Les approches thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux font partie des avenues les plus encourageantes pour le traitement de nombreux cancers. Les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) demeurent la plateforme d’expression d’anticorps la plus couramment utilisée dans l’industrie et est actuellement la plus efficace pour la production à grande échelle. Ces cellules sont capables de produire des anticorps présentant un patron de glycosylation très proche du profil humain et d’atteindre des niveaux de production généralement plus élevés que ceux obtenus avec les autres lignées cellulaires continues existantes. Ces dernières années, les progrès accomplis dans le développement de procédés en cuvée alimentée (fed-batch) ont permis d’augmenter significativement les rendements de production. Néanmoins, les performances des procédés de culture demeurent limitées par les caractéristiques métaboliques des cellules utilisées. Celles-ci présentent en effet une glycolyse et une glutaminolyse dérégulées associées à une forte production de métabolites toxiques tels que le lactate et les ions ammonium. Seule une fraction minime du pyruvate issu de la métabolisation du glucose est incorporée dans le cycle des acides tricarboxyliques (ATC), ce qui explique en partie le métabolisme peu efficace des cellules CHO. Une des enzymes responsables de la connexion entre la glycolyse et le cycle des ATC est la pyruvate carboxylase qui catalyse la conversion du pyruvate en oxaloacétate. Dans les cellules CHO, seulement 5 à 10 % du pyruvate est métabolisé par cette enzyme. Ce projet de recherche s’appuie sur l’hypothèse selon laquelle contrer la déficience de l’activité de la pyruvate carboxylase dans les cellules CHO pourrait pallier en partie au phénomène de dérégulation de la glycolyse, ce qui permettrait d’améliorer la productivité d’anticorps des cellules tout en maintenant une glycosylation adéquate du produit final. Au cours de ces travaux, une lignée cellulaire exprimant de façon stable l’enzyme pyruvate carboxylase de levure, au niveau cytosolique (PYC2) a été générée. Cultivées en mode cuvée alimentée, ces cellules ont montré une croissance et une production d’anticorps améliorées par rapport à la lignée parentale non modifiée. L’analyse des flux métaboliques par marquage isotopique a permis de caractériser en détail le métabolisme de ces cellules. Des différences majeures dans la distribution des flux métaboliques intracellulaires notamment au niveau des flux associés à la lactate déshydrogénase et au cycle de Krebs ont été mises en évidence. L’analyse de la glycosylation a révélé pour sa part, que l’augmentation de la production d’anticorps associée à la modification du métabolisme n’avait pas altéré significativement la qualité du produit final. De façon générale, ce projet de recherche semble corroborer l’existence d’un lien entre la productivité d’anticorps et le métabolisme cellulaire. La caractérisation du métabolisme des cellules CHO et plus précisément du métabolisme du lactate participe à améliorer notre compréhension du métabolisme des cellules CHO et pourrait permettre une amélioration plus rationnelle des fonctions cellulaires d’une part, et des conditions de culture d’autre part. / Antibody-based therapy is a promising approach for cancer treatment. Chinese hamster ovary (CHO) cells represents the most common and efficient antibody expression platform for large scale production. Their abilities to perform human-like glycosylation and produce high antibody titer make them the most suitable system compared to other continuous cell lines. In the past few years, advances in fed-batch process development led to significantly increase production yields. Nevertheless, the metabolic features of continuous cell lines constitute a hurdle to the improvement of process performances. Continuous cell lines typically exhibit a deregulated glycolysis and glutaminolysis causing the accumulation of toxic metabolites such as lactate and ammonia. Thus, only a small percentage of pyruvate, derived from glucose, is incorporated into the tricarboxylic acids (TCA) cycle explaining at least, in part the inefficient CHO cell metabolism. The mitochondrial pyruvate carboxylase, which catalyzes the conversion of pyruvate into oxaloacetate, is one of the key enzymes at the junction of the glycolysis and the TCA cycle. In CHO cells, only 5-10 % of the pyruvate pool is metabolized via this pathway. In this project, we hypothesized that counteracting the pyruvate carboxylase deficiency in CHO cells could alleviate in part, the deregulated glycolysis and consequently improve antibody production yield while maintaining satisfactory antibody glycosylation. In this work, a recombinant CHO cell line producing an antibody was further genetically modified with the insertion of a cytoplasmic yeast pyruvate carboxylase (PYC2) gene. Cultivated in fed-batch mode, PYC2 cells exhibited enhanced cell growth and antibody production yield compared to the parental cell line. Metabolic flux analysis using isotopic tracer led to a detailed characterisation of both cell line metabolism. The metabolic flux distribution obtained highlighted major differences in lactate and TCA fluxes. Comparative glycosylation analysis revealed that the metabolism alteration associated with the increase in antibody production did not significantly alter the product quality. This work seems to corroborate the presumed existence of a link between metabolism and antibody productivity. The cell metabolism characterization and more precisely, lactate production contribute to gain knowledge in CHO cell metabolism and led to rationally improve cellular functions and culture conditions.

