A taxonomia dos cestóides do gênero Echinococcus está submetida a constante revisão. Dez espécies são atualmente aceitas para Echinococcus, duas delas são o Echinococcus oligarthrus, agente causador da equinococose unicística, e o Echinococcus vogeli, agente causador da equinococose policística e que parece ser a espécie mais patogênica do gênero. Existem haplótipos que ainda não foram determinados como espécies e permanecem dentro da categoria de variantes genéticas. Atualmente, os estudos genéticos em Echinococcus concentram-se na análise do DNA mitocondrial, um genoma que não recombina, de rápida evolução, e de herança materna na maioria dos animais. Além disso, esses estudos têm se concentrado em E. granulosus e E. multilocularis, usando uma ou poucas amostras de Echinococcus neotropical. Este estudo teve como objetivo analisar, utilizando sequências nucleares, a composição genética das duas espécies neotropicais, visando colaborar para a compreensão dos processos evolutivos do gênero Echinococcus e, consequentemente, contribuir para o correto manuseio do parasito nas regiões afetadas. No total, foram utilizados 45 isolados para extração de DNA e subsequentes análises, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi e 1 E. multilocularis. As espécies foram determinadas a partir da amplificação e análise da sequência parcial (366 pb) do gene mitocondrial da citocromo-oxidase (cox1). Para os 45 isolados, 6 diferentes alvos nucleares (P-29, EG10, AG4, Ir, Er e TGF) foram amplificados por PCR e os diferentes genótipos foram selecionados através da técnica de SSCP. Os loci mais polimórficos encontrados em E. vogeli foram Ag4 e E10, ambos com 2 alelos, e nos loci Ir, Er, P-29 e Tgf, com um alelo. E. oligarthrus tem alelos exclusivos para cinco dos seis loci nucleares analisados; contudo, o alelo T2, do locus Tgf, também está presente em seis isolados de E. vogeli. O fluxo gênico entre as metapopulações de E. vogeli das duas áreas geográficas parece ser restrito. Além disso, o fluxo gênico entre a população de E. oligarthrus e as demais populações é restrito. A AMOVA revelou que o nível mais significante de variabilidade genética ocorre dentro das metapopulações, o segundo nível mais significativo foi encontrado entre as metapopulações dentro das suprapopulações do Acre e Pará. Os isolados amostrados no estado do Acre parecem formar um “cluster” distinto. Além disso, foi possível verificar que os isolados de E. vogeli amostrados no estado do Pará também tendem a constituir um “cluster” único, mas de forma menos uniforme. Os 11 haplótipos mitocondriais de E. vogeli constituem um grupo monofilético e distinto de E. oligarthrus e das demais espécies do gênero. / Cestodes of the genus Echinococcus are subjected to a constant taxonomic revision. Ten species are currently accepted for the genus Echinococcus, two of them are Echinococcus oligarthrus, the agent of unicystic echinococcosis and Echinococcus vogeli, the agent of polycystic echinococcosis, which seems to be one of the most pathogenic species of Echinococcus. There are haplotypes that have not been determined as species and remain within the genetic variants category. Currently, the genetic studies on Echinococcus have focused on the analysis of mitochondrial DNA, a non-recombining, fast evolving and maternally inherited genome in most animals. Besides, these studies have been concentrated in the E. granulosus and E. multilocularis, using one or few samples from neotropical Echinococcus. This study aimed to analyze, using nuclear sequences, the genetic composition of the two neotropical species, which may support the understanding of evolutionary processes on the genus Echinococcus and, consequently, will contribute to the correct handling of the parasite in the affected regions. A total of 45 isolates were used for DNA extraction and further analyses, 38 E. vogeli, 4 E. oligarthrus, 1 E. granulosus, 1 E. ortleppi and 1 E. multilocularis. The species were determined by amplification and sequence analysis of a partial sequence (366 bp) of the mitochondrial cytochrome oxydase 1 gene (cox1). For the 45 isolates, 6 different nuclear targets (P-29, Eg10, Ag4, Ir, Er and Tgf) were amplified by PCR and the genotypes were screened by SSCP technique. In E. vogeli, the most polymorphic loci found were Ag4 and E10, both with 2 alleles, and the Ir, Er, P-29 and Tgf loci with 1 allele. E. oligarthrus has exclusive alleles for five of the six analyzed nuclear loci. However, the allele T2, from Tgf locus, is also present in six E. vogeli isolates. The gene flow between the metapopulations of E. vogeli seems to be restricted. In addition, the gene flow between the E. oligarthrus population and the other populations of E. vogeli is restricted. The AMOVA revealed that the most significant level of genetic variability occurs within metapopulations, and the second most significant level of variability was found among metapopulations within suprapopulations of Acre and Pará. Isolates sampled in Acre seems to form a distinct cluster. Furthermore, it was possible to verify that the E. vogeli isolates sampled in Pará also are likely to form a single "cluster", but less uniform. The 11 mitochondrial haplotypes of E. vogeli constitute a monophyletic group and distinct from E. oligarthrus and other Echinococcus species.

Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos. / The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms.

Parasitos pertencentes ao gênero Echinococcus são platelmintos que necessitam de dois hospedeiros para completar o seu ciclo de vida. Durante a fase larval expressam abundantemente uma proteína chamada Antígeno B (AgB), que é uma lipoproteína oligomérica com massa molecular de aproximadamente 150 kDa formada por subunidades de 8 kDa. As subunidades do AgB são codificadas por pelo menos cinco genes (AgB1-5), com similaridade superior a 70%. A função da proteína nativa tem sido relacionada com a modulação da resposta imune do hospedeiro intermediário, ocasionando um viés para a resposta Th2 e com a detoxificação de metabólitos lipídicos no interior do cisto. Neste trabalho, foi avaliada a ocorrência de rearranjos entre os loci gênicos AgB1-5 durante a fase larval de E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi através de Southern blot e de variação do número de cópias dentro de um mesmo cisto de E. granulosus sensu stricto por qPCR. Também foram determinadas a diversidade de seqüências destes cinco genes durante a fase adulta de E. granulosus sensu stricto através de clonagem e o seqüenciamento de produtos de PCR obtidos a partir de um único verme, bem como foram desenvolvidos anticorpos policlonais contra a proteína recombinante dos cinco genes descritos e contra um peptídeo sintético representante do gene AgB2. As diferenças na organização dos genes do AgB entre cistos foram analisadas em três isolados de E. granulosus sensu stricto e três isolados de E. ortleppi por Southern blot. O padrão de bandas de hibridização revelou que esta família gênica contém pelo menos nove genes em E. granulosus sensu stricto e dez em E. ortleppi. Foram observadas diferenças entre os cistos de E. ortleppi quanto ao padrão de bandas de AgB3, o que indicaria a ocorrência de rearranjos. A análise do número de cópias dos genes AgB1-5 em protoescóleces de um único cisto revelou uma grande heterogeneidade no número de cópias de todos os genes do AgB analisados, muitas vezes superiores a 10 vezes entre os protoescóleces. A grande divergência entre os protoescóleces sugere que o mecanismo responsável pela variação origine elementos de DNA instáveis. A diversidade de seqüências dos genes do AgB1-5 do verme adulto foi menor que a encontrada na fase larval. Interessantemente, o verme adulto analisado neste trabalho apresentava seqüências típicas de duas espécies, AgB2 e Mdh de E. ortleppi e AgB1, AgB3, AgB4 e AgB5 além do haplótipo mitocondrial de Cox1 de E. granulosus sensu stricto. Esta é a primeira vez que um verme adulto, possivelmente hibrido, de Echinococcus é encontrado, e indica que o intercruzamento entre E. granulosus sensu stricto e E. ortleppi pode gerar organismos viáveis. A síntese de anticorpos contra cada uma das cinco subunidades do AgB descritas foi obtida pela inoculação de proteína recombinante (recAgB1-5) em camundongos BALB/c. Embora todas as proteínas recombinantes tenham sido imunogênicas, observou-se reação cruzada entre elas, e apenas os anticorpos contra recAgB3 e recAgB4 foram mais reativos contra a proteína inoculada. Para melhorar a especificidade dos anticorpos, sintetizou-se oligopeptídeos de 12-15 aminoácidos representativos de cada subunidade acoplados a uma proteína carreadora (oliAgB1-5) e imunizaram-se camundongos BALB/c. A análise do soro obtido dos camundongos revelou que dos cinco peptídeos testados, apenas oliAgB2 foi imunogênico e apresentou uma resposta específica. / Parasites belonging to the genus Echinococcus are flatworms that require two hosts to complete their lifecycle. During their larval stage, Echinococcus abundantly expresses a protein called antigen B (AgB), which is a 150 kDa oligomeric lipoprotein composed by 8 kDa subunits. AgB is encoded by at least five genes (AgB1-5) with similarity above 70%. The function of native protein has been related to the modulation of host immune responses leading towards a Th2 cellular response bias. The protein is also involved with detoxification of lipid metabolites inside the cyst. In this study we evaluated the occurrence of rearrangements within AgB1-5 loci on metacestodes of E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi using Southern blot and the variation at AgB number of copies within an E. granulosus sensu stricto cyst by qPCR. We also analyzed the sequence diversity of these five genes during the adult stage of E. granulosus sensu lato by cloning and sequencing PCR products obtained from a single adult worm. Finally, we have developed antibodies against AgB1- 5 recombinant proteins (recAgB1-5) and against a synthetic peptide representative of subunit AgB2. The differences in AgB gene organization among isolates were analyzed in three E. granulosus sensu stricto and three E. ortleppi cysts. The banding pattern revealed that this gene family contains at least nine genes in E. granulosus sensu stricto and ten in E. ortleppi. Differences in the AgB3 banding pattern were observed among the E. ortleppi cysts, which would indicate the occurrence of rearrangements. The AgB1-5 number of copies analysis in protoscoleces from a single cyst revealed a large heterogeneity of all AgB genes analyzed, often more than 10 times between protoscoleces. The large divergence among protoscoleces suggests that the mechanism responsible for copy number variation originates unstable DNA elements. The sequence diversity of AgB within an adult worm was lower than that found in the larval stage. Interestingly, the adult worms examined in this study showed typical sequences of two species: AgB1, AgB3, AgB4 and AgB5, as well as the Cox1 mitochondrial haplotype, are similar to E. granulosus sensu stricto sequences and Mdh and AgB2 were identical to those described for E. ortleppi. That is the first time that an adult worm of Echinococcus possibly hybrid is found, and it may indicate that the cross fertilization between E. granulosus sensu stricto and E. ortleppi generates viable organisms. Antibodies against each of the five subunits of AgB described were obtained by inoculating BALB/c mice with recombinant proteins recAgB1-5. Although every recombinant protein was immunogenic, we observed crossreaction between them, and only the response against recAgB3 and recAgB4 showed some specificity. To improve the antibody specificity, we synthesized oligopeptides of 12-15 amino acids representative of each AgB subunit (oliAgB1-5) coupled to a carrier protein and used these antigens to immunize BALB/c mice. Analysis of serum obtained from mice showed that only one of five oligopeptides tested (oliAgB2) was immunogenic, and it leads to a specific response.

