RS), especially border regions with Argentina and Uruguay, there is a higher prevalence of cases affecting mainly sheep and cattle, consisting Echinococcus granulosus the most prevalent specie. The parasite control should be based on adequate knowledge of the transmission cycle and taxonomy of the parasite. It is essential to predictive epidemiological surveillance, in cases of disease, the determination of appropriate treatment actions. The identification of species and strains within the genus, as well as recognition of the geographical area infested by the parasite is essential for the establishment of programs to control equinococosis. Molecular tools are used in the identification and characterization of this parasite due to be quick, efficient and safe techniques, favoring an accurate diagnosis of the disease and assisting in the development of control programs, as well as in the prevention of cystic echinococcosis. Given the importance of epidemiological data of cystic echinococcosis in the state of RS, this study aimed to perform the identification and molecular characterization of cysts in swine viscera, in order to identify sources of cystic echinococcosis in rural properties belonging to the central / north areas of Rio Grande do Sul, as well as characterize the species and strains present in the hydatid cysts evaluated. For that, the present work analyzed viscera of swines from a slaughterhouse located in the central/north region of RS. A total of 3,101,992 swines were slaughtered from January 2008 to January 2012 in its facilities. Of these, 58 animals presented cysts, which had morphology compatible with hydatid cyst. Molecular and macroscopic analyses of the cysts were carried out. To perform the PCR (polymerase chain reaction), a gene fragment of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COX-I) was used. Macroscopic analysis showed cysts of varying sizes and shapes. Molecular characterization showed up: Echinococcus spp. (10.3%), Taenia hydatigena (56.9%) and inconclusive (32.8%). For molecular analysis, the neighbor-joining method was used, which identified two distinct groups characterized within species Echinococcus granulosus sensu lato. E. granulosus sensu stricto G1 strain was identified in 2 samples and E. canadensis strain G7 in 3 samples. With this results stands out the epidemiological role of swines, acting as an intermediate host of Echinococcus spp. and their potential for transmission of strains to humans in southern Brazil. Thus, it is necessary a constantly vigilance and an accurate identification of cysts, avoiding then, unreliable results, and allowing to follow up the spread of cystic echinococcosis in the State of RS. / Equinococose é uma infecção zoonótica causada por um metacestóide pertencente à família Taeniidae e gênero Echinococcus. O estágio larvario (cisto hidático) do parasito causa sérios problemas de saúde pública, além de atingir várias espécies de animais, acarretando prejuísos econômicos à indústria de carnes. A equinococose é considerada endêmica em alguns países, sendo que na América do Sul os países mais acometidos são Argentina, Uruguai, Peru, Bolívia, Chile e parte sul do Brasil. No Rio Grande do Sul (RS), principalmente em regiões de fronteira com Argentina e Uruguai, há uma ocorrencia maior de casos, acometendo preferencialmente ovinos e bovinos, sendo que a espécie prevalênte no estado é o Echinococcus granulosus. O controle do parasito deve ser baseado no adequado conhecimento do ciclo de transmissão e de sua taxonomia, sendo essencial à vigilância epidemiológica preditiva. A identificação da espécies e cepas dentro do gênero Echinococcus, assim como o reconhecimento de áreas geográficas contaminadas pelo parasito é essencial para o estabelecimento de programas de controle da equinococose. As ferramentas moleculares são utilizadas na identificação e caracterização deste parasito com rapidez, eficácia e segurança, favorecendo um diagnóstico preciso desta enfermidade. Diante da importância de dados epidemiológicos acerca da equinococose cística no estado de RS, este estudo teve como objetivo, realizar a identificação e a caracterização molecular de cistos em vísceras suínas, a fim de localizar possíveis focos da equinococose cística em propriedades rurais na região centro/norte do Rio Grande do Sul, bem como caracterizar a espécie e cepa presente nos cistos hidáticos. Neste trabalho foram analisadas vísceras suínas oriundas de frigoríficos da região centro/norte do RS. Um total de 3.101.992 suínos foram abatidos na região estudada no período de janeiro de 2008 a 2012, destes, 58 animais continham cistos, apresentando morfologia compatível com cisto hidático. Foram realizadas análises macroscópicas e moleculares em todos os cistos encontrados. Para a realização da PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizou-se um fragmento do gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade I (cox-I). Análise macroscópica constatou cistos de formas e tamanhos variados. Na caracterização molecular, evidenciou-se Echinococcus spp. (10,3%), Taenia hydatigena (56,9%) e inconclusivos (32,8%). Para análise molecular empregou-se o método de Neighbor-Joining, onde identificou-se dois grupos distintos caracterizados dentro da espécie Echinococcus granulosus sensu lato. O E. granulosus stricto sensu cepa G1 foi identificado em 2 amostras e E. canadensis cepa G7 em 3 amostras. Os resultados evidenciam o papel epidemiológico dos suínos, atuando como hospedeiro intermediário de Echinococcus granulosus sensu lato e seu potencial na transmissão de cepas infectantes para humanos no sul do Brasil. Desta forma é necessário uma monitorização constante e rigorosa identificação de cistos, evitando resultados não fidedignos, a fim de monitorar a propagação da equinococose cística no estado do RS.