Au cours de cette étude, nous avons approfondi nos connaissances concernant l’effet des conditions de culture sur la quantité et la qualité d’une protéine recombinante produite par des cellules CHO. En particulier, nous avons étudié l’influence de 3 composés (citrate de fer, pluronic F-68 et éthanolamine) présents dans le milieu BDM mais absent du milieu RPMI avec sérum (FCS-RPMI) sur la croissance des cellules CHO, la production de l’interféron-gamma humain recombinant (IFN-γ) ainsi que sa qualité. L’ajout de pluronic F-68 (0,1%) et de citrate de fer (500 µM) dans le milieu RPMI sans sérum a permis d’obtenir une croissance cellulaire comparable à celle obtenue avec le milieu FCS-RPMI. Par ailleurs, dans ces conditions de culture, la production de l’IFN-g est également augmentée. L’ajout de citrate de fer dans le milieu FCS-RPMI permet non seulement d’améliorer la croissance des cellules CHO mais également la production de l’IFN-γ. Avec le milieu FCS-RPMI, la macrohétérogénéité de la glycosylation de l’IFN-γ change au cours du procédé discontinu, cette dernière est maintenue constante uniquement lorsque du citrate de fer est ajouté à ce même milieu de culture. En outre, des activités gélatinase et caséinase appartenant aux familles des métalloprotéases et des protéases à sérine ont été mises en évidence au cours des cultures de cellules CHO. Quel que soit le milieu utilisé (RPMI, BDM avec ou sans sérum), l’ajout de citrate de fer permet de maîtriser et d’éviter la protéolyse de l’IFN-γ. Enfin, la relation entre le degré de glycosylation macroscopique de l’IFN- γ et son activité biologique (immunomodulatrice) in-vitro a été établie / In this study, we characterized the effect of culture conditions on the quantity and the quality of a recombinant protein, IFN-γ, produced by CHO cells. In particular, we studied the effect of 3 components (iron citrate, pluronic F-68 and ethanolamine) that are present in the BDM medium, but completely lacking in RPMI serum medium (FCS-RPMI) on CHO cell growth, as well as the production and quality of recombinant IFN-γ.The addition of Pluronic F-68 (0.1%) and iron citrate (500 µM) in RPMI without serum resulted in growth kinetic performances similar to those observed in FCS-RPMI. Furthermore, in these culture conditions, IFN- γ production was improved. Addition of iron citrate in FCS-RPMI improved cell growth, as well as IFN-γ production. Whereas the glycosylation pattern of recombinant IFN-γ produced by CHO cells was not constant when the culture was performed in FCS-RPMI, the glycosylation pattern of IFN-γ remained constant when iron citrate was added in the medium. In addition, gelatinase and caseinase enzymatic activities in CHO batch cultures were detected, due most likely to enzymes of the metalloproteases and serine protease families. Despite the type of medium used (RPMI, BDM with or without serum), addition of iron citrate minimized IFN-g proteolysis. Finally, the relationship between the macroglycosylation pattern of IFN-g and its in-vitro biological (immunomodulatory) activity was demonstrated

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Les anticorps monoclonaux sont une classe de bio médicaments en plein essor. Leur production est largement étudiée afin d’obtenir des rendements de plus en plus élevés et de réduire les coûts. Cette thèse décrit le développement d’un procédé complet en continu, de la production d’anticorps recombinants par des cellules mammifères jusqu’à leur purification. L’objectif est de coupler la culture cellulaire en mode perfusion à la purification par chromatographie semi-continue. Le développement du procédé se fait en bioréacteur avec une lignée de cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO-DP12) transformée pour produire un anticorps anti-Interleukine 8 utilisée, comme modèle. Après adaptation, les cellules ont été cultivées en mode batch afin de connaitre le comportement de la lignée en environnement contrôlé. Ensuite, un procédé de perfusion de 2L de culture avec recyclage cellulaire a été mis en place. Le principal enjeu est de maintenir un état stationnaire avec une concentration cellulaire constante et déterminer le débit optimal d’alimentation spécifique par cellule (CSPR). Plusieurs méthodes ont été testées et comparées pour la