Echinococcus granulosus es el agente causal de la hidatidosis unilocular, patología de carácter endémico en amplias zonas de Perú. Actualmente la metodología del análisis molecular del ADN se ha utilizado para enriquecer los conocimientos sobre este parásito, a través del aislamiento de sus genes, el estudio de su estructura y organización, así como la expresión de los mismos. La aplicación de estas técnicas ha reconocido en E. granulosus un mínimo de 10 variedades o cepas. La taxonomia y el estatus filogenético de las cepas de E. granulosus es controversial y esta bajo discusión; su variación genética ha sido analizada por la variación de las secuencias de los nucleótidos dentro de las regiones mitocondriales y nucleares del DNA. Estas variantes son referidas como cepas y han sido generalmente asignadas con el nombre del hospedero intermediario involucrado en el ciclo biológico del parásito. Se ha identificado la existencia de 10 genotipos (G1 – G10) de E. granulosus, esta variabilidad tiene implicaciones importantes en la patología de la enfermedad, desarrollo de vacunas, diagnóstico y administración de drogas efectivas. En esta investigación, se han aislado quistes hidatídicos de ovinos, bovinos, porcinos y camélidos sudamericanos procedentes de Ayacucho, Cuzco, Pasco y Puno, departamentos pertenecientes a la sierra central y sur del Perú. La extracción del DNA fue con fenol –cloroformo – alcohol isoamílico; se aplicó un Nested-PCR usando el gen ribosomal ITS-1 y la genotipificación se hizo en base al uso de diferentes enzimas de restricción. De los dos patrones encontrados, los fragmentos producidos en el Nested- PCR fue amplificado y directamente secuenciado y a través de programas bioinformáticos se determinó la presencia de 2 variantes, una de las cuales corresponde a G1 y la otras probablemente restringida a nuestros camélidos sud-americanos. / Unilocular hidatidosis’s disease whose etiological agent is the tapeworm Echinococcus granulosus, affects differents endemic zones in Peru. At this time, the methodology of the molecular analysis of the DNA has been used for the knowledge of this parasite through isolation of its genes, the study of its structure and organization, as well as the expression of the same. The application of these techniques has revolutionized the study of this parasite, recognition a minimum of ten strains. The taxonomic and phylogenetic status of Echinococcus granulosus strains are still controversial and under discussion; genetic variation in E. granulosus has been analyzed for DNA nucleotide sequence variation within of the region mitochondrial and nuclear region of the ribosomal of DNA. These variants are referrend to as strains, and they have been generally named after their typical intermediate hosts. To date, 10 genotypes (G1 – G10) of Echinococcus granulosus have been identified; this variability has important implications for the pathology of the disease, development of vaccines, diagnostic reagents and drugs effective against this parasite. In this research, we isolate different hydatic cysts from ovines, bovines, pork and sudamerican camels, this samples was get from Ayacucho, Cuzco, Pasco and Puno, all belong from central highland and south of Peru. The DNA extraction was done with phenol- cloroform- isoamil alcohol. We did Nested-PCR using primers from ribosomal genes ITS-1, and then the genotyping was done with RFLP PCR using different cutting restriction enzymes. We found two genetics patterns. The representatives patterns, their fragments produced by nested-PCR were amplified and directly sequenced and then with Bioinformatics programs determine one patters belong G1 and others was probably restricted from south-American camels that live in high altitudes in Peru. Although the number of Peruvian isolates examined was not extensive, the G1 genotype (113/120) was far more prevalent in domestic animals.

Thesis (Ph.D.) - University of Queensland, 2003. / Includes bibliography.

