Les cellules dendritiques (CD) jouent un rôle majeur dans l'initiation, la régulation et le maintien des réponses immunes contre les pathogènes. Le ciblage d'antigènes (Ag) liés à des anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre des récepteurs spécifiques de CD est une approche vaccinale prometteuse induisant une réponse immunitaire chez l'animal. Cependant, certaines protéines de fusion AcM-Ag ne peuvent pas être produites. J'ai donc développé des AcM fusionnés à un domaine dockérine et des Ag fusionnés à un domaine cohésine, permettant ainsi l'assemblage non-covalent de complexes AcM-Ag. Ainsi, des complexes non-covalents anti-CD40-Ag ou anti-Langerine-Ag du virus influenza ont induit l'expansion in vitro de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques, et la production d'anticorps chez la souris. De même, le ciblage de ces Ag via DCIR, récepteur exprimé sur différentes populations de CD humaines, ont induit l'expansion de lymphocytes T CD8+ mémoires in vitro. Enfin, j'ai montré que l'addition de peptides glycosylés flexibles facilite la production d'AcM anti-CD40 fusionnés à 5 peptides du VIH. Ces peptides conservés et immunogènes sont dérivés des protéines Gag, Nef et Pol. Ce prototype vaccinal, testé in vitro, sur des cellules de patients séropositifs, induit l'expansion d'un vaste répertoire de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques et multifonctionnels. Ces cellules T CD8+ cytotoxiques sont capables de supprimer la réplication du VIH in vitro. En conclusion, ce travail a permis de développer plusieurs prototypes de vaccins ciblant les CD et a démontré leur potentiel à induire des réponses immunes efficaces, justifiant leur application à visée préventive et thérapeutique. / Dendritic cells (DCs), as the most potent antigen-presenting cells, have a pivotal role in the initiation, regulation and maintenance of immune responses against cancers and pathogens. Targeting antigens (Ag) directly to DCs via anti-DC receptor monoclonal antibody-antigen (mAb-Ag) fusion proteins is a promising approach to vaccine development and has been shown to induce potent immunity in animal models. Thus, I developed mAbs fused to a dockerin domain and antigens fused to a cohesin domain, enabling non-covalent assembly of mAb-Ag complexes particularly when direct mAb-Ag fusions could not be produced. Delivery of influenza Ags to CD40 and Langerin via these non-covalent complexes, respectively expanded Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells in vitro and elicited Ag-specific antibody responses in mice. Similarly, targeting influenza Ags in vitro with such complexes to DCIR on various human DC subsets expanded Ag-specific memory CD8+ T cells. Finally, I found that flexible glycosylated peptide linkers enabled production of an anti-CD40 mAb fused to a string of 5 conserved T cell epitope- rich regions of HIV Gag, Nef and Pol. In vitro, this prototype vaccine expanded a broad repertoire of Ag- specific and multifunctional CD4+ and CD8+ T cells from HIV-infected patients. These cytotoxic expanded CD8+ T cells were effective in suppressing in vitro HIV replication. In conclusion, our work facilitated the development of prototype DC-targeting vaccines and demonstrated their potential to induce effective immune responses, supporting their use for preventive and therapeutic applications.

