Les maladies parodontales sont causées par une infection bactérienne touchant les tissus entourant les dents, appelés parodonte. L’inflammation aggravée du parodonte peut conduire au déchaussement ou à la chute des dents. Porphyromonas gingivalis est une bactérie anaérobique qui sécrète des toxines appelées gingipaïnes, considérées comme le facteur de virulence majeur. Le système de sécrétion de type IX (T9SS) a été récemment mis en évidence exclusivement chez les membres de la famille des bacteroidetes. Chez P. gingivalis, ce système et directement relié à la sécrétion des gingipaïnes est donc sa pathogénicité. Des études ont montré que plus d’une quinzaine de protéines sont impliquées dans l’assemblage, la fonction et la régulation de ce système de sécrétion. Parmi ces protéines, PorK, PorL, PorM, PorN forment un complexe membranaire au cœur de la machinerie de sécrétion, enchâssé dans les deux membranes bactériennes. L’objectif de ce travail de thèse a été de mettre en place une méthodologie d’extraction et de solubilisation du complexe membranaire PorK-L-M-N afin d’étudier sa structure moléculaire par des méthodes de biochimie intégrative. Trois sous-complexes ont été étudiés successivement. Le complexe de membrane externe PorK-N, le complexe de membrane externe étendu PorK-N-M et le complexe de membrane interne PorL-M. Les résultats obtenus montrent que le complexe de membrane externe PorK-N présente une structure en forme d’anneau de 50nm de diamètre et le complexe de membrane interne PorL-M possède une structure étendue avec une base sphérique de 25nm. Ces résultats valident une méthodologie qui pourra par la suite être utilisée pour d'autres études du T9SS. / Periodontal diseases are caused by a bacterial infection affecting the tissues surrounding the teeth, called periodontal. The aggravated inflammation of the periodontium may lead to loosening or falling of the teeth. Porphyromonas gingivalis is an anaerobic bacterium able to secrete toxins called gingipains, considered as the major virulence factor. First called PorSS, the type IX secretion system (T9SS) was recently found exclusively in members of bacteroidetes. In P. gingivalis this system is directly related to the secretion of gingipains and is therefore its pathogenicity. Studies have shown that more than fifteen proteins are involved in the assembly, function and regulation of this secretory system. Among these proteins PorK, PorL, PorM, PorN form a membrane core complex, the central part of the secretory machinery embedded in the two bacterial membranes. The objective of this thesis was to set up a methodology of extraction and solubilization of the PorK-L-M-N membrane complex in order to study its molecular structure by integrative biochemistry methods. Three sub-complexes have been studied successively. PorK-N the outer membrane complex, PorK-N-M extended outer membrane complex and PorL-M the inner membrane complex. The results show that the PorK-N outer membrane complex has a ring-shaped structure of 50nm in diameter, confirming published results, and the PorL-M inner membrane complex has an extended structure of 25nm with a spherical base. These results validate the established methodology that can subsequently be used to continue the structural study of T9SS.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Il agit notamment sur huit récepteurs métabotropiques (mGluR) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) responsables de la modulation de la transmission synaptique. Les mGluR constituent des cibles de choix pour le traitement de maladies neurologiques, psychiatriques et neurodégénératives comme la schizophrénie, la dépression, ou la maladie de Parkinson. Aucun médicament agissant sur les mGluR n'existe à l'heure actuelle, mais plusieurs molécules sont en phase clinique pour différentes pathologies. L'objectif principal de mon travail de thèse a été d'étudier la dynamique structurale des mGluR, pour lesquels le mécanisme moléculaire d'activation reste mal connu. Ces récepteurs forment des homodimères constitutifs, dont chaque sous-unité possède un grand domaine extracellulaire qui lie le glutamate et un domaine transmembranaire responsable de l'activation des protéines G et où se fixent des modulateurs allostériques synthétiques. Une des étapes clé de l'activation serait la réorientation relative des deux domaines extracellulaires induite par le glutamate au sein du dimère. En développant tout d'abord une stratégie de marquage orthogonale des sous-unités de mGlu par fusion avec des enzymes suicide (SNAP-/CLIP-tag) combinée à une technique de transfert d'énergie par résonance de type Förster en temps résolu (TR-FRET), nous avons montré qu'en système hétérologue, les mGluR peuvent