A expressão “proteínas moonlighting” refere-se a um subgrupo de proteínas multifuncionais, onde duas ou mais funções são realizadas por uma mesma cadeia polipeptídica. Dentre as proteínas com funções moonlighting estão diversas enzimas glicolíticas que podem desempenhar papeis importantes em processos-chave na biologia de organismos parasitas, como os de motilidade, adesão, invasão e diferenciação. A aldolase, a enolase e a lactato-desidrogenase (LDH) estão entre as enzimas que foram detectadas nos produtos de excreção-secreção (ES) e em tecidos de interface com o hospedeiro de Echinococcus granulosus, o cestódeo causador da hidatidose cística em seres humanos e ungulados domésticos. Neste contexto, a caracterização destas enzimas pode revelar possíveis funções moonligthing por elas desempenhadas e contribuir para a compreensão de aspectos básicos do desenvolvimento do parasito e de possíveis mecanismos de interação com os hospedeiros. Inicialmente, as sequências codificadoras da aldolase (EgAldo), da enolase (EgEno) e da LDH (EgLDH) de E. granulosus foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em um vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli, para a produção das proteínas recombinantes correspondentes (rEgAldo, rEgEno e rEgLDH, respectivamente). Soros de pacientes humanos com hidatidose reconhecem, em imunoblots, a EgAldo e EgEno nativas mas não reconhecem as proteínas recombinantes correspondentes, sugerindo o envolvimento de epitopos não proteicos no reconhecimento desses antígenos. Antissoros policlonais contra a rEgAldo e a rEgEno evidenciaram, em protoescólices, uma localização predominantemente citoplasmática para as proteínas nativas cognatas. Elas também foram detectadas na camada germinativa e no líquido hidático, que representam interfaces entre o parasito e o hospedeiro. Além disso, tanto a EgAldo como a EgEno foram reconhecidas em frações de proteínas tegumentares e em produtos de ES de protoescólices, localizações sugestivas de funções moonlighting. Proteínas do parasito e do hospedeiro intermediário que interagem com as proteínas rEgAldo, rEgEno e rEgLDH foram recuperadas por experimentos de GST pull-down para posterior identificação destas proteínas por espectrometria de massas. A identificação destas proteínas de interação poderá apontar processos não-glicolíticos nos quais estas enzimas estejam envolvidas. / The term “moonlighting proteins” refers to a subset of multifunctional proteins in which two or more different functions are performed by one polipeptide chain. Among the proteins described as moonlighting, there are many glycolytic enzymes that play important roles in key processes in the biology of parasites, such as motility, adhesion, invasion and cell differentiation. Aldolase, enolase and lactate dehydrogenase are among the enzymes that have been detected in the excretory-secretory (ES) products and in the host-interacting metacestode components from Echinococcus granulosus, a cestode that causes cystic hydatid disease and affects both humans and livestock. In this context, the characterization of these enzymes may reveal possible moonlighting functions they perform and contribute to the understanding of basic aspects of the parasite development and differentiation and possible interaction mechanisms with the intermediate host. Initially, the complete coding sequences from E. granulosus aldolase (EgAldo), enolase (EgEno) and lactate dehydrogenase (EgLDH) were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production (rEgAldo, rEgEno and rEgLDH, respectively). Sera from human hydatid disease patients recognize in immunoblots the native EgAldo and EgEno, but not its recombinant counterparts, which was taken as evidence of involvement of non proteic epitopes in the EgAldo and EgEno recognition. Polyclonal antiserum against rEgAldo and rEgEno have shown, in protoscoleces, a predominantly cytoplasmic localization for the cognate native proteins, as expected for glycolytic enzymes. They have also been detected in the germinal layer and hydatid fluid, which represent host-parasite interfaces. Furthermore, both EgAldo and EgEno were recognized in protoscoleces tegument extracts and in ES products from these parasites in culture, which are indicative of moonlighting functions. Parasite and intermediate host proteins that interact with proteins rEgAldo, rEgEno and rEgLDH in vitro were recovered by GST pull-down assays and the identification of these proteins will be performed using mass spectrometry. Identification of interacting proteins may also be an indication that these enzymes perform nonglycolytic functions.

