Clostridium difficile est une bactérie qui, avec l’appauvrissement de la flore intestinale causée par des antibiotiques, produit deux toxines qui altèrent la paroi intestinale et provoquent ainsi des diarrhées pouvant entraîner la mort. Les premiers traitements à base de vancomycine, ont fait apparaître des souches résistantes. Depuis 2012, Santé Canada a approuvé un seul nouvel antibiotique, la fidaxomicine ou tiacumicine B. Ce traitement est plus efficace pour lutter contre C. difficile que la vancomycine. Le macrocycle de la tiacumicine B, un macrolactone, est fabriqué par une bactérie du sol et les enzymes qui agissent dans la voie de biosynthèse sont connues mais leur ordre d’action ne l’est pas encore. Pour cela, il est nécessaire de connaître les substrats de chacune de ces enzymes. Afin de mieux comprendre la biosynthèse de la tiacumicine B, ce mémoire présente la détermination de la structure de TiaP1, un cytochrome P450 qui hydroxyle le carbone 18 du macrocycle. La structure de TiaP2, qui hydroxyle le carbone 20, étant déterminée, l’objectif était de prédire l’identité de son substrat à l’aide de l’arrimage moléculaire. Les résultats appuient l’hypothèse que TiaP2 agirait avant TiaP1 sur le macrocycle. D’après les simulations d’arrimage moléculaire, nous prédisons que la glycosyltransférase TiaG1 (non étudiée ici) ajouterait un résidu de sucre au macrolactone avant que TiaP2 n’hydroxyle le carbone 20. / Clostridium difficile is a bacterium that, with the depletion of gut flora during antibiotic treatment, produces two toxins that alter the intestinal wall causing potentially deadly diarrhea. The first treatments were based on vancomycin and resistance by C. difficile developed rapidly. In 2012, Health Canada approved a new antibiotic, fidaxomicin, which is also named tiacumicin B. This treatment is the most effective treatment against C. difficile. The macrocycle of tiacumicin B, a macrolactone, is produced by a soil bacterium and enzymes that act in the biosynthetic pathway are known. However, their order of action is not established. To know their order of action, it is necessary to know the substrates. This thesis presents the determination of TiaP1 structure, a cytochrome P450 that hydroxylates carbon 18 of the macrocycle of tiacumicin B. The structure of TiaP2, a P450 hydroxylating carbon 20, was already determined, and we attempted to predict its substrate by using a molecular docking approach. Our results confirm that TiaP2 hydroxylates before TiaP1. According to molecular docking results, we predict that the glycosyltransferase TiaG1 (not studied here) adds a sugar on the macrolactone of tiacumicin B before TiaP2 hydroxylates the carbon 20.