s'associer sous forme d'hétérodimères fonctionnels. De plus, nos expériences ont révélé une spécificité d'association au sein de la famille des mGluR : les sous-unités mGlu du group I, mGlu1 et mGlu5, peuvent former des hétérodimères entre elles, mais pas avec celles du groupe II et III, qui elles peuvent toutes s'associer entre elles. Puis nous avons fait évoluer la technologie précédente pour développer le premier biosenseur conformationnel de l'activation des mGluR. Nous avons ainsi identifié sur cellules vivantes les changements conformationnels nécessaires à l'activation du récepteur, et démontré que la variation de signal de FRET entre les deux sous-unités au sein du dimère correspondant au réarrangement relatif des domaines externes est corrélée avec l'état d'activation du récepteur. Nous avons ainsi confirmé le modèle d'activation des mGluR initialement proposé à partir des premières structures cristallines des domaines extracellulaires isolés. D'autre part, ce senseur permet de discriminer facilement les agonistes partiels des agonistes complets, et permet de mieux comprendre les mécanismes allostériques régulant l'activité au sein des mGluR (notamment le mode d'action des modulateurs allostériques positifs et négatifs qui se lient dans le domaine membranaire). Cette stratégie de senseurs conformationnels a également pu être appliquée à l'étude d'autres récepteurs membranaires (RCPG et récepteurs tyrosines kinases), et au développement de tests de criblage à haut débit. Enfin, nous nous sommes attachés à développer de nouveaux types de molécules ciblant les mGluR, en utilisant des anticorps simple domaine provenant de lamas. Ces ligands qui agissent sur de nouveaux sites d'activation à la surface des mGluR, représentent de nouvelles pistes pour développer de meilleures solutions thérapeutiques. / Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in the central nervous system. It notably acts on eight metabotropic glutamate receptors (mGluR), which are G protein coupled receptor responsible for the modulation of synaptic transmission. mGluRs are promising pharmacological targets to treat neurological, psychiatric or neurodegenerative diseases such as depression, schizophrenia or Parkinson's disease. Unfortunately, so far, no drug acting at mGluR is accessible to patients, but several molecules are in clinical trials. The main objective of my thesis has been the study of the structural dynamics of mGluR, for which the molecular mechanism allowing activation are still poorly understood. These receptors are known to form constitutive dimers, with each subunit composed of a large extracellular domain which bind glutamate and a transmembrane domain responsible for G protein activation and where synthetic allosteric modulators bind. A key step in the activation process could be the relative reorientation of the two extracellular domains in the dimer upon glutamate binding. We first developed an orthogonal labeling method of each mGlu subunits by fusion with a suicide enzyme (SNAP-/CLIP-tag) that we combined with time-resolved Förster resonance energy transfer measurements to show that in a heterologous system, mGlu subunits can associate as strict and functional heterodimers. Our experiments also revealed a specific association pattern: mGlu subunits from group I, mGlu1 and mGlu5, can associate with each other, but not with those from group II and III, which can also associate with each other. Then we improved the technology to develop the first conformational sensor to monitor mGluR activation. We were able to monitor in real time in live cells the conformational changes occurring in the mGlu receptor upon activation, and we proved that the variation in FRET signal is correlated with the activation state of the receptor. This allowed us to confirm the activation model proposed based on the crystal structures of the isolated extracellular domains, which consist of a relative movement of the dimer extracellulair domains upon activation. Moreover, this sensor makes it possible to easily discriminate between full and partial agonists, and to better understand the allosteric mechanisms occurring in the mGluR (especially the action mode of positive and negative allosteric modulators binding in the transmembrane domain). This conformational sensor strategy was further applied to study the activation of other receptors (GPCR or tyrosine kinase receptors), and to develop screening assays compatible with high-throughput formats. Finally, we developed innovative ligands acting on mGluRs using single-domain antibodies from llamas. These activating ligands seem to bind to a new site on the surface of the receptor, offering new possibilities to develop better treatment acting at mGluRs.