détermination de ce CSPR optimal. Le procédé de culture en perfusion a ensuite été maintenu pendant 24 jours à des concentrations cellulaires de 10, 20 et 40 millions de cellules par mililitres. Les anticorps produit par différents modes de culture ont été caractérisés (batch, fed-batch et perfusion). Les N-glycosylations, les variants de charge ainsi que la thermo-stabilité des anticorps ont été étudiés. Les résultats montrent que les anticorps produits présentent des caractéristiques similaires quel que soit le mode de production.Pour la purification, une étude préliminaire a permis de caractériser le comportement du filtrat sur la résine chromatographique d’affinité MabSelect Sure LX en chromatographie classique. Un procédé semi-continu a été simulé grâce au logiciel BioSC® Predict puis testé et optimisé sur le chromatographe BioSC®. Il comprend la purification de l’anticorps mais aussi les étapes de nettoyages et de sanitisation. Un premier essai de couplage production/purification a pu être réalisé avec succès pendant 32h et a permis d’obtenir un niveau de pureté similaire à la chromatographie classique. La productivité a été augmentée de 23% (en grammes d’anticorps purifié par litre de résine et par jour) et le volume de tampon utilisé a été réduit de 25%. De plus, le couplage production/purification a permis de s’affranchir du stockage de volumes importants de filtrat (7,2L de filtrat par jour de production en perfusion). Enfin, une étude de coût de production, à l’échelle « laboratoire », a été réalisée afin de déterminer, en fonction de la productivité du clone et de la quantité d’anticorps à produire, la différence de rentabilité entre une production en batch ou en perfusion à différents CSPR. / Monoclonal antibodies are a biopharmaceuticals class of growing interest. Their production is widely studied to obtain higher yields and to reduce costs. This thesis describes the development of a complete continuous process, from the production of recombinant antibodies by mammalian cells until their purification. The objective is to connect cell culture in perfusion mode to a semi-continuous chromatographic purification. The development of the process was done in a bioreactor with a Chinese hamster ovary cell line (CHO-DP12) transformed to produce an anti-interleukin-8 antibody used as a cell model. After adaptation, the cells were cultured in batch mode in order to study the behavior of the cell line in controlled environment. Then, a 2L culture perfusion process with cell recycling was set up. The main challenge is to maintain a steady state with constant cell concentration and to determine the optimal cell-specific perfusion rate (CSPR). Several methods were tested and compared for the determination of this optimal CSPR. The perfusion process was maintained for 24 days at cell concentrations of 10, 20 and 40 million cells per mililiters. The antibody produced by different culture methods was compared (batch, fed-batch and perfusion). The N-glycosylations, the charge variants as well as the thermo-stability of the antibody were studied. The results show that the produced antibody have similar characteristics whatever the chosen production mode. For purification process, we performed a preliminary study to characterize the behavior of the supernatant on the chromatographic affinity resin MabSelect Sure LX. A semi-continuous process was simulated through BioSC® Predict software and then tested and optimized on the BioSC® chromatograph. It includes antibody purification but also cleaning and sanitizing steps. A first production/purification coupling test was successfully carried out for 32 h. It provides antibodies at a purity level similar to that of the conventional chromatography. Productivity was increased by 23% (in grams of purified antibody per liter of resin per day) and the volume of buffer used was reduced by 25%. In addition, production/purification coupling prevented storage of large volumes of supernatant (7,2L of supernatant per production day in perfusion mode). Finally, a cost-of-production study, at research scale, was carried out to determine, depending on the productivity of the clone and the antibodies amount, the difference of costs between batch or perfusion production according to different CSPRs.

