Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung bei Erwachsenen und kann zu schwerwiegenden kardiovaskulären Komplikationen bei den betroffenen Patienten führen. Neben einer Einschränkung der Lebensqualität durch symptomatische Episoden u.a. mit Palpitationen, Schwindel, Dyspnoe und Synkopen kommt es zu einer deutlichen Steigerung des Schlaganfallrisikos. Oftmals liegen zusätzlich strukturelle Herzerkrankungen wie Klappenvitien, eine koronare Herzerkrankung oder eine linksventrikuläre Hypertrophie vor, die das Krankheitsbild weiter verschlechtern. Therapeutisch bieten sich neben der pharmakologischen antiarrhythmischen Behandlung auch invasive Methoden wie die Pulmonalvenenablation an. In dieser Arbeit wurden die Erfolge der unterschiedlichen Therapieoptionen bei Patienten mit Vorhofflimmern und der Indikation zur Pulmonalvenenablation anhand von zwei Patientengruppen verglichen. Während die erste Gruppe mit fünf von den ESC-Leitlinien für die Behandlung von Vorhofflimmern zugelassenen Medikamenten rein konservativ behandelt wurde, erhielten die Patienten in der zweiten Gruppe eine kombinierte Therapie aus Medikamenten und Pulmonalvenenablation. Die untersuchten Medikamente waren Betablocker, Klasse IC-Antiarrythmika, Sotalol, Amiodaron und Dronedaron.Insgesamt konnte ein hochsignifikanter Vorteil der kombinierten Therapie gegenüber der rein pharmakologischen Therapie festgestellt werden. Die besten Langzeitergebnisse zeigten sich bei Patienten, die im Falle eines Rezidivs weitere Ablationen erhielten. Beim Vergleich der Wirkung der unterschiedlichen Medikamente miteinander blieb die Überlegenheit eines der Medikamente über einen langfristigen Therapiezeitraum von zwölf Monaten im überwiegenden Teil der Untersuchungen aus. Signifikante Effektivitätsunterschiede konnten lediglich in der Untergruppe „vor Ablation“ festgestellt werden. Dabei war die Amiodarontherapie effektiver als Betablocker, Klasse IC-Antiarrhythmika und Dronedaron. Sotalol war zudem erfolgreicher als Dronedaron.Trotz des teils zufriedenstellenden Ansprechens der Patienten auf die pharmakologische Therapie ist diese durch das Auftreten von Nebenwirkungen beschränkt. Besonders Amiodaron und Dronedaron sind mit einer nicht zu vernachlässigenden Rate an Nebenwirkungen assoziiert. Mit der Pulmonalvenenablation steht eine effektive alternative Therapieoption zur Verfügung, die insbesondere im Rahmen eines kombinierten Therapieansatzes aus Medikamenten und invasiver Therapie inklusive Reablationen einen hochsignifikanten Vorteil gegenüber der rein konservativen Rhythmuskontrolle bietet.

Kardiale Arrhythmien können zum plötzlichen Herzstillstand (SCD) bei Herzinsuffizienz (HF)-Patienten führen und stellen in diesen Zusammenhang die häufigste Todesursache (> 50 %) dar. Aufgrund der schlechten Prognose werden weitere Therapiemöglichkeiten und Wirkstoffe benötigt. Die Phosphodiesterase 2 (PDE2A), ein cAMP und cGMP hydrolysierendes Enzym, ist im Endstadium bei HF-Patienten hochreguliert. Die PDE2A zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, durch cGMP allosterisch aktiviert zu werden, welches die PDE2A Hydrolyseaktivität vor allem gegenüber cAMP stark steigert. In vorangegangenen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die herzspezifische PDE2A3-Überexpression in Mäusen eine starke anti-arrhythmische Wirkung vermittelt. Andere Studien wiederum zeigten, dass eine pharmakologische Hemmung der PDE2A dem hypertrophen Wachstum von Kardiomyozyten entgegenwirkt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Rolle der PDE2A für die Herzfunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen mit Hilfe eines herzspezifischen PDE2A Knockout Modells zu untersuchen. Weiterhin war das Ziel den PDE2A-vermittelten cGMP/cAMP-Crosstalk-Mechanismus unter Verwendung des natriuretischen Peptids Typ C (CNP) in frisch isolierten murinen sowie humanen von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-KM) zu charakterisieren, um potentielle anti-arrhythmogene kardioprotektive Wirkungen der cGMP-vermittelten PDE2A Stimulation aufzudecken. Zunächst wurde ein neues Mausmodell mit Kardiomyozyten-spezifischer Deletion der PDE2A (PDE2A-KO) unter der Verwendung der „knockout-first“ Strategie generiert und mittels Echokardiographie charakterisiert. Das Fehlen der PDE2A Expression in Kardiomyozyten führte zu keinem veränderten kardialen Phänotyp. Unter chronischen Stressbedingungen nach Isoprenalininfusion (osmotische Minipumpe, 14 Tage) zeigte der PDE2A-KO eine verminderte Kontraktion und Auswurffraktion im Vergleich zu den behandelten Kontrolltieren. Herzfrequenz und Hypertrophie unterschieden sich dabei nicht voneinander. Um den Einfluss der CNP-vermittelten PDE2A Aktivierung auf pro-arrhythmische intrazelluläre Signale zu untersuchen, wurden spontane lokale Ca2+ Freisetzungen aus dem SR (Ca2+ Sparks, CaSp) sowie arrhythmische Ca2+-Wellen (CaW) sowie die Kontraktion von isolierten ventrikulären und atrialen Kardiomyozyten quantifiziert. Interessanterweise reduzierte CNP signifikant die Anzahl an arrhythmogenen CaSp und CaW nach akuter β-adrenerger Stimulation, ohne dabei die zelluläre Kontraktilität zu beeinflussen. Dieser anti-arrhythmogene Effekt wurde in den PDE2A-KO Tieren nicht beobachtet bzw. wurde durch die spezifische PDE2A-inhibition mittels Bay 60-7550 vollständig aufgehoben. Eine simultane Hemmung der cGMP-aktivierten Proteinkinase G hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der CaSp. Zusätzlich zeigten Versuche mit isolierten Kardiomyozyten von Mäusen mit herzspezifischen