Les anticorps monoclonaux sont une classe de bio médicaments en plein essor. Leur production est largement étudiée afin d’obtenir des rendements de plus en plus élevés et de réduire les coûts. Cette thèse décrit le développement d’un procédé complet en continu, de la production d’anticorps recombinants par des cellules mammifères jusqu’à leur purification. L’objectif est de coupler la culture cellulaire en mode perfusion à la purification par chromatographie semi-continue. Le développement du procédé se fait en bioréacteur avec une lignée de cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO-DP12) transformée pour produire un anticorps anti-Interleukine 8 utilisée, comme modèle. Après adaptation, les cellules ont été cultivées en mode batch afin de connaitre le comportement de la lignée en environnement contrôlé. Ensuite, un procédé de perfusion de 2L de culture avec recyclage cellulaire a été mis en place. Le principal enjeu est de maintenir un état stationnaire avec une concentration cellulaire constante et déterminer le débit optimal d’alimentation spécifique par cellule (CSPR). Plusieurs méthodes ont été testées et comparées pour la détermination de ce CSPR optimal. Le procédé de culture en perfusion a ensuite été maintenu pendant 24 jours à des concentrations cellulaires de 10, 20 et 40 millions de cellules par mililitres. Les anticorps produit par différents modes de culture ont été caractérisés (batch, fed-batch et perfusion). Les N-glycosylations, les variants de charge ainsi que la thermo-stabilité des anticorps ont été étudiés. Les résultats montrent que les anticorps produits présentent des caractéristiques similaires quel que soit le mode de production.Pour la purification, une étude préliminaire a permis de caractériser le comportement du filtrat sur la résine chromatographique d’affinité MabSelect Sure LX en chromatographie classique. Un procédé semi-continu a été simulé grâce au logiciel BioSC® Predict puis testé et optimisé sur le chromatographe BioSC®. Il comprend la purification de l’anticorps mais aussi les étapes de nettoyages et de sanitisation. Un premier essai de couplage production/purification a pu être réalisé avec succès pendant 32h et a permis d’obtenir un niveau de pureté similaire à la chromatographie classique. La productivité a été augmentée de 23% (en grammes d’anticorps purifié par litre de résine et par jour) et le volume de tampon utilisé a été réduit de 25%. De plus, le couplage production/purification a permis de s’affranchir du stockage de volumes importants de filtrat (7,2L de filtrat par jour de production en perfusion). Enfin, une étude de coût de production, à l’échelle « laboratoire », a été réalisée afin de déterminer, en fonction de la productivité du clone et de la quantité d’anticorps à produire, la différence de rentabilité entre une production en batch ou en perfusion à différents CSPR. / Monoclonal antibodies are a biopharmaceuticals class of growing interest. Their production is widely studied to obtain higher yields and to reduce costs. This thesis describes the development of a complete continuous process, from the production of recombinant antibodies by mammalian cells until their purification. The objective is to connect cell culture in perfusion mode to a semi-continuous chromatographic purification. The development of the process was done in a bioreactor with a Chinese hamster ovary cell line (CHO-DP12) transformed to produce an anti-interleukin-8 antibody used as a cell model. After adaptation, the cells were cultured in batch mode in order to study the behavior of the cell line in controlled environment. Then, a 2L culture perfusion process with cell recycling was set up. The main challenge is to maintain a steady state with constant cell concentration and to determine the optimal cell-specific perfusion rate (CSPR). Several methods were tested and compared for the determination of this optimal CSPR. The perfusion process was maintained for 24 days at cell concentrations of 10, 20 and 40 million cells per mililiters. The antibody produced by different culture methods was compared (batch, fed-batch and perfusion). The N-glycosylations, the charge variants as well as the thermo-stability of the antibody were studied. The results show that the produced antibody have similar characteristics whatever the chosen production mode. For purification process, we performed a preliminary study to characterize the behavior of the supernatant on the chromatographic affinity resin MabSelect Sure LX. A semi-continuous process was simulated through BioSC® Predict software and then tested and optimized on the BioSC® chromatograph. It includes antibody purification but also cleaning and sanitizing steps. A first production/purification coupling test was successfully carried out for 32 h. It provides antibodies at a purity level similar to that of the conventional chromatography. Productivity was increased by 23% (in grams of purified antibody per liter of resin per day) and the volume of buffer used was reduced by 25%. In addition, production/purification coupling prevented storage of large volumes of supernatant (7,2L of supernatant per production day in perfusion mode). Finally, a cost-of-production study, at research scale, was carried out to determine, depending on the productivity of the clone and the antibodies amount, the difference of costs between batch or perfusion production according to different CSPRs.