Des hormones gonadotropiques sont utilisées pour la maîtrise de la reproduction dans le domaine vétérinaire. Ces hormones sont actuellement extraites de tissus ou de fluides animaux. L’entreprise CEVA Santé Animale a récemment fait le choix stratégique de produire ces hormones par voie recombinante. L’objectif de cette étude était d’obtenir une gonadotropine chorionique équine recombinante, reCG, pure et biologiquement active, à partir d’une lignée de cellules mammifères CHO. Les étapes de production, de purification et de caractérisation de l’hormone recombinante ont été développées. Les cellules CHO ont été cultivées en fiole d’Erlenmeyer dans différents milieux de culture. Le suivi de la croissance cellulaire et de la quantité d’hormone produite a permis de sélectionner deux milieux. Le procédé de production, avec ces deux milieux, a été optimisé en bioréacteur en contrôlant les paramètres de culture (température, pH). Les protéines produites dans le surnageant, de ces deux cultures, ont été nommées reCG 1 et reCG 2. Un procédé de purification en 3 étapes a été mis au point pour la reCG 1. Plusieurs résines et conditions chromatographiques ont été criblées en microplaques. Les résines multimodales utilisées ont permis d’éliminer des contaminants majeurs grâce à leur sélectivité. Les agrégats de la reCG ont été éliminés grâce à une résine anionique. Le procédé de purification global a été validé pour la reCG 1 et la reCG 2. Il a permis d’obtenir une pureté de 98 % avec un rendement de 80 %. L’activité biologique de la reCG 1 et la reCG 2, in vitro et in vivo, est comparable à celle de la protéine naturelle. L’activité biologique in vivo des reCG est cohérente avec l’étude réalisée sur les glycosylations des hormones et notamment avec leur degré de sialylation. / The gonadotrophic hormones are used for reproduction control in farming animals. Up to now, these hormones were extracted from animal fluids or tissues. The company CEVA Santé Animal has recently decided to produce recombinant versions of these hormones. The objective of this study was to obtain a pure and biologically active recombinant equine chorionic gonadotropin (reCG) after expression in CHO mammalian cells. The production, purification and characterization steps have been developed. CHO cells were grown in Erlenmeyer flasks with different culture media. Two media were selected based on their cell growth potency and of the amount of reCG produced. By using a bioreactor to control key parameters (temperature, pH), the production process was then optimized. The recombinant proteins that accumulated in the supernatant of the two conditions were called reCG 1 and reCG 2. A 3-steps purification process was then developed using reCG 1. Several resins and chromatographic conditions were screened in microplates. Multimodal resins were used to eliminate the main contaminants thanks to their selectivity. reCG aggregates were efficiently eliminated by a chromatographic step with an anionic resin. The overall purification process was finally validated for reCG 1 and reCG 2. Purity and yield were respectively, 98 % and 80 % for the two reCG. We verified that the in vitro and in vivo activities of reCG 1 and reCG 2 were comparable to those of the CG extracted from natural sources. The in vivo assays also confirmed previous studies showing that the degree of glycosylation of an hormone, and most notably their level of sialytation, is important for their biological activity.