PDE2A3-Überexpression eine deutlich verminderte Anzahl an CaSp nach akuter β-adrenerger Stimulation. Dieser protektive Effekt wurde bei spezifischer PDE2-Hemmung verhindert. Während die alleinige Inhibition der PDE2 keinen Einfluss auf die CaSp Frequenz hatte, steigerte die Hemmung der PDE3 und PDE4 die Anzahl der CaSp in Kardiomyozyten von Kontrolltieren signifikant. Von besonderer Bedeutung ist, dass der CNP/cGMP/PDE2A-vermittelte anti-arrhythmogene Effekt auch in humanen ventrikulären sowie atrialen iPSC-KMs reproduziert werden konnte. Auf zellulärer Ebene wurden die stressinduzierten Ca2+-Lecks in humanen Zellen durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation unterdrückt. CNP vermittelte auf zellulärer Ebene starke anti-arrhythmogene Effekte über die Stimulation der PDE2A. Interessanterweise war die Expression von CNP in humanem ventrikulärem Gewebe von Patienten mit Herzinsuffizienz signifikant vermindert, während ANP und BNP hochreguliert waren und damit eine Desensitisierung ihrer Rezeptoren vermitteln könnten. In isolierten murinen Kardiomyozyten induzierte die CNP-vermittelte PDE2 Aktivierung eine signifikante Verminderung der intrazellulären cAMP Level. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit unterstreichen deutlich die klinische Relevanz der PDE2A als potenzielles therapeutisches Ziel bei ventrikulären Herzrhythmusstörungen sowie bei Vorhofflimmern nach akuter Stressstimulation oder bei HF weiter zu untersuchen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass PDE2A eine entscheidende Rolle in der Unterdrückung akuter stressinduzierter arrhythmogener Ca2+-Lecks spielt. Daher könnte die pharmakologisch gesteigerte PDE2A-Aktivität eine neue kardioprotektive Strategie zur Therapie von Arrhythmien bei HF darstellen.:Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XII Tabellenverzeichnis XVI 1. Einleitung 1 1.1. Herzinsuffizienz und kardiale Arrhythmien 1 1.1.1. Ätiologie und Epidemiologie 1 1.1.2. Pathophysiologie und Klassifikation kardialer Arrhythmien bei HF 3 1.1.3. Zellulärer und molekularer Aspekt 7 1.1.4. Pharmakologische Therapie 9 1.2. Kardiale Signaltransduktion und sekundäre Botenstoffe 11 1.2.1. cAMP-Signalkaskade 12 1.2.2. cGMP-Signalkaskade 13 1.2.3. Natriuretische Peptide und deren klinische Relevanz 14 1.3. Kardiale Phosphodiesterasen 15 1.3.1. Kardiale PDEs mit dualer Substratspezifität 17 1.3.2. Kardiale cAMP und cGMP-spezifische PDEs 18 1.4. Phosphodiesterase 2A 19 1.4.1. Molekularer Aspekt 19 1.4.2. PDE2A-Expression und Aktivität 21 1.4.3. Perspektiven hinsichtlich der Rolle von PDE2A bei Herzerkrankungen 22 2. Zielsetzung 24 3. Material und Methoden 25 3.1. Material 25 3.2. Tiermodel 25 3.2.1. Tierhaltung 25 3.2.2. C57BL/6JRj Wildtyp-Mausmodel 25 3.2.3. Herzspezifische PDE2A-KO-Mausmodel (PDE2A_fl_αMHC_cre) 26 3.2.4. Genotypisierung 27 3.3. Zellkultur und Differenzierung der humanen induced pluripotent stem cell-derived Kardiomyzyten (iPSC-KM) 30 3.4. Gewinnung Patientengewebe 31 3.5. Echokardiografische Langzeitcharakterisierung 32 3.6. Implantierung osmotischer Minipumpen 34 3.7. Zellisolation adulter Mauskardiomyozyten 35 3.7.1. Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten 35 3.7.2. Isolierung atrialer Kardiomyozyten 36 3.8. Kontraktilitätsmessung 37 3.9. Calcium-Imaging 38 3.10. Calcium-Spark Detektion in Kardiomyozyten 41 3.10.1. Calcium-Spark Detektion in Mauskardiomyozyten 41 3.10.2. Calcium-Spark Detektion in humanen iPSC-KM 42 3.11. Proteinexpressionsanalyse aus Mausatrium 42 3.11.1. Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung 42 3.11.2. Immunoblot 43 3.12. ELISA 45 3.13. qPCR 45 3.14. Statistische Auswertung 46 4. Ergebnisse 47 4.1. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die Herzfunktion 47 4.1.1. Echokardiografische Charakterisierung im Alter von 3 und 6 Monaten 47 4.1.2. Auswirkung einer chronischen Aktivierung der β-adrenergen Signalkaskade auf die Herzfunktion 51 4.2. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt in PDE2A-Knockout-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 56 4.2.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 56 4.2.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 60 4.2.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 63 4.3. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die Kontraktilität ventrikulärer Kardiomyozyten 65 4.3.1. Einfluss auf die zelluläre Kontraktion 65 4.3.2. Einfluss auf die zelluläre Kontraktionsgeschwindigkeit und Relaxationsgeschwindigkeit 67 4.3.3. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die zelluläre Kontraktion 69 4.4. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch natriuretische Peptide auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in ventrikulären Kardiomyozyten nach Stressinduktion 72 4.4.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 72 4.4.2. Veränderung der Spark-Morphologie nach CNP-Stimulation 73 4.4.3. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach ANP-Stimulation 75 4.4.4. Veränderung der Spark-Morphologie nach ANP 76 4.4.5. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz nach PKG-Inhibition 78 4.4.6. Veränderung der auf Spark-Morphologie nach PGK-Inhibition 80 4.5. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die intrazellulären cAMP-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten 82 4.6. Auswirkung des Myokardinfarkts auf die murine Genexpression der PDE2A, des CNP und der natriuretischen Peptidrezeptoren 83 4.7. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt atrialer Kardiomyozyten nach Stressinduktion 84 4.7.