Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Coorientador: Luis Carlos Spolidorio / Banca: José Francisco Hofling / Banca: Flavia Sammartino Mariano Rodrigues / Banca: Cristiane Duque / Banca: Janaina de Cassia Orlandi Sardi / Resumo: A esporotricose é uma infecção causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckiii, o qual contamina o hospedeiro através de locais com pequenos traumas, causando lesões cutâneas, subcutâneas que podem se disseminar para outros tecidos. Os mecanismos imunológicos envolvidos na prevenção e controle da esporotricose sugerem que a imunidade mediada por células apresenta um importante papel na proteção do hospedeiro contra S. schenckii. Os receptores Toll-like (TLR), presentes nas células do sistema imune inato, destacam-se pelo seu papel central na ligação de patógenos e iniciação da resposta imune. A ativação desses receptores por padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) induz a fagocitose, a liberação de citocinas e mediadores químicos que atuam no sistema imune eliminando ou favorecendo a infecção. O TLR-2 está envolvido na resposta do hospedeiro contra uma variedade de fungos. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a participação do TLR-2 na resposta imunológica induzida pelo S. schenckii. Foram utilizados camundongos C57BL/6 (WT) e C57BL/6 TLR-2 Knockout (TLR-2-/-) para que se conseguisse verificar, durante um período de 10 semanas de infecção esporotricótica, a influência do TLR-2 na produção das citocinas IL-1β, IL-12 e TNF-α por macrófagos; a estimulação dos macrófagos através da liberação de NO, a participação do TLR-2 na geração dos perfis celulares Th1, Th2 e Th17 e, por fim, a influência desse receptor na produção de IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-4, IL-17 e TGF-β. Entre os antígenos do fungo S. schenckii utilizados como estímulo nas culturas celulares, verificou-se que o antígeno lipídico é o mais eficaz na capacidade de estimular a produção dos mediadores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is an infection caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which infects the host through local minor trauma, causing skin and subcutaneous lesions which can spread to other tissues. The immunological mechanisms involved in sporotrichosis prevention and control suggest that cell-mediated immunity plays an important role in protecting the host against S. schenckii. The Toll-like receptors (TLR), found on innate immune system cells, for their central role in pathogen-binding and immune response initiation. The activation of these receptors by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induces phagocytosis and the release of chemical mediators and cytokines which direct the immune system in favoring or eliminating the infection. TLR-2 is involved in host responses against a variety of fungi. Therefore, the aim of this study was to evaluate the involvement of TLR-2 in the immune response induced by S. schenckii. C57BL/6 mice (WT) and C57BL/6 TLR-2 knockout (TLR-2-/-) were used in order to evaluate, over a period of 10 weeks of sporotrichotic infection, the influence of TLR-2 over macrophages production of the cytokines IL-1β , IL-12 and TNF-α, their stimulation level by NO release, the involvement of TLR-2 in the generation of Th1, Th2 and Th17 cell profiles and, finally, the influence of this receptor in the production of IFN -γ, IL-6, IL-10, IL-4, IL-17 and TGF-β. Among all the S. schenckii antigens used as stimulus in cell cultures, it was found that the lipid antigen is the most effective in regard... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease

Cryptococcus sp é um fungo saprófita, cosmopolita, que causa micose sistêmica, geralmente, subaguda ou crônica, conhecida, sobretudo, por sua localização meníngea, após aquisição da infecção por via respiratória Embora seja ubíquo, a criptococose ocorre predominantemente em indivíduos imunodeficientes e podendo ocorrer, também, em indivíduos imunocompetentes. Os estudos experimentais e em humanos avaliando a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos específicos mostram que a resposta inata e de anticorpos são importantes para a delimitação do processo infeccioso por Cryptococcus sp, como também, a administração de anticorpos monoclonais podem induzir uma resposta eficaz na disseminação da doença. O sistema complemento contribui para a defesa do organismo contra o Cryptococcus sp de diferentes maneiras: secretando opsoninas e fatores quimiotáticos e colaborando com a ação dos anticorpos específicos, aumentando a interação entre a imunidade inata e adquirida. Os anticorpos antiglicuroxilomanana (GXM) possuem numerosas atividades biológicas: a) opsonização para fagocitose, b) ativação da via clássica do complemento resultando na deposição precoce de fragmentos de C3 no fungo, c) supressão do excesso de acúmulo de C3 pela via alternativa; d) facilitação do clareamento do GXM do soro in vivo, resultando no maior acúmulo de GXM nos tecidos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear; e) proteção em modelos murinos da criptococose e f) facilitação de vários aspectos da imunidade celular ao Cryptococcus sp. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta humoral ao GXM e às proteínas da parede celular (Ag S) avaliando a atividade do sistema complemento como também a produção de anticorpos específicos em amostras séricas de adultos com e sem neurocriptococose. Foram coletadas 106 amostras de soro e divididas em 3 grupos: grupo 1- 21 indivíduos com neurocriptococose e baixa exposição a levedura, grupo 2- foi composto por 23 indivíduos saudáveis com alta exposição ao fungo e HIV negativos, granjeiros da cidade de Jumirim localizada a 164 km de São Paulo, na região de Sorocaba e, o grupo 3- 60 indivíduos saudáveis, HIV negativos e com baixa exposição ao Cryptococcus sp. Dois pacientes foram excluídos do estudo por apresentarem tumores (timona e câncer de pulmão). O sistema complemento foi avaliado por ensaio hemolítico (CH 50 e AP 50) e, a dosagem da proteína ligadora de manose (MBL) foi feita por ELISA. Os valores de CH 50 estiveram dentro da