As proteínas 14-3-3 formam uma família altamente conservada, expressas em todos os organismos eucariotos já estudados. Através da interação com seus alvos, as proteínas 14-3-3 participam de importantes processos celulares, como controle do ciclo celular, apoptose, transdução de sinal e diferenciação celular. Neste trabalho, essa família gênica foi estudada em Echinococcus granulosus e em Echinococcus multilocularis, as espécies de maior importância do gênero Echinococcus. E. granulosus e E. multilocularis, na fase larval, são agentes etiológicos da hidatidose cística e da hidatidose alveolar, respectivamente, zoonoses associadas a grandes prejuízos na área da pecuária e a gastos no tratamento de pacientes humanos. Por meio da análise dos bancos de dados disponíveis e comparação com os dados genômicos, neste estudo, seis potenciais genes codificadores de proteínas 14-3-3 foram identificados para ambas as espécies, sendo denominados Eg14-3-3 e Em14-3-3 para E. granulosus e E. multilocularis, respectivamente. Análises filogenéticas das sequências preditas de aminoácidos codificadas por esses genes demonstram que as proteínas Eg14-3-3 e Em14-3-3 retêm características ancestrais, não se agrupando claramente com proteínas ortólogas de outros organismos quanto ao tipo de isoforma (zeta e épsilon), como ocorre, por exemplo, em mamíferos. A fim de caracterizar funcionalmente as proteínas Eg14-3-3, o padrão de expressão das isoformas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 foi avaliado. A identificação dessas isoformas em componentes do metacestódeo de E. granulosus que representam interfaces parasito-hospedeiro sugere a possível participação dessas proteínas em mecanismos de interação com o hospedeiro. Estudos para a identificação dos ligantes protéicos que interagem com as proteínas Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 também foram realizados. Entre os ligantes identificados estão chaperonas, proteínas associadas à conversão de energia, citoesqueleto, e transporte e metabolismo de carboidratos. Essas interações apontam o envolvimento da família proteica 14-3-3 em mecanismos que promovem o estabelecimento e sobrevivência de E. granulosus. A caracterização das interações identificadas neste estudo poderá auxiliar na elucidação de aspectos biológicos básicos do parasito, e mecanismos moleculares utilizados para o desenvolvimento e manutenção do metacestódeo nas vísceras do hospedeiro intermediário por longo período de tempo. / The 14-3-3 proteins form a highly conserved family, and have been shown to be actively expressed in all eukaryotic organisms studied so far. Through interaction with their targets, the 14-3-3 proteins participate in some of the major eukaryotic cellular processes, such as cell cycle regulation, apoptosis, signal transduction, and cell differentiation pathways. In the present work, this gene family has been studied in two species of the genus Echinococcus, namely Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis, which, in their larval stage, are the causative agents of the cystic hydatid disease and the alveolar hydatid disease, respectively, two economically relevant zoonotic diseases associated with livestock production losses and human health care expenditures. Through analysis and comparison of available database, and searches in Echinococcus sequencing genome data, six candidate genes encoding 14-3-3 proteins were identified in both species, being named Eg14-3-3 and Em14-3-3 to E. granulosus and E. multilocularis, respectively. Interestingly, the phylogenetic analyses of deduced amino acid sequences encoded by these genes showed that Eg14-3-3 and Em14- 3-3 proteins retain more ancestral characteristics, and do not group clearly with orthologous proteins from other organisms relative to isoform types (zeta and epsilon), as occurs, for example, in mammals. In order to functionally characterize the Eg14-3-3 proteins, the expression patterns of the Eg14-3-3ζ2 e Eg14-3-3ζ3 isoforms were analyzed. The identification of both isoforms in E. granulosus metacestode components, that represent host–parasite interface, suggests a possible participation of these proteins on mechanisms of interaction with the host. Additionally, studies aiming the identification of proteins able to bind to Eg14-3-3ζ2 and Eg14-3-3ζ3 isoforms were carried out. Among the ligands identified, chaperones, proteins associated with energy production and conversion, cytoskeleton and carbohydrate transport and metabolism, were present, suggesting the involvement of 14-3-3 protein family in mechanisms that promote the establishment and survival of E. granulosus. Further characterization of the interactions identified in this study can help to elucidate basic biological aspects of these parasites, as well as molecular mechanisms involved in the development and maintenance of hydatid cyst in within intermediate host tissues for long time.