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 84 4.7.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 87 4.7.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 89 4.7.4. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf den Ca2+- Zyklus 90 4.8. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in atrialen Kardiomyozyten 95 4.8.1. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz 95 4.8.2. Veränderung der Spark-Morphologie 96 4.9. Auswirkung des PDE2A-KO auf die Expression Ca2+-regulierender Proteine 98 4.10. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in humanen iPSC-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 102 4.10.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 102 4.10.2. Auswirkung der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie 104 4.10.3. Bedeutung der PDE3 und PDE4 Inhibition auf Ca2+-Sparks in ventrikulären hiPSC-KM 106 4.10.4. Einfluss der PDE3 und PDE4 Inhibition auf die Ca2+-Spark-Morphologie 108 4.10.5. Bedeutung der CNP-Stimulation auf Ca2+-Sparks in atrialen hiPSC-KM nach Stressinduktion 109 4.10.6. Einfluss der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie nach Stressinduktion 111 4.11. Auswirkung dilatativer Kardiomyopathie auf die Genexpression natriuretischer Peptide und deren Rezeptoren 112 5. Diskussion 114 5.1. Der herzspezifische PDE2A-Knockout 115 5.1.1. Basale Herzfunktion konditionaler PDE2A-KO Mäuse 115 5.1.2. Cre-Expression beeinträchtigt die Überlebensfähigkeit der PDE2A-KO Mäuse 116 5.1.3. Der PDE2A-KO führt zur Reduktion der Herzfunktion bei chronischer Stressstimulation 117 5.2. Die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation reduziert arrhythmogene Ca2+-Freisetzungen ohne den intrazellulären Ca2+-Zyklus oder die zelluläre Kontraktion zu beeinflussen 119 5.2.1. PDE2A-Stimulation reduziert stressinduzierte arrhythmogene Ca2+-Wellen 119 5.2.2. Die zelluläre Kontraktilität wird durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation nicht beeinträchtigt 121 5.2.3. Natriuretische Peptid-vermittelte PDE2A-Stimualtion unterdrückt die stressinduzierten Ca2+-Lecks aus dem SR 122 5.3. CNP vermittelt einen anti-arrhythmogenen Effekt in humanen iPSC-Kardiomyozyten 124 5.4. Limitationen 125 5.4.1. Einschränkungen des Cre/loxP-Systems beim PDE2A-KO 125 5.4.2. Crosstalk-Mechanismen zyklischer Nukleotide 126 5.4.3. Patientenbasierte Variabilität 127 5.5. Ausblick 128 5.6. Die klinische Relevanz der PDE2A 129 6. Zusammenfassung 131 7. Summary 133 8. Referenzen 135 9. Anhang 162 9.1. Chemikalienliste 162 9.2. Antikörper- und Primerliste 164 9.3. Kits und Verbrauchsmaterialien 166 10. Danksagung 172 11. Erklärung 173 / Cardiac arrhythmias can lead to sudden cardiac death (SCD) in heart failure (HF) patients and are the most common cause of death (> 50%) in this context. Due to the poor prognosis, additional therapeutic options and agents are needed. Phosphodiesterase 2 (PDE2A), an enzyme that hydrolyzes cAMP and cGMP, is upregulated in end-stage HF patients. PDE2A can be allosterically activated by cGMP, which significantly increases its hydrolytic activity, particularly towards cAMP. Previous studies have shown that heart-specific overexpression of PDE2A3 in mice has a strong anti-arrhythmic effect. Conversely, other studies have shown that pharmacological inhibition of PDE2A counteracts the hypertrophic growth of cardiomyocytes. The aim of this study was to investigate the role of PDE2A in heart function under physiological and pathophysiological conditions using a heart-specific PDE2A knockout model. Furthermore, the goal was to elucidate the PDE2A-mediated cGMP/cAMP crosstalk mechanism using C-type natriuretic peptide (CNP) in freshly isolated murine cardiomyocytes and human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells (hiPSC-CMs) to uncover potential anti-arrhythmic cardioprotective effects of cGMP-mediated PDE2A stimulation. First, a new mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of PDE2A (PDE2A-KO) was generated using the 'knockout-first' strategy and characterized via echocardiography. The absence of PDE2A expression in cardiomyocytes did not lead to an altered cardiac phenotype under physiological conditions. However, under chronic stress conditions following isoprenaline infusion (osmotic minipump, 14 days), PDE2A-KO mice showed reduced contraction and ejection fraction compared to treated control animals. Heart rate and hypertrophy did not differ between the groups. To investigate the influence of CNP-mediated PDE2A activation on pro-arrhythmic intracellular signals, spontaneous local Ca2+ releases from the sarcoplasmic reticulum (Ca2+ sparks, CaSp), arrhythmic Ca2+ waves (CaW), and contraction of isolated ventricular and atrial cardiomyocytes were quantified. Interestingly, CNP significantly reduced the number of arrhythmogenic CaSp and CaW following acute β-adrenergic stimulation without affecting cellular contractility. This anti-arrhythmic effect was not observed in PDE2A-KO animals and was completely abolished by specific PDE2A inhibition with Bay 60-7550. Simultaneous inhibition of cGMP-activated protein kinase G had no effect on the number of CaSp. Additionally, experiments with isolated cardiomyocytes from mice with heart-specific PDE2A3 overexpression showed a significantly reduced number of CaSp after acute β-adrenergic stimulation. This protective effect was prevented by specific PDE2A inhibition. While PDE2A inhibition alone had no effect on CaSp frequency, inhibition of PDE3 and PDE4 