Ce travail consiste à utiliser deux systèmes microfluidiques de gouttes pour incorporer d'une part des acides nucléiques dans des liposomes cationiques et d'autre part étudier la dynamique de transfection dans des cellules mammifères. La première micropuce permet d'insérer de l'ADN dans des liposomes cationiques afin d'obtenir de manière reproductible des lipoplexes appropriés à la transfection de cellules dendritiques (DC). Plusieurs paramètres expérimentaux sont tout d'abord étudiés, tels que les débits d'entrée, l’entretien des propriétés des liposomes après leur traitement dans des micro-gouttes, les caractéristiques des lipoplexes (taille, polydispersité et charge) en fonction du rapport molaire de charge (R+/-) et de la géométrie de la puce. Ensuite, les lipoplexes produits dans des conditions optimisées: une micropuce avec un grand canal en serpentin et une région de division des gouttes qui diminuent la polydispersité des lipoplexes, fonctionnant à un rapport de débit eau/huile 0,25 et R+/- 1,5; 3; 5; 7 et 10; sont utilisés pour transfecter des DCs in vitro. Tous les lipoplexes transfectent les DCs, tout en offrant une activation des DCs. La seconde étape consiste à utiliser une micropuce à l'échelle de la cellule unique afin de contrôler les conditions de transfection et d'optimiser le rendement de production de protéines recombinantes. Ainsi, des cellules ovariennes de hamster Chinois (CHO-S) sont transfectées dans la micropuce avec différents types de lipoplexes (R+/- 1,5; 3; 5) dont la dynamique de transfection est suivie par la production de protéines vertes fluorescentes (GFP) et par la viabilité cellulaire. Cette micropuce a permis d'évaluer l’hétérogénéité des cellules transfectées, révélant la présence d'une sous-population produisant des niveaux particulièrement élevés de GFP. Ces hautes productrices (HP) ont une taille cellulaire plus importante que celle de la population moyenne. La charge des lipoplexes montre un rôle important pour transfecter CHO-S, puisque l’unique lipoplex chargé positif R+/- 5 produit plus de HPs. La quantité d’ADN délivrée influe sur la production de protéine, puisque R+/- 1,5 avec plus d’ADN augmente la productivité spécifique de GFP des HPs. Cette thèse est réalisée dans le cadre d'un programme de co-tutelle entre l'Université de Campinas, au Brésil, et l'École Polytechnique, en France. Ce travail a principalement contribué aux domaines de microfluidique et de délivrance de gènes. / This work aims to use one droplet-based microfluidic systems to incorporate nucleic acids into cationic liposomes and another one to study the mammalian cell transfection process. For this, the first step uses a droplet-based microfluidic system to complex cationic liposomes with pDNA in order to obtain reproducible and suitable lipoplexes to dendritic cells (DCs) transfection. For this purpose, some experimental parameters are investigated, such as inlet flow rates, the maintenance of liposomes’ properties after microfluidic processing, lipoplex characteristics (size, polydispersity and zeta potential) as function of molar charge ratio (R+/-) and microchip design. Then, lipoplexes produced in selected conditions: a microchip with large serpentine channel and split region, which decreases lipoplex polydispersity, operating at ratio aqueous/oil flow rate 0.25 and R+/- 1.5, 3, 5, 7 and 10; are used to transfect DCs in vitro. All lipoplexes transfect DCs while providing cells activation. The second step uses a single-cell microfluidic platform to investigate and control over the transfection conditions, in view of optimizing the recombinant protein production by transfected cells. In this context, Chinese hamster ovary cells (CHO-S) are transfected in microchip with different types of lipoplexes (R+/- 1.5, 3, 5) and monitored by green fluorescent protein (GFP) production and cell viability. The single-cell platform enables to assess the heterogeneities of CHO-S population, revealing the presence of a subpopulation producing significantly high levels of GFP. These high producers (HP) show increased cell size in comparison to the average population. Moreover, the charge of lipoplexes shows an important role to transfect CHO-S, since the unique positive charged lipoplex R+/- 5 produces more HPs. Additionally, the amount of pDNA delivered affects the protein production, since R+/- 1.5 with more pDNA increase GFP specific productivity of HPs. This thesis is a co-supervised program between University of Campinas, Brazil and École Polytechnique, France. In general, this work contributes to microfluidics and gene delivery areas.