O antígeno B (AgB) de Echinococcus granulosus é um dos principais componentes do líquido hidático. O AgB é um proteína oligomérica de 120-160 kDa composta de subunidades de 8 kDa, que em SDS-PAGE dissocia-se em componentes de 8, 16, 24 e 32 kDa. Embora diferentes subunidades do AgB tenham sido isoladas, pouco se sabe sobre a estrutura da proteína e do seu mecanismo de oligomerização. Neste trabalho foi realizada a caracterização estrutural de homo-oligômeros de três subunidades recombinantes do AgB, AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3, expressadas a partir de seqüências previamente clonadas Essas subunidades associam-se em homo-oligômeros com características semelhantes às da proteína purificada de líquido hidático, como massa molecular, conteúdo de estrutura secundária, tendência agregativa e termoestabilidade, fazendo deles ferramentas importantes para o estudo da estrutura do AgB. Diferentes graus de estabilidade e compactação foram verificados entre os oligômeros recombinantes, com o oligômero de AgB8/3 apresentando-se mais estável e compacto. Através da modelagem molecular das subunidades do AgB, foi possível calcular a superfície de potencial eletrostático das moléculas e propor um mecanismo de oligomerização envolvendo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Foram também realizadas tentativas de cristalização de oligômeros de AgB8/3 para ensaios de difração de raios X, e cristais foram obtidos em três condições do screening inicial. Estes cristais difrataram à resoluções máximas de 8 Å, não permitindo a coleta de dados estruturais da proteína. Entretanto, estas condições podem ser refinadas para a obtenção de cristais com melhor qualidade. / Echinococcus granulosus antigen B is one of the major components of the hydatid fluid. AgB is a oligomeric protein of 120-160 kDa composed by 8 kDa subunits, that in SDS-PAGE dissociates in components of 8, 16 , 24 and 32 kDa. Although different AgB subunits have been isolated, little is known about AgB structure and its oligomerization mechanism. In this work we have performed the homo-oligomers structural characterization of three AgB recombinant subunits, AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3, expressed from previously cloned genes. These subunits self-assemble in homo-oligomers with similar characteristics to that of hydatid fluid purified protein, such as molecular mass, secondary structure content, aggregative tendency and thermostability, making them valuable tools for AgB structure study. Different degrees of stability and compactness were verified between the recombinant oligomers, with the AgB8/3 one showing a more stable and compact structure. Using molecular modelling it was possible to calculate the surface electrostatic potencial of AgB subunits and to propose a mechanism of oligomerization involving electrostatic and hydrophobic interactions. Also crystallization attempts had been carried through with AgB8/3 oligomer to X-ray diffraction, and crystals have been obtained in three conditions of initial screening. These crystals difracted to maximum resolutions of 8 Å, and it was not possible to collect protein structural data. However, these crystallization conditions can be refined in order to obtain crystals of better quality.