significantly increased CaSp frequency in cardiomyocytes from control animals. Notably, the CNP/cGMP/PDE2A-mediated anti-arrhythmic effect was also reproduced in human ventricular and atrial iPSC-CMs. At the cellular level, stress-induced Ca2+ leaks in human cells were suppressed by CNP-mediated PDE2A stimulation. CNP mediated strong anti-arrhythmic effects at the cellular level through PDE2A stimulation. Interestingly, CNP expression in human ventricular tissue from HF patients was significantly reduced, while ANP and BNP were upregulated, potentially causing receptor desensitization. In isolated murine cardiomyocytes, CNP-mediated PDE2A activation significantly reduced intracellular cAMP levels. The findings from this study clearly underscore the clinical relevance of PDE2A as a potential therapeutic target for ventricular cardiac arrhythmias and atrial fibrillation following acute stress stimulation or in HF. In summary, this study demonstrated that PDE2A plays a crucial role in suppressing acute stress-induced arrhythmogenic Ca2+ leaks. Therefore, pharmacologically enhancing PDE2A activity could represent a novel cardioprotective strategy for treating arrhythmias in HF.:Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XII Tabellenverzeichnis XVI 1. Einleitung 1 1.1. Herzinsuffizienz und kardiale Arrhythmien 1 1.1.1. Ätiologie und Epidemiologie 1 1.1.2. Pathophysiologie und Klassifikation kardialer Arrhythmien bei HF 3 1.1.3. Zellulärer und molekularer Aspekt 7 1.1.4. Pharmakologische Therapie 9 1.2. Kardiale Signaltransduktion und sekundäre Botenstoffe 11 1.2.1. cAMP-Signalkaskade 12 1.2.2. cGMP-Signalkaskade 13 1.2.3. Natriuretische Peptide und deren klinische Relevanz 14 1.3. Kardiale Phosphodiesterasen 15 1.3.1. Kardiale PDEs mit dualer Substratspezifität 17 1.3.2. Kardiale cAMP und cGMP-spezifische PDEs 18 1.4. Phosphodiesterase 2A 19 1.4.1. Molekularer Aspekt 19 1.4.2. PDE2A-Expression und Aktivität 21 1.4.3. Perspektiven hinsichtlich der Rolle von PDE2A bei Herzerkrankungen 22 2. Zielsetzung 24 3. Material und Methoden 25 3.1. Material 25 3.2. Tiermodel 25 3.2.1. Tierhaltung 25 3.2.2. C57BL/6JRj Wildtyp-Mausmodel 25 3.2.3. Herzspezifische PDE2A-KO-Mausmodel (PDE2A_fl_αMHC_cre) 26 3.2.4. Genotypisierung 27 3.3. Zellkultur und Differenzierung der humanen induced pluripotent stem cell-derived Kardiomyzyten (iPSC-KM) 30 3.4. Gewinnung Patientengewebe 31 3.5. Echokardiografische Langzeitcharakterisierung 32 3.6. Implantierung osmotischer Minipumpen 34 3.7. Zellisolation adulter Mauskardiomyozyten 35 3.7.1. Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten 35 3.7.2. Isolierung atrialer Kardiomyozyten 36 3.8. Kontraktilitätsmessung 37 3.9. Calcium-Imaging 38 3.10. Calcium-Spark Detektion in Kardiomyozyten 41 3.10.1. Calcium-Spark Detektion in Mauskardiomyozyten 41 3.10.2. Calcium-Spark Detektion in humanen iPSC-KM 42 3.11. Proteinexpressionsanalyse aus Mausatrium 42 3.11.1. Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung 42 3.11.2. Immunoblot 43 3.12. ELISA 45 3.13. qPCR 45 3.14. Statistische Auswertung 46 4. Ergebnisse 47 4.1. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die Herzfunktion 47 4.1.1. Echokardiografische Charakterisierung im Alter von 3 und 6 Monaten 47 4.1.2. Auswirkung einer chronischen Aktivierung der β-adrenergen Signalkaskade auf die Herzfunktion 51 4.2. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt in PDE2A-Knockout-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 56 4.2.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 56 4.2.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 60 4.2.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 63 4.3. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die Kontraktilität ventrikulärer Kardiomyozyten 65 4.3.1. Einfluss auf die zelluläre Kontraktion 65 4.3.2. Einfluss auf die zelluläre Kontraktionsgeschwindigkeit und Relaxationsgeschwindigkeit 67 4.3.3. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die zelluläre Kontraktion 69 4.4. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch natriuretische Peptide auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in ventrikulären Kardiomyozyten nach Stressinduktion 72 4.4.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 72 4.4.2. Veränderung der Spark-Morphologie nach CNP-Stimulation 73 4.4.3. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach ANP-Stimulation 75 4.4.4. Veränderung der Spark-Morphologie nach ANP 76 4.4.5. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz nach PKG-Inhibition 78 4.4.6. Veränderung der auf Spark-Morphologie nach PGK-Inhibition 80 4.5. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die intrazellulären cAMP-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten 82 4.6. Auswirkung des Myokardinfarkts auf die murine Genexpression der PDE2A, des CNP und der natriuretischen Peptidrezeptoren 83 4.7. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt atrialer Kardiomyozyten nach Stressinduktion 84 4.7.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 84 4.7.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 87 4.7.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 89 4.7.4. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf den Ca2+- Zyklus 90 4.8. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in atrialen Kardiomyozyten 95 4.8.1. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz 95 4.8.2. Veränderung der Spark-Morphologie 96 4.9. Auswirkung des PDE2A-KO auf die Expression Ca2+-regulierender Proteine 98 4.10. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in humanen iPSC-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 102 4.10.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 102 4.10.2. Auswirkung der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie 104 4.10.3. Bedeutung der PDE3 und PDE4 Inhibition auf Ca2+-Sparks in ventrikulären hiPSC-KM 106 4.10.4. Einfluss der PDE3 und PDE4 Inhibition auf die Ca2+-Spark-Morphologie 108 4.10.5. Bedeutung der CNP-Stimulation auf Ca2+-Sparks in atrialen hiPSC-KM nach Stressinduktion 109 4.10.6. Einfluss der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie nach Stressinduktion 111 4.11. Auswirkung dilatativer Kardiomyopathie auf die Genexpression natriuretischer Peptide und deren Rezeptoren 112 5. Diskussion 114 5.1. Der herzspezifische PDE2A-Knockout 115 5.1.1. Basale Herzfunktion konditionaler PDE2A-KO Mäuse 115 5.1.2. Cre-Expression beeinträchtigt die Überlebensfähigkeit der PDE2A-KO Mäuse 116 5.1.3. Der PDE2A-KO führt zur Reduktion der Herzfunktion bei chronischer Stressstimulation 117 5.2. Die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation reduziert arrhythmogene Ca2+-Freisetzungen ohne den intrazellulären Ca2+-Zyklus oder die zelluläre Kontraktion zu beeinflussen 119 5.2.1. PDE2A-Stimulation reduziert stressinduzierte arrhythmogene Ca2+-Wellen 119 5.2.2. Die zelluläre Kontraktilität wird durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation nicht beeinträchtigt 121 5.2.3. Natriuretische Peptid-vermittelte PDE2A-Stimualtion unterdrückt die stressinduzierten Ca2+-Lecks aus dem SR 122 5.3. CNP vermittelt einen anti-arrhythmogenen Effekt in humanen iPSC-Kardiomyozyten 124 5.4. Limitationen 125 5.4.1. Einschränkungen des Cre/loxP-Systems beim PDE2A-KO 125 5.4.2. Crosstalk-Mechanismen zyklischer Nukleotide 126 5.4.3. Patientenbasierte Variabilität 127 5.5. Ausblick 128 5.6. Die klinische Relevanz der PDE2A 129 6. Zusammenfassung 131 7. Summary 133 8. Referenzen 135 9. Anhang 162 9.1. Chemikalienliste 162 9.2. Antikörper- und Primerliste 164 9.3. Kits und Verbrauchsmaterialien 166 10. Danksagung 172 11. Erklärung 173

Background and aim: Patients with heart failure and myocardial infarction have a significant risk of ventricular arrhythmia and sudden cardiac death, contributing to ∼20% of total deaths worldwide. However, pharmacological therapy of life-threatening arrhythmia remains limited and challenging. Consequently, there is a strong medical need for novel antiarrhythmic pharmacotherapy approaches that can effectively address fatal arrhythmias and reduce mortality rates. There is increasing evidence for cardioprotective effects of C-type natriuretic peptide (CNP) generating the intracellular second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) via its guanylyl cyclase receptor. While cGMP is proposed to mediate beneficial effects in the diseased myocardium, the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) downstream of the chronically activated β-adrenoceptors provoke detrimental effects, such as cardiac remodelling and arrhythmia generation. Importantly, phosphodiesterase type 2 (PDE2) plays a crucial role in mediating the negative crosstalk between cGMP and cAMP signalling pathways within cardiomyocytes. As the only phosphodiesterase that is allosterically activated by cGMP to increase its cAMP-hydrolysing activity, PDE2 regulates the balance between these two signalling molecules. The aim of this study was to investigate the potential antiarrhythmic effect of CNP-cGMP-induced PDE2 stimulation at both organ and animal level in physiological as well as pathophysiological conditions. Material & methods: Hearts from mouse models with cardiomyocyte-specific PDE2 overexpression (PDE2 OE) or deletion (PDE2 KO) were isolated and subjected to ischemia/reperfusion (I/R) injuries using a Langendorff perfusion system. Thereby, the left descending coronary artery was ligated for 30 minutes to induce ischemia, followed by 30 minutes of reperfusion after removing the occlusion. The incidence of arrhythmic events during the reperfusion phase was examined following PDE2 activation with CNP or PDE2 inhibition with BAY 60-7550 using ex vivo ECG electrodes. To assess the potential antiarrhythmic effects of PDE2 modulation under pathophysiological conditions, two different experimental models were induced in mice: (i) Heart failure (HF) was induced through a 5-week regimen including a high-fat diet and the administration of the NO-synthase inhibitor L-NAME in drinking water to mediate metabolic and hypertensive stress, and (ii) diabetes was induced via 5 consecutive streptozotocin (STZ) i.p. injections, leading to the destruction of pancreatic β-cells and subsequent development of diabetes over a four-week period. In addition to ex vivo arrhythmia quantification after I/R, in vivo arrhythmia development was conducted by implanting ECG telemeters and provoking arrhythmias with double injections of the β adrenoceptor agonist isoprenaline (Iso). Additionally, atrial arrhythmia induction protocols were established to evaluate the development of atrial fibrillation (AF) using two different pacing protocols on the right atrium. The S1S2 protocol was used to detect the effective refractory period of the atria and the burst pacing protocol to determine the inducibility of AF, with simultaneous recording of monophasic action potentials from the left atrium. Results: WT hearts perfused with CNP exhibited a significant reduction in the number of arrhythmic events following I/R compared to control hearts. Importantly, this antiarrhythmic