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293. / With the aim to express a protein of interest, the transfer of exogenous genetic material into host cells was established in early 70s with the development of genetic engineering. Approximately ten years later, insulin was the first human recombinant protein (r-protein) produced at large scale in Escherichia coli and commercialized. Challenges associated with the production of more complex and glycosylated r-proteins brought the pharmaceutical industry to develop mammalian expression platforms. Thus, the expressed r-proteins are correctly folded and biologically actives. As a means to transfer genetic materials of interest into mammalian cells, the synthetic vector polyethylenimine (PEI) is probably the most popular due to its efficacy, ease of use, cost-effectiveness and stability in solution. Consequently, PEI is largely employed for the production of r-proteins by large scale and extensively studied in the context of non-viral gene therapy. PEI is capable to efficiently condense plasmid DNA (expression vector containing the gene of interest) to form small nanoparticles termed polyplexes. The latter must circumvent several steps to deliver the gene of interest to the cell nucleus. When formed at the optimum conditions, polyplexes exhibit a net positive charge which can interact electrostatically with negatively charged heparan sulfate proteoglycans (HSPG) located at the cell surface. There are two major families of HSPG that are largely expressed at the surface of mammalian cells: the syndecans (4 members, SDC1-4) and the glypicans (6 members, GPC1-6). Although it is generally accepted that HSPG are involved in the binding of polyplexes, their individual role toward polyplex binding and the subsequent phases of gene transfer need to be confirmed. Following optimization of the mammalian CHO and HEK293 cells transfection conditions, we undertook an in-depth study of polyplexes uptake, internalization kinetics, as well as transgene expression kinetics with the aim to better understand the mechanisms underlying gene transfer. We observed several contrasting differences between the two cell lines and the type of PEI used. Our results presented as a scientific article, establish strong basis of the gene transfer process over-time. Every cell type possesses its own expression profile of HSPG which can display individual potency toward gene transfer. Indeed, a preliminary study conducted in our laboratory showed that SDC1 and SDC2 have distinct features with regard to gene transfer. While both are capable to bind polyplexes at the cell surface, the expression of SDC1 enhances polyplexes internalization whereas the expression of SDC2 drastically inhibits it. Furthermore, when SDC1 is expressed at the surface of HEK293 cells, the transfection efficiency is increased by twelve percent compared to control cells. By using the ability of SDC1 to mediate efficient internalization of polyplexes, we have studied the intracellular traffic of SDC1 / polyplexes complexes. Our conclusions lead to new insights concerning the path by which polyplexes can mediate efficient transfection. In the context of gene transfer, HSPG have been essentially studied in their entirety. Although the role of syndecans is the subject of some studies, that of glypicans is unexplored. Thanks to a series of chemical and enzymatic treatments leading to « loss of functions », the importance of sulfation as post-translational modification, the effect of HS chains and of glypicans on the attachment, internalization of polyplexes as well as transgene expression were investigated in CHO and HEK293 cells. Taken together, our observations indicate clearly that the role of HSPG should be investigated individually instead of collectively. Consequently, the individual potency of each HSPG member regarding gene transfer remains to be defined. We demonstrated that, in fact, the transient expression of some HSPG in CHO cells have a beneficial effect on polyplexes uptake while others have a negative effect. Unfortunately, this method did not allow concluding about their effect on transfection efficacy. However, when present in the culture medium, the extracellular domain of HSPG decreases transfection efficacy of CHO cells without inducing polyplexes dissociation. Strangely, when each HSPG is stably expressed in CHO cells, only subtle modulations of the gene expression level were observed. This study contributed to a better understanding of the mechanisms underlying PEI mediated gene transfer in CHO and HEK293 cells and clarify the role of HSPG in gene transfer.