normalidade em 17/21, 13/23, 59/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. A média dos valores de CH 50 foi diferente significativamente entre o três grupos (P < 0,0001). O grupo 2 mostrou níveis reduzidos significantes em comparação aos dois outros grupos. Os valores de AP 50 estiveram dentro da normalidade em 11/21; 21/23 e 60/60 indivíduos dos grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Houve diferença nos valores de AP 50 (P = 0,0005) e apenas um paciente do grupo 1 apresentou valores indetectáveis desta via. Houve diferença significante na dosagem de MBL entre os três grupos (P = 0,0277). Anticorpos IgG anti-GXM foram quantificados por ELISA e expressos por densidade óptica (DO). IgG anti GXM foi detectado em todos os grupos com diferença significante entre eles (P= 0,0127). As médias de IgG anti- GXM (DO) foram: 1.191 (0,49 a 1.217) no grupo 1, 1.572 (0,815 a 2.479) no grupo 2 e 0,965 (0,321 a 1.295) no grupo 3. Dois indivíduos assintomáticos do grupo 2 tiveram títulos de GXM detectáveis (1/256 e 1/32). Quatro pacientes com neurocriptococose faleceram (19%) e seus resultados mostravam: CH 50 normal, 2/4 tinham valores de AP 50 baixo (12 UI/mL) e indetectável; 3/4 tinham altos níveis de MBL e apenas um tinha baixa DO de IgG anti-GXM. Baseado em nosso estudo, podemos concluir que a resposta humoral (sistema complemento e anticorpos) não é suficiente para explicar a susceptibilidade a neurocriptococose, porém a alta e constante exposição ao Cryptococcus sp pode prevenir o desenvolvimento de doença, ou seja, a constante e intensa exposição ao fungo induz a produção de anticorpos que previnem a doença clínica mas não a infecção. Por outro lado fatores genéticos que determinam as concentrações de MBL podem influenciar na susceptibilidade a neurocriptococose. Os anticorpos contribuem para o clearence de GXM, entretanto as concentrações séricas não se correlacionam com resistência à doença / Cryptococcus sp is a fungal pathogen with a worldwide distribution. Although it is ubiquitous in the environment, cryptococcal disease occurs predominantly in immunocompromised hosts and can also occur in apparently immunocompetent individuals. The innate immunity is of special relevance for the antifungal reaction, as it allows an immediate reaction and recognizes a broad variety of fungal pathogens. The host immune response is a major determinant of the outcome of cryptococcal infection; however, the antibodies response is poorly understood. In addition, most of the studies are experimental and there is restricted knowledge concerning the human immune response. Complement system has soluble factors, restrictive regulator proteins and cellular receptors involved in defense mechanism. Glucuroxylomannan (GXM) monoclonal antibodies (MAbs) have numerous biological activities: a) opsonization for phagocytosis, b) activation of the classical complement pathway leading to early deposition of C3 fragments on the yeast, c) suppression overall accumulation of C3 via the alternative pathway; d) clearance facilitation of GXM from serum in vivo, leading to increased accumulation of GXM in tissues rich in mononuclear phagocyte system; e) protection in murine models of cryptococcosis and f) facilitation of various aspects of cellular immunity to Cryptococcus sp. The goal of our study was to evaluate if the antibody response to GXM and cell wall proteins regarding specific antibodies as well as complement system in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. The aim of our research was to evaluate classical and alternative complement system pathway, to quantify mannose-binding lectin (MBL) as well antibody response to GXM and cell wall proteins (AgS) regarding specific antibodies in sera of immunocompetent adults with and without neurocryptococcosis. One hundred and six samples were collected and classified in 3 groups: group 1- 21 individuals with neurocryptococcosis and low exposure to the yeast; group 2- was composed by 23 healthy individuals, chicken farmings from Jurumirim, a town 164 km to São Paulo, and with high exposure to Cryptoccocus spp and HIV negative. The third group included 60 healthy HIV negative individuals with presumed low exposure to Cryptococcus. Two patients were excluded by report of previous malignancies (timoma and pulmonary cancer). The complement system was evaluated by hemolytic assay and ELISA to MBL. CH 50 and AP 50 values were within the normal range in 17/21; 13/23; 59/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. Mean CH 50 values were significantly different among the three groups (P < 0,0001). Group 2 showed significantly reduced levels in comparison with groups 1 and 3. AP 50 values were within the normal range in 11/21; 21/23; 60/60 patients in groups 1, 2 and 3 respectivelly. There was difference in the AP 50 values (P=0,0005) and one no activation of this pathway in group 1. There was significant difference in MBL among the groups (P = 0,0277). GXM antibodies IgG was measured by ELISA and expressed as optical density (OD). GXM- IgG was detected in all the groups with significant difference among them (P = 0,0127). The means of IgG anti-GXM (OD) were: 1.191 (range 0,49 to 1.217) in group 1, 1.572 (range 0,815 to 2.479) in group 2 and 0,965 (range 0,321 to 1.295) in the group 3. Two of the group 2 individuals had low GXM titers (1/256 and 1/32) and no symptoms. Four patients (4/21; 19%) with neurocryptococcosis died and the results showed: normal classical pathway activation, 2/4 had low (12 UI/mL) or undetectable alternative pathway values ; 3/4 had high MBL concentrations and only one had low OD for IgG anti-GXM. In conclusion, our results suggest that constant and high exposure to Cryptococcus sp can prevent the development of cryptococcosis, i.e. constant and intensive fungal exposition induces protective antibodies to clinical disease but not to the infection. In the other side, genetic factors which determine MBL concentrations could influence the susceptibility to neurocryptococcosis. The antibodies contribute to GXM clearance, however, the concentrations did not correlate with the resistance to the disease