effect of CNP was reversed by pharmacological inhibition of PDE2 with BAY 60-7550 (Cachorro et al., 2023). Interestingly, no differences in arrhythmia development were observed between control and perfusion with BAY (Wagner et al., 2021). In contrast, inhibition of PDE3 resulted in markedly increased number of arrhythmic events compared to control. Hearts with cardiomyocyte-specific PDE2 deletion displayed a significantly higher incidence of arrhythmias after I/R, including ventricular extrasystole, bigeminy, and tachycardia. However, in vivo experiments did not demonstrate increased arrhythmia development after acute β-adrenergic stress in PDE2 KO mice with HF potentially due to desensitization of chronically activated β-adrenergic receptors in this pathophysiological model. Furthermore, hearts from diabetic mice exhibited a significantly higher number of arrhythmic events ex vivo, although those with PDE2 OE were protected against diabetes-induced arrhythmias compared to diabetic controls. However, the established pacing protocols revealed a low AF induction rate in ex vivo perfused mouse hearts, limiting the ability to observe a significant antiarrhythmic effect of CNP. Nonetheless, control hearts perfused with CNP plus BAY or with cardiac-specific deletion of PDE2 showed a trend towards increased AF compared to WT hearts and those perfused with CNP alone. Under diabetic conditions, PDE2 KO mice also displayed a trend to have higher AF inducibility compared to control diabetic hearts. As observed under physiological conditions, simultaneous perfusion of diabetic hearts with CNP plus BAY also showed a trend to have enhanced AF development compared to CNP or control perfusion. Conclusions: In conclusion, the findings of this study provide strong evidence that cGMP-induced PDE2 activation plays a crucial role in protecting the heart from ventricular arrhythmias in both physiological and pathophysiological conditions. Thus, CNP-mediated PDE2 stimulation could provide a novel therapeutic strategy to reduce life-threatening arrhythmias. However, further research should be performed to elucidate the effects of PDE2 stimulation on other tissues expressing PDE2, such as fibroblasts, neurons, endothelial cells, or circulating immune cells. Additionally, the impact of CNP-induced cGMP on the protein kinase G (PKG) pathway in cardiomyocytes should be investigated. The results of this work may provide a new approach for the development of novel antiarrhythmic therapies targeting the CNP-PDE2 axis, improving clinical outcomes for patients with HF and myocardial infarction.:Abbreviations I List of figures V List of tables VII 1. Introduction 1 1.1. Diabetes and diabetic cardiomyopathy 1 1.1.1. Aetiology, epidemiology and classification 1 1.1.2. Pathophysiology mechanisms 2 1.1.3. Diagnosis and treatment 3 1.2. Myocardial Infarction 4 1.2.1. Aetiology, epidemiology and classification 4 1.2.2. Pathophysiology mechanisms 5 1.2.3. Diagnosis and treatment 7 1.3. Heart failure 9 1.3.1. Aetiology, epidemiology and classification 9 1.3.2. Pathophysiology mechanisms 10 1.3.3. Diagnosis and treatment 11 1.4. Cardiac arrhythmia 13 1.4.1. Aetiology, epidemiology and classification 13 1.4.2. Cellular mechanism and pathophysiology 15 1.4.3. Arrhythmia diagnosis and treatment 16 1.5. Cyclic nucleotide signalling in cardiomyocytes 17 1.5.1. cAMP signalling 17 1.5.2. cGMP signalling 19 1.5.3. Compartmentalization of secondary messengers and phosphodiesterase superfamily 20 1.5.4. The increasing clinical significance of CNP 23 1.6. Phosphodiesterase 2 23 1.6.1. Molecular aspects 23 1.6.2. PDE2 regulation in cardiomyocytes 25 1.6.3. PDE2-mediated cGMP/cAMP crosstalk in cardiomyocytes 26 1.6.4. Antiarrhythmic potential of PDE2 27 2. Aims of the study 28 3. Materials & methods 29 3.1. Materials 29 3.1.1. Chemicals 29 3.1.2. PCR primers 30 3.1.3. Kits and reagents 31 3.1.4. Laboratory consumables 31 3.1.5. Devices and experimental hardware 32 3.1.6. Computer software 34 3.2. Methods 34 3.2.1. Animal models 34 3.2.2. Murine pathophysiological models 38 3.2.3. Ex vivo ischemia/reperfusion injuries 39 3.2.4. Characterization of heart hypertrophy and lung congestion 41 3.2.5. TTC staining 42 3.2.6. Ex vivo atrial fibrillation induction 42 3.2.7. In vivo ECG telemetry 43 3.2.8. Acute arrhythmia induction in vivo 44 3.2.9. Echocardiography 45 3.2.10. Biostatistical analysis 45 4. Results 47 4.1. Impact of PDE2 modulation on cardiac arrhythmia following ischemia/reperfusion injuries in ex vivo perfused murine hearts 47 4.1.1. PDE2 modulation and arrhythmogenesis in wild type mice 47 4.1.2. Impact of different phosphodiesterases and protein kinase G on arrhythmia development after ex vivo I/R 52 4.2. Role of PDE2 in murine heart failure model 54 4.2.1. Characterization of the murine heart failure model in different genetic backgrounds 55 4.2.2. Role of PDE2 on arrhythmia development upon acute β-AR stimulation in vivo 61 4.3. Role of PDE2 in mice with STZ-induced diabetic cardiomyopathy 62 4.3.1. Effect of cardiac PDE2 overexpression and deletion on cardiac function and development of STZ-induced diabetes 62 4.3.2. Impact of cardiac-specific overexpression of PDE2 in diabetic mice after I/R injuries 70 4.4. Atrial fibrillation 73 4.4.1. Effects of PDE2 modulation on atrial fibrillation under physiological and pathophysiological conditions after STZ-induced diabetes 73 4.4.2. Effects of cardiomyocyte-specific PDE2 deletion on atrial fibrillation induction in hearts from mice with STZ-induced diabetes 79 