Les petits ARN interférents (siRNA) sont encore rarement utilisés chez les vertébrés transgéniques pour inhiber l'expression de gènes. En effet, les vecteurs contenant un promoteur de type ARN polymérase III comme ceux des gènes U6 et H1 qui permettent une expression élevée des gènes codant pour des ARNi dans des cellules sont souvent silencieux in vivo. Dans cette thèse, divers vecteurs exprimant des petits ARN double brins (shRNA) ont été testés dans des cellules en culture et chez des souris transgéniques pour inhiber l'ARN m du gène précoce IE du virus de la pseudo rage porcine responsable de la maladie d'Aujeszky. La quantité et la séquence des si RNA produits ont été étudiées par qPCR. Dans des cellules CHO transfectées pour une expression transitoire, les vecteurs contenant les gènes U6-shRNA ont été de loin les plus efficaces pour inhiber le gène IE en raison du niveau élevé de siRNA produit. Par ailleurs, deux constructions contenant le promoteur de type ARN polymérase II, le promoteur du gène eF1-α etune séquence de shRNA bordée par 5T ou introduite dans un gène de microARN (miRNA) le miR30 ont permis d'obtenir une inhibition significative mais limitée de l'ARNm du gène IE. Ceci parait être du au niveau relativement faible de siRNA produit. Le siRNA produit par le gène du miRNA s'est avéré aussi efficace que ceux obtenus à partir des constructions U6-shRNA bien que ces derniers soient un peu plus longs. Ces diverses constructions ont été utilisées pour obtenir des souris transgéniques. Des souris contenant la séquence du shRNA n'ont pu être obtenues qu'à partir de la construction miRNA. Ceci peut être du au fait que les siRNA produits par les autres constructions ont exercé un effet inhibiteur sur des cibles aspécifiques (off-targeting) qui ne s'est pas produit avec le siRNA provenant de la construction miRNA car il contient quelques nucléotides en moins. Les souris transgéniques contenant la construction miRNA ont été soumises à une infection par le virus de la pseudo rage porcine. Bien que les souris exprimaient le gène shRNA qu'à un faible niveau. Quelques souris transgéniques ont résisté à l'infection. La seconde partie de la thèse a consisté à sélectionner d'autres séquences de shRNA capables d'inhiber l'expression du gène IE sans exercer des effets aspécifiques. Deux séquences de shRNA ont permis une telle inhibition. L'une est dirigée contre la région 5'UTR du gène IE et l'autre contre la région 3'UTR. Ces données suggèrent que (1) l'efficacité d'un shRNA n'est pas déterminée par sa séquence d'une manière totalement prévisible (2) l'efficacité d'un siRNA est d'autant plus élevé que sa séquence cible dans l'ARNm est en structure double brin (3) un effet inhibiteur intense et optimum peut être obtenu avec des concentrations faibles d'un siRNA (4) les effets secondaires et en particulier le off-targeting peuvent avoir lieu à faible concentration du siRNA mais ils ont d'autant plus de chance de se produire que la concentration du si RNA est plus élevée (5) un siRNA destiné à être utilisé chez des animaux transgéniques devrait être choisi pour sa capacité à inhiber efficacement un gène à faible concentration pour réduire ses effets secondaires.