<p style="text-align: justify;">Jedno od najvećih dostignuća u dvadesetom veku je bio pronalazak antibiotika i njihova primena u humanoj medicini. Međutim, vremenom se pokazalo da su izazivači bolesti mikroorganizmi koji &ldquo;uče&rdquo; i imaju sposobnost da se &ldquo;menjaju&rdquo;, &scaron;to neminovno dovodi do pojave antibiotske rezistencije, a čemu ide u prilog &scaron;iroko rasprostranjena upotreba antibiotika u lečenju pacijenata i primena humanih antimikrobnih lekova u veterini i fitofarmaciji. Razvoj novih i unapređenje postojećih farmaceutika zahteva ogromna ulaganja koja se mogu ali i ne moraju vratiti godinama. Prvi korak u razvoju novog farmaceutika je identifikacija ciljanog antibiotskog delovanja metabolita izabranog proizvodnog mikroorganizma, nakon čega sledi optimizacija uslova biosinteze u smislu sastava medijuma za proizvodnju.<br />Osnovni cilj ove doktorske disertacije je optimizacija formulacije medijuma za kultivaciju prirodnog izolata Streptomyces hygroscopicus u pogledu izvora makronutrijenata i njihovih količina, kako bi se metabolička aktivnost primenjenog proizvodnog mikroorganizma, u definisanim proizvodnim uslovima, usmerila ka sintezi antibiotika sa ciljanim delovanjem.<br />Optimizacijom formulacije medijuma za kultivaciju prirodnog izolata <em>Streptomyces hygroscopicus</em>, u primenjenim eksperimentalnim uslovima, odabrani su najpogodniji izvori makronutrijenata i definisane su njihove optimalne koncentracije za proizvodnju antibiotika sa ciljanim delovanjem. Utvrđeno je da je biosinteza baktericida efikasnih protiv <em>B. cereus</em> ATCC 10876, <em>S. aureus</em> ATCC 11632 i P. <em>aeruginosa</em> ATCC 27853 najizraženija u medijumu sa fruktozom, sojinim bra&scaron;nom i fosfatnim solima, dok je za dobijanje fungicida koji deluju na <em>C. albicans</em> ATCC 10231 i <em>A. niger</em> ATCC 16404 najadekvatnije primeniti medijum sa glukozom kao izvorom ugljenika i već pomenutim izvorima azota i fosfora pri čemu je odnos navedenih sastojaka medijuma specifičan za svaki test mikroorganizam. Sa tehnolo&scaron;kog aspekta, rezultati ovih istraživanja predstavljaju pouzdan izvor informacija za unapređenje proizvodnih karakteristika primenjenog biokatalizatora, izbor tehnike kultivacije, definisanje toka i optimizaciju postupka proizvodnje baktericida i fungicida sa krajnjim ciljem uvećanja razmera posmatranog bioprocesa.</p> / <p>One of the greatest achievements in the twentieth century was the invention of antibiotics and their application in human medicine. However, over time, it has been proven that disease susceptors are &quot;learning&quot; microorganisms and have the ability to &quot;change&quot;, which inevitably leads to the emergence of antibiotic resistance, which is in favor of widespread use of antibiotics in the treatment of patients and the application of human antibiotics in veterinary medicine and phytopharmacy. The development of new and the advancement of existing pharmaceuticals requires huge investments that may or may not be back for years. The first step in the development of a new pharmaceutical is the identification of the target antibiotic activity of the metabolite of the selected production microorganism, followed by the optimization of the conditions of biosynthesis in terms of composition of the production medium.<br />The main goal of this PhD thesis is the optimization of the formulation of the medium for the cultivation of the natural isolate Streptomyces hygroscopicus in terms of the source of macronutrients and their amounts, in order to direct the metabolic activity of the applied production microorganism, in the defined production conditions, towards the synthesis of antibiotics with targeted action. By optimizing the formulation of the medium for the culture of the natural isolate Streptomyces hygroscopicus, in the applied experimental conditions, the most suitable sources of macronutrients were selected and their optimal concentrations for the production of antibiotics with targeted action were defined. The biosynthesis of bactericides was found to be effective against B. cereus ATCC 10876, S. aureus ATCC 11632 and P. aeruginosa ATCC 27853 most pronounced in the medium with fructose, soy flour and phosphate salts, while for the production of fungicides acting on C. albicans ATCC 10231 and A. niger ATCC 16404 most appropriately apply a glucose medium as carbon source and already mentioned sources of nitrogen and phosphorus wherein the ratio of said ingredients to the medium is specific to each test microorganism. From a technological point of view, the results of these studies represent a reliable source of information for improving the production characteristics of the applied biocatalyst, a selection of cultivation techniques, defining the flow and optimizing the production of bactericides and fungicides with the ultimate goal of increasing the size of the observed bioprocess.</p>

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de &#946;-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of &#946;-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de &#946;-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of &#946;-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.