Echinococcus granulosus es el agente causal de la hidatidosis unilocular, patología de carácter endémico en amplias zonas de Perú. Actualmente la metodología del análisis molecular del ADN se ha utilizado para enriquecer los conocimientos sobre este parásito, a través del aislamiento de sus genes, el estudio de su estructura y organización, así como la expresión de los mismos. La aplicación de estas técnicas ha reconocido en E. granulosus un mínimo de 10 variedades o cepas.. La taxonomia y el estatus filogenético de las cepas de E. granulosus es controversial y esta bajo discusión; su variación genética ha sido analizada por la variación de las secuencias de los nucleótidos dentro de las regiones mitocondriales y nucleares del DNA. Estas variantes son referidas como cepas y han sido generalmente asignadas con el nombre del hospedero intermediario involucrado en el ciclo biológico del parásito. Se ha identificado la existencia de 10 genotipos (G1 – G10) de E. granulosus, esta variabilidad tiene implicaciones importantes en la patología de la enfermedad, desarrollo de vacunas, diagnóstico y administración de drogas efectivas. En esta investigación, se han aislado quistes hidatídicos de ovinos, bovinos, porcinos y camélidos sudamericanos procedentes de Ayacucho, Cuzco, Pasco y Puno, departamentos pertenecientes a la sierra central y sur del Perú. La extracción del DNA fue con fenol –cloroformo – alcohol isoamílico; se aplicó un Nested-PCR usando el gen ribosomal ITS-1 y la genotipificación se hizo en base al uso de diferentes enzimas de restricción. De los dos patrones encontrados, los fragmentos producidos en el Nested- PCR fue amplificado y directamente secuenciado y a través de programas bioinformáticos se determinó la presencia de 2 variantes, una de las cuales corresponde a G1 y la otras probablemente restringida a nuestros camélidos sud-americanos. Aun cuando el número de aislados no es muy grande, el genotipo G1 (113/120) fue el de mayor prevalencia en los animales muestreados. Echinococcus. granulosus endémico en algunas áreas de Perú, evidencia que los animales infectados con este parásito puede ser un potencial reservorio para infecciones humanas, además nuestros resultados constituyen un aporte importante para los programas de control que realizan una vigilancia continua de sus áreas endémicas a través de la implementación de un adecuado tratamiento de los animales infectados y el adiestramiento de los pobladores acerca de los riesgos de contraer la enfermedad y de las conductas adecuadas para el manejo de órganos infectadas. En particular la existencia de diferentes patrones genéticos ha de contribuir a tomar medidas de importancia epidemiológica y a plantear estrategias posteriores donde el objetivo sea la prevención, tratamiento y control de las infecciones causadas por E. granulosus en sus diferentes hospederos de las distintas zonas endémicas de nuestro país. / -- Unilocular hidatidosis’s disease whose etiological agent is the tapeworm Echinococcus granulosus, affects differents endemic zones in Peru. At this time, the methodology of the molecular analysis of the DNA has been used for the knowledge of this parasite through isolation of its genes, the study of its structure and organization, as well as the expression of the same. The application of these techniques has revolutionized the study of this parasite, recognition a minimum of ten strains. The taxonomic and phylogenetic status of Echinococcus granulosus strains are still controversial and under discussion; genetic variation in E. granulosus has been analyzed for DNA nucleotide sequence variation within of the region mitochondrial and nuclear region of the ribosomal of DNA. These variants are referrend to as strains, and they have been generally named after their typical intermediate hosts. To date, 10 genotypes (G1 – G10) of Echinococcus granulosus have been identified; this variability has important implications for the pathology of the disease, development of vaccines, diagnostic reagents and drugs effective against this parasite. In this research, we isolate different hydatic cysts from ovines, bovines, pork and sudamerican camels, this samples was get from Ayacucho, Cuzco, Pasco and Puno, all belong from central highland and south of Peru. The DNA extraction was done with phenol- cloroform- isoamil alcohol. We did Nested-PCR using primers from ribosomal genes ITS-1, and then the genotyping was done with RFLP PCR using different cutting restriction enzymes. We found two genetics patterns. The representatives patterns, their fragments produced by nested-PCR were amplified and directly sequenced and then with Bioinformatics programs determine one patters belong G1 and others was probably restricted from south-American camels that live in high altitudes in Peru. Although the number of Peruvian isolates examined was not extensive, the G1 genotype (113/120) was far more prevalent in domestic animals. Besides ours dates constitute an important contribution for the Control programs that realize a continuous monitoring of endemic areas through the implementation of a suitable treatment of the animal infected and the training of the settlers about the risks of contracting the disease in contaminated areas and of the conducts adapted for the handling of infected organs. In particular, the existence of different genotypes has to contribute to take measures from importance epidemiologist and to establish strategies where the objective is the prevention, treatment and control of the infections caused by E. granulosus in their different hosts from the different endemic zone from Peru. / Tesis