5. Discussion 82 5.1. CNP-induced PDE2 stimulation protects from arrhythmia after I/R injuries ex vivo 82 5.2. PDE2-/- mice did not show significant increased arrhythmia development in vivo upon HF induction 86 5.3. PDE2 OE mice are protected against I/R injuries-induced arrhythmia development after diabetes induction with STZ 86 5.4. PDE2 pharmacological inhibition and PDE2 genetic deletion might lead to more atrial fibrillation episodes after burst pacing 90 5.5. Limitations 93 5.6. Conclusions 95 6. Summary 97 7. Zusammenfassung 99 8. Bibliography 102 9. Acknowledgements 124 10. Declaration 126 / Hintergrund und Ziel: Patienten mit Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt haben ein hohes Risiko für ventrikuläre Arrhythmien und plötzlichen Herztod, welche weltweit für ∼20 % der Todesfälle verantwortlich sind. Die pharmakologische Therapie lebensbedrohlicher Herzrhythmusstörungen ist jedoch nach wie vor begrenzt und schwierig. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an neuen Ansätzen für die antiarrhythmische Pharmakotherapie, um letale Herzrhythmusstörungen zu reduzieren und die Sterblichkeitsrate zu senken. Verschiedene Studien belegen, dass das C-Typ natriuretischem Peptid (CNP) über die Stimulation des Guanylatzyklase-Rezeptors B und die Bildung des intrazellulären Botenstoffs zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) kardioprotektive Wirkungen vermittelt. Während cGMP im erkrankten Herzmuskel positive Wirkungen vermittelt, fördert zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) als intrazellulärer Botenstoff der chronisch aktivierten β-Adrenozeptoren schädliche Wirkungen, wie kardiales Remodelling und die Entstehung von Herzrhythmusstörungen. Die Phosphodiesterase 2 (PDE2) spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung des negativen Crosstalks zwischen dem cGMP- und dem cAMP-vermittelten Signalweg in Kardiomyozyten. Als einzige Phosphodiesterase wird die PDE2 durch cGMP allosterisch aktiviert, um dann verstärkt cAMP abzubauen und zum Gleichgewicht zwischen beiden Signalmolekülen beizutragen. Ziel dieser Arbeit war es, die potenzielle antiarrhythmische Wirkung der CNP-cGMP-induzierten PDE2-Stimulation unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen sowohl auf Organebene als auch im Mausmodell in vivo zu untersuchen. Material & Methoden: Für diese Arbeit wurden murine Herzen aus Mäusen mit Kardiomyozyten-spezifischer PDE2-Überexpression (PDE2 OE) oder -Deletion (PDE2 KO) verwendet und ex vivo einer Ischämie/Reperfusion (I/R) am Langendorff-Perfusionssystem unterzogen. Zur Ischämie-Induktion wurde zunächst die linke absteigende Koronararterie für 30 Minuten ligiert. Im Anschluss wurde die Okklusion aufgehoben und für 30 Minuten reperfundiert. Mithilfe von EKG-Elektroden wurde ex vivo während der Reperfusionsphase das Auftreten von Herzrhythmusstörungen nach PDE2-Aktivierung mit CNP oder PDE2-Hemmung mit BAY 60-7550 untersucht. Um die potenziellen antiarrhythmischen Wirkungen der PDE2-Modulation unter pathophysiologischen Bedingungen zu evaluieren, wurden zwei verschiedene experimentelle Modelle in Mäusen induziert: (i) eine Herzinsuffizienz (HF) wurde mittels metabolischem und hypertensivem Stress durch eine 5-wöchige Hochfettdiät und die Verabreichung des NO-Synthase-Inhibitors L-NAME im Trinkwasser induziert, und (ii) Diabetes wurde durch 5 aufeinanderfolgende i. p. -Injektionen von Streptozotocin induziert, was zur Zerstörung der β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse und dadurch zur Entstehung eines Diabetes über einen Zeitraum von vier Wochen führte. Zusätzlich zur Quantifizierung der Arrhythmien ex vivo nach I/R wurde die Entstehung von Arrhythmien in vivo nach Provokation durch die zweifache Injektionen des β-Adrenozeptor-Agonisten Isoprenalin mittels implantierter EKG-Telemeter untersucht. Darüber hinaus wurden Protokolle zur Induktion von Vorhofarrhythmien etabliert, um die Entwicklung von Vorhofflimmern (AF) mit zwei verschiedenen Pacing-Protokollen am rechten Vorhof zu untersuchen. Das S1S2-Protokoll wurde verwendet, um die effektive Refraktärzeit der Vorhöfe zu ermitteln, und das Burst-Pacing-Protokoll, um die Induzierbarkeit von Vorhofflimmern bei gleichzeitiger Aufzeichnung monophasischer Aktionspotenziale aus dem linken Vorhof zu bestimmen. Ergebnisse: Wildtyp (WT)-Herzen, die mit CNP perfundiert wurden, wiesen eine signifikant verringerte Anzahl von arrhythmischen Ereignissen nach I/R im Vergleich zu Kontroll-Herzen auf. Diese antiarrhythmische Wirkung von CNP wurde durch pharmakologische PDE2-Hemmung mit BAY 60-7550 (BAY) aufgehoben (Cachorro et al., 2023). Interessanterweise konnten keine Unterschiede in der Entwicklung von Arrhythmien zwischen Kontrollbedingungen und Perfusion mit BAY beobachtet werden (Wagner et al., 2021). Im Gegensatz dazu führte die Hemmung der PDE3 zu einer deutlich erhöhten Anzahl an Arrhythmien verglichen mit der Kontrolle. Herzen mit Kardiomyozyten-spezifischer PDE2-Deletion wiesen eine signifikant höhere Inzidenz von Arrhythmien nach I/R auf, einschließlich ventrikulärer Extrasystolen, Bigemini und Tachykardien. In-vivo-Experimente zeigten dagegen kein verstärktes Auftreten von Arrhythmien nach akuter β-adrenerger Belastung in PDE2 KO-Mäusen mit HF, was möglicherweise auf eine Desensibilisierung chronisch aktivierter β adrenerger Rezeptoren in diesem pathophysiologischen Modell zurückzuführen ist. Darüber hinaus wiesen die Herzen diabetischer Mäuse eine signifikant höhere Anzahl von Arrhythmien ex vivo auf, wobei die Herzen von diabetischen PDE2 OE-Mäusen im Vergleich zu diabetischen Kontroll-Mäusen vor Arrhythmien geschützt waren. Durch die etablierten AF-Pacing-Protokolle konnte insgesamt nur eine niedrige AF-Induktionsrate in ex vivo perfundierten Mausherzen erzielt werden, sodass die antiarrhythmische Wirkung von CNP hier nicht gezeigt werden konnte. Dennoch wiesen gesunde Kontrollherzen, die mit CNP plus BAY perfundiert wurden, und Herzen mit einer kardiospezifischen PDE2 Deletion eine Tendenz zu gesteigertem Auftreten von Vorhofflimmern im Vergleich zu CNP-perfundierten und WT-Herzen auf. Unter diabetischen Bedingungen zeigten PDE2 KO-Herzen im Vergleich zu diabetischen Kontroll-Herzen ebenfalls einen Trend zu höherer AF-Induzierbarkeit. Wie unter physiologischen Bedingungen beobachtet, zeigte sich auch bei der gleichzeitigen Perfusion diabetischer Herzen mit CNP plus BAY eine Tendenz zur verstärkten Entwicklung von Vorhofflimmern im Vergleich zu CNP- oder Kontroll-Perfusion. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse dieser Studie liefern deutliche Hinweise darauf, dass die cGMP-induzierte PDE2-Aktivierung sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen eine entscheidende Rolle für den Schutz des Herzens vor ventrikulären Arrhythmien spielt. Somit könnte die CNP-vermittelte PDE2-Stimulation eine neue therapeutische Strategie zur Verringerung lebensbedrohlicher Arrhythmien darstellen. Weitere Untersuchungen sollten jedoch durchgeführt werden, um die Auswirkungen der PDE2-Stimulation auf andere Gewebe, welche PDE2 exprimieren, wie Fibroblasten, Neuronen, Endothelzellen oder zirkulierende Immunzellen, zu klären. Darüber hinaus sollten die Auswirkungen von CNP-induziertem cGMP auf den Proteinkinase G-Signalweg in Kardiomyozyten untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten einen Ansatz für die Entwicklung neuer antiarrhythmischer Therapien bieten, welche die CNP-PDE2-Achse modulieren und die klinische Behandlung von Patienten mit Herzinsuffizienz und Herzinfarkt verbessern.:Abbreviations I List of figures V List of tables VII 1. Introduction 1 1.1. Diabetes and diabetic cardiomyopathy 1 1.1.1. Aetiology, epidemiology and classification 1 1.1.2. Pathophysiology mechanisms 2 1.1.3. Diagnosis and treatment 3 1.2. Myocardial Infarction 4 1.2.1. Aetiology, epidemiology and classification 4 1.2.2. Pathophysiology mechanisms 5 1.2.3. Diagnosis and treatment 7 1.3. Heart failure 9 1.3.1. Aetiology, epidemiology and classification 9 1.3.2. Pathophysiology mechanisms 10 1.3.3. Diagnosis and treatment 11 1.4. Cardiac arrhythmia 13 1.4.1. Aetiology, epidemiology and classification 13 1.4.2. Cellular mechanism and pathophysiology 15 1.4.3. Arrhythmia diagnosis and treatment 16 1.5. Cyclic nucleotide signalling in cardiomyocytes 17 1.5.1. cAMP signalling 17 1.5.2. cGMP signalling 19 1.5.3. Compartmentalization of secondary messengers and phosphodiesterase superfamily 20 1.5.4. The increasing clinical significance of CNP 23 1.6. Phosphodiesterase 2 23 1.6.1. Molecular aspects 23 1.6.2. PDE2 regulation in cardiomyocytes 25 1.6.3. PDE2-mediated cGMP/cAMP crosstalk in cardiomyocytes 26 1.6.4. Antiarrhythmic potential of PDE2 27 2. Aims of the study 28 3. Materials & methods 29 3.1. Materials 29 3.1.1. Chemicals 29 3.1.2. PCR primers 30 3.1.3. Kits and reagents 31 3.1.4. Laboratory consumables 31 3.1.5. Devices and experimental hardware 32 3.1.6. Computer software 34 3.2. Methods 34 3.2.1. Animal models 34 3.2.2. Murine pathophysiological models 38 3.2.3. Ex vivo ischemia/reperfusion injuries 39 3.2.4. Characterization of heart hypertrophy and lung congestion 41 3.2.5. TTC staining 42 3.2.6. Ex vivo atrial fibrillation induction 42 3.2.7. In vivo ECG telemetry 43 3.2.8. Acute arrhythmia induction in vivo 44 3.2.9. Echocardiography 45 3.2.10. Biostatistical analysis 45 4. Results 47 4.1. Impact of PDE2 modulation on cardiac arrhythmia following ischemia/reperfusion injuries in ex vivo perfused murine hearts 47 4.1.1. PDE2 modulation and arrhythmogenesis in wild type mice 47 4.1.2. Impact of different phosphodiesterases and protein kinase G on arrhythmia development after ex vivo I/R 52 4.2. Role of PDE2 in murine heart failure model 54 4.2.1. Characterization of the murine heart failure model in different genetic backgrounds 55 4.2.2. Role of PDE2 on arrhythmia development upon acute β-AR stimulation in vivo 61 4.3. Role of PDE2 in mice with STZ-induced diabetic cardiomyopathy 62 4.3.1. Effect of cardiac PDE2 overexpression and deletion on cardiac function and development of STZ-induced diabetes 62 4.3.2. Impact of cardiac-specific overexpression of PDE2 in diabetic mice after I/R injuries 70 4.4. Atrial fibrillation 73 4.4.1. Effects of PDE2 modulation on atrial fibrillation under physiological and pathophysiological conditions after STZ-induced diabetes 73 4.4.2. Effects of cardiomyocyte-specific PDE2 deletion on atrial fibrillation induction in hearts from mice with STZ-induced diabetes 79 5. Discussion 82 5.1. CNP-induced PDE2 stimulation protects from arrhythmia after I/R injuries ex vivo 82 5.2. PDE2-/- mice did not show significant increased arrhythmia development in vivo upon HF induction 86 5.3. PDE2 OE mice are protected against I/R injuries-induced arrhythmia development after diabetes induction with STZ 86 5.4. PDE2 pharmacological inhibition and PDE2 genetic deletion might lead to more atrial fibrillation episodes after burst pacing 90 5.5. Limitations 93 5.6. Conclusions 95 6. Summary 97 7. Zusammenfassung 99 8. Bibliography 102 9. Acknowledgements 124 10. Declaration 126